Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego
15 lutego 2021
Ten protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych PM2.5 w wypreparowanych sercach zarodków danio pręgowanego.
Metoda ta może być wykorzystana do dokładnego i łatwego wykrywania ekspresji docelowych białek w sercu danio pręgowanego. Zmiany w białku docelowym są bezpośrednio wykrywane przez pomiar immunofluorescencji. Przeprowadzić pobieranie i leczenie zarodków danio pręgowanego, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.
Po 72 godzinach od zapłodnienia przenieś zarodki na szkiełka podstawowe i obserwuj je pod mikroskopem stereoskopowym. Rejestruj wady rozwojowe serca, takie jak obrzęk osierdzia, zmienione pętle i zmniejszony rozmiar. Oblicz wskaźniki wad rozwojowych i przeanalizuj różnice między grupami za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA, a następnie tureckiego testu wielokrotnych porównań.
Po znieczuleniu zarodków 0,6 miligrama na mililitr MS222, rejestruj bicie serca przez 30 sekund i określ ilościowo tętno za pomocą oprogramowania Image J. Ostrożnie wypreparuj serca z zarodków zebry za pomocą jednorazowej igły strzykawkowej pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg na czystym szkiełku.
Dodaj 50 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do 1,25 mikrolitra PBS, aby uzyskać roztwór utrwalający, a następnie umieść trzy wycięte serca w jednym hydrofobowym okręgu barierowym i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować roztwór pod mikroskopem i suszyć próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć minut. Umyj szkiełka trzy razy w PBST przez pięć minut na pranie.
Dodaj 50 mikrolitrów BSA do 1 000 mikrolitrów PBST, aby uzyskać 5% roztwór BSA, i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez godzinę, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez pięć minut na przemycie. Rozcieńczyć dwa mikrolitry mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko 8-hydroksydeoksyguanozynie i dwa mikrolitry króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko gamma-H2AX w 296 mikrolitrach PBST, aby uzyskać działający pierwszorzędowy roztwór koktajlu przeciwciał.
Próbki serca inkubować z 50 mikrolitrami pierwszorzędowego roztworu koktajlu przeciwciał w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez pięć minut na przemycie. Rozcieńczyć jeden mikrolitr koziego przeciwciała wtórnego przeciwko myszom znakowanego FITC i jeden mikrolitr koziego przeciwciała wtórnego przeciwko królikowi psy-3 w 500 mikrolitrach PBST, aby uzyskać działający roztwór koktajlu przeciwciał drugorzędowych.
Próbki należy inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez pięć minut na przemycie. Dodaj 20 mikrolitrów DAPI do próbek w celu barwienia jądrowego i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Nałóż szkiełko nakrywkowe na szkiełko i uszczelnij je lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i przemieszczaniu się. Zobrazuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym i określ ilościowo sygnał fluorescencyjny obszaru serca za pomocą oprogramowania ImageJ. Oblicz względne zmiany przy użyciu średniej z prób kontrolnych DMSO i określ istotność statystyczną danych.
Zarodki narażone na PM 2,5 przy braku lub obecności przeciwutleniacza, N-acetylo-L-cysteiny lub NAC, oceniano pod kątem obecności wad rozwojowych serca. EOM z PM 2,5 kosztowało znaczny wzrost teratogenezy serca, takiego jak obrzęk osierdzia, zmieniona pętla i zmniejszony rozmiar, w porównaniu z sercami leczonymi DMSO. Częstość akcji serca była również znacznie zmniejszona u zarodków narażonych na EOM.
Dodanie NAC osłabiało wady serca wywołane przez EOM. Test immunofluorescencyjny zastosowano w celu oceny stopnia uszkodzenia DNA w tkankach poddanych działaniu EOM. Poziomy ekspresji 8-hydroksydeoksyguanozyny i gamma-H2AX były znacznie zwiększone w sercach zarodków danio pręgowanego leczonych EOM, co wskazuje odpowiednio na wzrost oksydacyjnych uszkodzeń DNA i pęknięć podwójnej nici DNA.
Uszkodzenia DNA wywołane przez EOM zostały częściowo zniwelowane przez suplementację NAC. Podczas korzystania z tego protokołu należy zachować ostrożność podczas mycia próbek PBS, ponieważ serce danio pręgowanego może odkleić się od szkiełka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA indukowanych przez PM 2.5 w wypreparowanych sercach zarodków zebrafish. Metoda ta pozwala na dokładną detekcję ekspresji białka docelowego w sercu zebrafish.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia rozwojowa
- toksykologia
Wstęp
- Immunofluorescencja jest potężną techniką wizualizacji ekspresji białek.
- Zarodki rybek zebrafish stanowią cenny model do badania procesów rozwojowych.
- Wiadomo, że ekspozycja na PM 2.5 powoduje różne problemy zdrowotne, w tym uszkodzenia DNA.
- Zrozumienie wpływu toksyn środowiskowych na rozwój jest kluczowe dla zdrowia publicznego.
Cel badania
- Ocena wpływu PM 2,5 na integralność DNA w sercach rybek danio przeżwroczystych.
- Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania zmian w ekspresji białek.
- Opracowanie wiarygodnej metody oceny malformacji serca w embrionach rybek danio przeżwroczystych.
