Name: Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków Danio rerio. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę ekspresji białek i ocenę wad rozwojowych serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk o Naturze Chin (numer grantu: 81870239, 81741005, 81972999) oraz Priorytetowy Program Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu.

Danio pręgowany (AB) typu dzikiego (AB) użyty w tym badaniu został uzyskany z National Zebrafish Resource Center w Wuhan w Chinach. Wszystkie opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytut Opieki nad Zwierzętami Komisji Etyki Uniwersytetu Soochow.
1. Pobieranie próbek PM2,5 i ekstrakcja związków organicznych
UWAGA: PM2.5 został zebrany w obszarze miejskim w Suzhou w Chinach w dniach 1-7 sierpnia 2015 roku, jak opisano wcześniej5.
<ol>
	<li>Piecz filtry z membraną kwarcową o średnicy 47 mm w piecu muflowym o temperaturze 500 °C przez 2 godziny, aby usunąć składniki organiczne.</li>
	<li>Umieścić filtr w próbniku PM2,5 na 24 godziny nieprzerwanego pobierania próbek.</li>
	<li>Wyjmij filtr i susz przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Określ ilościowo filtr za pomocą wagi analitycznej.</li>
	<li>Ekstrakcja składników organicznych z filtra przez ekstrakcję Soxhleta przy użyciu dichlorometanu jako rozpuszczalnika19.</li>
	<li>Wysuszyć EOM przez obrotowe odparowanie w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C i przepływ azotu. Rozpuścić EOM w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Pobieranie i leczenie zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Utrzymać danio pręgowanego w temperaturze 28,5 ± 0,5 °C w systemie akwakultury z recyrkulacyjnym cyklem fotoperiodycznym trwającym 14 godzin w świetle i 10 godzin.</li>
	<li>Umieść zdrowego dorosłego danio pręgowanego w zbiorniku w stosunku 2: 1 samca do samicy.</li>
	<li>Następnego dnia zbierz zarodki i umyj je wodą systemową (tj. wodą hodowlaną danio pręgowanego).</li>
	<li>Wybierz i losowo podziel zarodki danio pręgowanego wykazujące prawidłowy rozwój (jednolita wielkość, pełne ziarna i brak krzepnięcia jaj) na 4 grupy na indywidualnych szklanych szalkach Petriego o średnicy 7 cm (około 50 zarodków na szalkę).</li>
	<li>Traktować zarodki PM2,5 (5 mg/l) w obecności lub bez NAC w stężeniu 0,25 μM od 2 hpf do 72 hpf. Stosować DMSO jako kontrolę nośnika do końcowego stężenia 0,1% (v/v).</li>
</ol>
3. Obserwacja morfologiczna zarodków danio pręgowanego i sekcja serca
<ol>
	<li>Przy 72 hpf przenieś zarodki do szklanych szkiełek i obserwuj pod mikroskopem stereoskopowym. Rejestruj wady rozwojowe serca, takie jak obrzęk osierdzia, zmienione pętle i zmniejszony rozmiar.</li>
	<li>Oblicz wskaźniki wad rozwojowych (odsetek zarodków z wadami serca w stosunku do wszystkich żyjących zarodków) i przeanalizuj różnice między grupami za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie tureckiego testu wielokrotnego porównania (p < 0,05 = statystycznie istotne).</li>
	<li>Znieczulić zarodki 0,6 mg/ml MS-222 w celu unieruchomienia ich na szkiełkach podstawowych.</li>
	<li>Rejestruj bicie serca przez 30 s i określaj ilościowo tętno za pomocą oprogramowania ImageJ5,20.</li>
	<li>Wypreparuj serca z zarodków danio pręgowanego za pomocą jednorazowej igły strzykawkowej pod mikroskopem stereoskopowym. Uwaga: Unikaj niszczenia kształtu serca.</li>
</ol>
4. Test immunofluorescencyjny
<ol>
	<li>Aby użyć testu immunofluorescencyjnego do wykrycia uszkodzenia DNA wywołanego PM2,5 w sercu zarodków danio pręgowanego, użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg na czystej szklanej stronie.</li>
	<li>Dodaj 50 μl 4% paraformaldehydu do 1,25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby uzyskać roztwór utrwalający.</li>
	<li>Umieść 3 wypreparowane serca w jednym hydrofobowym okręgu barierowym i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zdekantować roztwór pod mikroskopem i suszyć próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut, tak aby serca całkowicie przylegały do szkiełek podstawowych.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy w PBS z 0,1% Tween 20 (PBST) przez 5 minut na pranie.</li>
	<li>Dodać 50 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1000 μl PBST, aby otrzymać 5% roztwór BSA i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał.</li>
	<li>Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez 5 minut na przemycie.</li>
