Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego
15 lutego 2021
Ten protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych PM2.5 w wypreparowanych sercach zarodków danio pręgowanego.
Metoda ta może być wykorzystana do dokładnego i łatwego wykrywania ekspresji docelowych białek w sercu danio pręgowanego. Zmiany w białku docelowym są bezpośrednio wykrywane przez pomiar immunofluorescencji. Przeprowadzić pobieranie i leczenie zarodków danio pręgowanego, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.
Po 72 godzinach od zapłodnienia przenieś zarodki na szkiełka podstawowe i obserwuj je pod mikroskopem stereoskopowym. Rejestruj wady rozwojowe serca, takie jak obrzęk osierdzia, zmienione pętle i zmniejszony rozmiar. Oblicz wskaźniki wad rozwojowych i przeanalizuj różnice między grupami za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA, a następnie tureckiego testu wielokrotnych porównań.
Po znieczuleniu zarodków 0,6 miligrama na mililitr MS222, rejestruj bicie serca przez 30 sekund i określ ilościowo tętno za pomocą oprogramowania Image J. Ostrożnie wypreparuj serca z zarodków zebry za pomocą jednorazowej igły strzykawkowej pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg na czystym szkiełku.
Dodaj 50 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do 1,25 mikrolitra PBS, aby uzyskać roztwór utrwalający, a następnie umieść trzy wycięte serca w jednym hydrofobowym okręgu barierowym i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować roztwór pod mikroskopem i suszyć próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć minut. Umyj szkiełka trzy razy w PBST przez pięć minut na pranie.
Dodaj 50 mikrolitrów BSA do 1 000 mikrolitrów PBST, aby uzyskać 5% roztwór BSA, i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez godzinę, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez pięć minut na przemycie. Rozcieńczyć dwa mikrolitry mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko 8-hydroksydeoksyguanozynie i dwa mikrolitry króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko gamma-H2AX w 296 mikrolitrach PBST, aby uzyskać działający pierwszorzędowy roztwór koktajlu przeciwciał.
Próbki serca inkubować z 50 mikrolitrami pierwszorzędowego roztworu koktajlu przeciwciał w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez pięć minut na przemycie. Rozcieńczyć jeden mikrolitr koziego przeciwciała wtórnego przeciwko myszom znakowanego FITC i jeden mikrolitr koziego przeciwciała wtórnego przeciwko królikowi psy-3 w 500 mikrolitrach PBST, aby uzyskać działający roztwór koktajlu przeciwciał drugorzędowych.
Próbki należy inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez pięć minut na przemycie. Dodaj 20 mikrolitrów DAPI do próbek w celu barwienia jądrowego i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Nałóż szkiełko nakrywkowe na szkiełko i uszczelnij je lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i przemieszczaniu się. Zobrazuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym i określ ilościowo sygnał fluorescencyjny obszaru serca za pomocą oprogramowania ImageJ. Oblicz względne zmiany przy użyciu średniej z prób kontrolnych DMSO i określ istotność statystyczną danych.
Zarodki narażone na PM 2,5 przy braku lub obecności przeciwutleniacza, N-acetylo-L-cysteiny lub NAC, oceniano pod kątem obecności wad rozwojowych serca. EOM z PM 2,5 kosztowało znaczny wzrost teratogenezy serca, takiego jak obrzęk osierdzia, zmieniona pętla i zmniejszony rozmiar, w porównaniu z sercami leczonymi DMSO. Częstość akcji serca była również znacznie zmniejszona u zarodków narażonych na EOM.
Dodanie NAC osłabiało wady serca wywołane przez EOM. Test immunofluorescencyjny zastosowano w celu oceny stopnia uszkodzenia DNA w tkankach poddanych działaniu EOM. Poziomy ekspresji 8-hydroksydeoksyguanozyny i gamma-H2AX były znacznie zwiększone w sercach zarodków danio pręgowanego leczonych EOM, co wskazuje odpowiednio na wzrost oksydacyjnych uszkodzeń DNA i pęknięć podwójnej nici DNA.
Uszkodzenia DNA wywołane przez EOM zostały częściowo zniwelowane przez suplementację NAC. Podczas korzystania z tego protokołu należy zachować ostrożność podczas mycia próbek PBS, ponieważ serce danio pręgowanego może odkleić się od szkiełka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM 2.5 w sekcji serc zarodków danio pręgowanego. Metoda ta pozwala na dokładne wykrywanie ekspresji białek docelowych w sercach danio pręgowanego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Toksykologia
Tło
- Immunofluorescencja jest potężną techniką do wizualizacji ekspresji białek.