Zastosowane metody
- Zbieranie i hodowla embrionów rybek danio (zebrafish).
- Analiza immunofluorescencyjna w celu wykrycia białek docelowych.
- Obserwacja embrionów pod mikroskopem stereoskopowym 72 godziny po zapłodnieniu.
- Analiza statystyczna z wykorzystaniem jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) oraz testu wielokrotnych porównań Tukeya.
Główne wyniki
- Wykrycie uszkodzeń DNA w sercach danio pręgowanego spowodowanych ekspozycją na PM 2,5.
- Identyfikacja wad rozwojowych serca, takich jak obrzęk osierdzia i zaburzenia pętlowania.
- Ilościowe określenie częstotliwości występowania wad w różnych grupach badawczych.
- Potwierdzenie istotności statystycznej wyników za pomocą analizy.
Wnioski
- Ekspozycja na PM 2.5 prowadzi do znaczących uszkodzeń DNA w sercach danio przebrzuchłego.
- Analiza immunofluorescencyjna jest skuteczną metodą badania zmian w ekspresji białek.
- Model ten może być wykorzystany w dalszych badaniach nad toksynami środowiskowymi i biologią rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół immunofluorescencji umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka toksykantów środowiskowych poprzez ilościowe określanie biomarkerów uszkodzeń DNA w sercach embrionów ryb zebrafish, które stanowią model predykcyjny dla kardiotoksyczności rozwojowej. Analiza ta wspiera procesy walidacji celów oraz przepływy pracy w przesiewaniu fenotypowym, wiążąc ekspozycję na PM2.5 ze stresem oksydacyjnym i szlakami pęknięć dwuniciowych DNA. Dostarcza ona translacyjnych danych biomarkerowych do oceny ryzyka we wczesnej fazie odkrywania, pomagając w selekcji bibliotek związków chemicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez wykrywanie 8-OHdG i γH2AX jako odczytów mechanistycznych dla utleniania DNA i pęknięć dwuniciowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki ilościowym odczytom immunofluorescencyjnym, które wyjaśniają aktywację szlaków w tkance serca.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez korelację zmian biomarkerów indukowanych przez PM2.5 z fenotypami wad rozwojowych serca.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanej tkanki serca rybka zebrawka do dalszego przesiewania związków genotoksycznych z wykorzystaniem detekcji ekspresji białek metodą immunofluorescencji.
- Wartość operacyjna: Dostarczenie standaryzowanych, powtarzalnych wyników ilościowych poprzez analizę sygnałów fluorescencyjnych w wypreparowanych sercach za pomocą programu ImageJ.
- Wartość skalowalności: Możliwość ponownego wykorzystania platformy do oceny zmian ekspresji białek indukowanych przez chemiczne zanieczyszczenia środowiska w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje istotność w kontekście chorobowym poprzez wykrywanie uszkodzeń DNA w sercach zarodków rybek danio-ostroskrzelnych, które są modelem o zachowanych szlakach rozwoju serca.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, dostarczając wglądu w mechanizmy kardiotoksyczności indukowanej przez PM2.5.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez kwantyfikację osłabienia uszkodzeń DNA za pomocą jednoczesnego podawania przeciwutleniaczy (np. NAC).
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając odczytów mechanistycznych, które zwiększają pewność prognostyczną w kampaniach przesiewowych na wczesnym etapie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe oznaczanie biomarkerów uszkodzeń DNA w odpowiedzi na ekspozycję na toksyny środowiskowe.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy i wyniki ilościowe dzięki standaryzowanemu barwieniu immunofluorescencyjnemu oraz ilościowej analizie fluorescencji w sercach rybek zebrafish z wykorzystaniem programu ImageJ.
- Analityka: Generuje wyniki statystyczne (np. względne zmiany fluorescencji, istotność wyznaczoną za pomocą ANOVA), które umożliwiają porównywanie różnych warunków i walidację trafień.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez wykorzystanie modelu rybki zebrafish z szlakami rozwojowymi istotnymi dla oceny kardiotoksyczności u ludzi.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody do przesiewania różnorodnych bibliotek chemicznych pod kątem potencjału genotoksycznego w modelu serca kręgowca.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka w obrębie szlaków uszkodzeń DNA podczas przesiewowej oceny toksyczności rozwojowej.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację i powtarzalność dzięki ustalonym protokołom sekcji, barwienia i obrazowania z wykorzystaniem barier hydrofobowych oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie zmian biomarkerów z efektami fenotypowymi, co zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach programów toksykologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o potencjał wywoływania uszkodzeń DNA w modelu rozwijającego się serca.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z zarodkami ryb zebrafish, sekcji serca oraz technik immunofluorescencji.
- Zależność od mikroskopii fluorescencyjnej oraz oprogramowania ImageJ w celu kwantyfikacji sygnału i analizy statystycznej.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej czasu sekcji, inkubacji przeciwciał i procedur płukania w celu zapobiegania utracie tkanek.
- Wymaga rozważenia adaptacji przy rozszerzaniu testu na inne tkanki zebrafish lub modele chorobowe.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak odrywanie się tkanki serca podczas płukania, co wymaga ostrożnego obchodzenia się z PBS, zgodnie z treścią materiałów źródłowych.