	<li>Rozcieńczyć 2 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko 8-OHdG i 2 μl króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko γH2AX w 296 μl PBST, aby otrzymać działający pierwszorzędowy roztwór koktajlu przeciwciał.</li>
	<li>Próbki serca inkubować z 50 μl pierwszorzędowego roztworu koktajlu przeciwciał przeciwko 8-OHdG i γH2AX w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C (inkubacja przez noc może zwiększyć intensywność sygnału).</li>
	<li>Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez 5 minut na przemycie.</li>
	<li>Rozcieńczyć 1 μl znakowanego FITC koziego przeciwciała anty-mysiego i 1 μl koziego przeciwciała wtórnego przeciwko królikowi cy3 w 498 μl PBST w celu otrzymania działającego roztworu koktajlu przeciwciał drugorzędowych i inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi (1:500 w PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez 5 minut na płukanie, chroniąc je przed światłem.</li>
	<li>Dodać 20 μl DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) do próbek w celu barwienia jądrowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nałóż szkiełko nakrywkowe, aby przesunąć i uszczelnić lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i przemieszczaniu się. Następnie zobrazuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym i określ ilościowo sygnał fluorescencyjny obszaru serca za pomocą oprogramowania ImageJ. Obliczyć względne zmiany za pomocą średniej próbek kontrolnych DMSO. Określ istotność statystyczną danych jak w kroku 3.2.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/</a> (2018).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).</li>
<li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li>
<li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs%3A+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AhR+and+wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li>
<li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+senescence%2C+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li>
<li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+%28PM2.5%29+collected+in+Abidjan%2C+Cote+d%27Ivoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li>
<li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li>
<li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation%2C+apoptosis%2C+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li>
<li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+biochemistry+and+physiology.+Part+B%2C+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li>
<li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diabetology%22%5BJournal%5D)">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine%2C+reactive+oxygen+species+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).</li>
<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li>
<li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li>
<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).</li>
<li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li>
<li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li>
<li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż danio pręgowany jest doskonałym modelem kręgowców do badania toksyczności rozwojowej serca chemikaliów środowiskowych, ze względu na mały rozmiar serca zarodka, trudno jest uzyskać wystarczającą ilość białka do analizy western blot. W związku z tym przedstawiamy czułą metodę immunofluorescencyjną do ilościowego określania poziomów ekspresji białek biomarkerów uszkodzeń DNA w sercach zarodków danio pręgowanego narażonych na PM2,5.
Podczas sekcji ważne jest, aby zachować integ...

Zanieczyszczenie powietrza jest teraz poważnym problemem środowiskowym, przed którym stoi świat. Drobny pył zawieszony w otoczeniu (PM2,5), który jest jednym z najważniejszych wskaźników jakości powietrza, może przenosić dużą liczbę szkodliwych substancji i przedostawać się do układu krwionośnego, powodując poważne szkody dla zdrowia ludzkiego1. Badania epidemiologiczne wykazały, że narażenie na PM2,5 może prowadzić do zwiększonego ryzyka wrodzonych wad serca (CHD)2,3. Dowody z eksperymentów na zwierzętach wykazały również, że PM2,5 może powodować nieprawidłowy rozwój serca u zarodków danio pręgowanego i potomstwa myszy, ale mechanizmy molekularne toksyczności rozwojowej PM2,5 dla serca są nadal w dużej mierze nieznane4,5,6.