- Zarodki danio pręgowanego są cennym modelem do badania procesów rozwojowych.
- Znane jest, że ekspozycja na PM 2.5 powoduje różne problemy zdrowotne, w tym uszkodzenia DNA.
- Zrozumienie wpływu toksyn środowiskowych na rozwój jest kluczowe dla zdrowia publicznego.
Cel badania
- Ocenienie wpływu PM 2.5 na integralność DNA w sercach danio pręgowanego.
- Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania zmian w ekspresji białek.
- Ustanowienie niezawodnej metody oceny wadow serca w zarodkach danio pręgowanego.
Zastosowane metody
- Zbieranie i leczenie zarodków danio pręgowanego.
- Test immunofluorescencyjny do wykrywania białek docelowych.
- Obserwacja zarodków pod mikroskopem stereoskopowym w 72 godziny po zapłodnieniu.
- Analiza statystyczna z wykorzystaniem jednoczynnikowej ANOVA oraz testu wielokrotnego porównania Turkey'ego.
Główne wyniki
- Wykrycie uszkodzeń DNA w sercach danio pręgowanego z powodu ekspozycji na PM 2.5.
- Identyfikacja wad serca takich jak obrzęk osierdzia i zmienione pętlenie.
- Ilościowa ocena częstości występowania wad w różnych grupach leczniczych.
- Statystyczne znaczenie wyników potwierdzone poprzez analizę.
Wnioski
- Ekspozycja na PM 2.5 prowadzi do znaczących uszkodzeń DNA w sercach danio pręgowanego.
- Test immunofluorescencyjny jest skuteczny w badaniu zmian w ekspresji białek.
- Ten model może być wykorzystany do dalszych badań nad toksynami środowiskowymi i biologią rozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This immunofluorescence protocol enables mechanistic de-risking of environmental toxicants by quantifying DNA damage biomarkers in zebrafish embryo hearts, a predictive model for developmental cardiotoxicity. The assay supports target validation and phenotypic screening workflows by linking PM2.5 exposure to oxidative stress and DNA double-strand break pathways. It provides translational biomarker data for risk assessment in early discovery, aiding portfolio triage of chemical libraries.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by detecting 8-OHdG and γH2AX as mechanistic readouts of oxidative DNA damage and double-strand breaks.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative immunofluorescence readouts that clarify pathway activation in cardiac tissue.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating PM2.5-induced biomarker changes with heart malformation phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated zebrafish heart tissue for downstream screening of genotoxic compounds using immunofluorescence-based protein expression detection.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs via ImageJ analysis of fluorescent signals in dissected hearts.
- Scalability Value: Enables platform reuse for assessing environmental chemical-induced protein expression changes in a disease-relevant system.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance by detecting DNA damage in zebrafish embryo hearts, a model with conserved cardiac developmental pathways.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by providing mechanistic insight into PM2.5-induced cardiotoxicity.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying DNA damage attenuation via antioxidant co-treatment (e.g., NAC).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing mechanistic readouts that support predictive confidence in early-stage screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying DNA damage biomarkers in response to environmental toxicant exposure.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through standardized immunofluorescence staining and ImageJ-based fluorescence quantification in zebrafish hearts.
- Analytics: Generates statistical outputs (e.g., relative fluorescence changes, ANOVA-derived significance) that enable cross-condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using a zebrafish model with developmental pathways relevant to human cardiotoxicity assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening diverse chemical libraries for genotoxic potential in a vertebrate heart model.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through mechanistic de-risking of DNA damage pathways in developmental toxicity screening.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via fixed dissection, staining, and imaging protocols using hydrophobic barriers and fluorescence microscopy.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking biomarker changes to phenotypic outcomes, reducing late-stage biological risk in toxicology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on DNA damage potential in a developing heart model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, heart dissection, and immunofluorescence techniques.
- Dependent on fluorescence microscopy and ImageJ software for signal quantification and statistical analysis.
- Necessitates cross-team standardization of dissection timing, antibody incubation, and washing procedures to prevent tissue loss.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to other zebrafish tissues or disease models.
- Includes practical limitations such as heart tissue detachment during washing, requiring careful PBS handling as noted in the source material.