Uszkodzenie DNA może spowodować zatrzymanie cyklu komórkowego i wywołać apoptozę, która może znacznie zniszczyć potencjał komórek progenitorowych, a w konsekwencji zaburzyć rozwój serca7). Zostało dobrze udokumentowane, że zanieczyszczenia środowiska, w tym PM2,5, mogą potencjalnie atakować DNA poprzez mechanizmy stresu oksydacyjnego8,9. Zarówno rozwój serca człowieka, jak i danio pręgowanego jest wrażliwy na stres oksydacyjny10,11,12. 8-OHdG jest markerem oksydacyjnego uszkodzenia DNA, a sygnał γH2AX jest markerem pęknięć podwójnej nici DNA. N-acetylo-L-cysteina (NAC), syntetyczny prekursor wewnątrzkomórkowej cysteiny i glutationu, jest szeroko stosowana jako związek przeciwutleniający. W tym badaniu używamy NAC do zbadania roli stresu oksydacyjnego w uszkodzeniach DNA wywołanych PM2,513.
Danio pręgowany jako modelowy kręgowiec był szeroko stosowany do badania rozwoju serca i chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, ponieważ mechanizmy rozwoju serca są wysoce konserwatywne wśród kręgowców14,15. Zalety wykorzystania danio pręgowanego jako modelu to ich niewielkie rozmiary, duża zdolność reprodukcyjna i niskie koszty karmienia. Szczególnie interesujące dla tych badań jest to, że zarodki danio pręgowanego nie są zależne od układu krążenia we wczesnym okresie rozwoju i mogą przetrwać poważne wady rozwojowe serca14. Co więcej, ich przezroczystość pozwala na bezpośrednią obserwację całego ciała pod mikroskopem. W związku z tym zarodki danio pręgowanego stanowią wyjątkową okazję do oceny mechanizmów molekularnych zaangażowanych w indukcję toksyczności rozwojowej serca w wyniku narażenia na różne chemikalia środowiskowe5,16,17. Wcześniej informowaliśmy, że stres oksydacyjny wywołany PM2,5 prowadzi do uszkodzenia DNA i apoptozy, co skutkuje wadami rozwojowymi serca u danio pręgowanego18. W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół badania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercu zarodków danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało 8-OHdG</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-66036</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Sartorius, Chiny</td><td>BSA124S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>SW3015</td><td>Do blokowania</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam, USA</td><td>ab104139</td><td>Do barwienia jądrowego.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus, Japonia</td><td>IX73</td><td>Do obrazowania sygnałów fluorescencyjnych /</td></tr> <tr><td>Koza Anti-Rabbit IgG Cy3</td><td>Carlsbad, USA</td><td>CW0159</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Koza Anty-królicze IgG FITC</td><td>Carlsbad, USA</td><td>RS0003</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina (NAC)</td> <td>Adamas-Beta, Szanghaj, Chiny</td><td>616-91-1</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>QILINBEIER, Chiny</td><td>TS-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma, Chiny</td><td>P6148</td><td>Wytwarza 4% paraformaldehydu do utrwalania.</td></tr><tr><td>Hyklon soli fizjologicznej buforowanej fosforanami</td><td>, USA</td><td>SH30256.01</td><td>Przygotuj 0,1% Tween w PBS do prania.</td></tr><tr><td>Próbnik PM2.5</td><td>TianHong, Wuhan, Chiny</td><td>TH-150C</td><td>Do 24-godzinnego nieprzerwanego pobierania próbek PM2.5.</td></tr><tr><td>Recyrkulacyjny system akwakultury</td><td>HaiSheng, Szanghaj, Chiny</td><td></td><td>Danio pręgowany był w nim utrzymywany.</td></tr><tr><td>Ekstraktor Soxhleta</td><td>ZhengQiao, Szanghaj, Chiny</td><td>BSXT-02</td><td>Do ekstrakcji składników organicznych.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon, Kanada</td><td>SMZ645</td><td>Do wycinania serca z zarodków danio pręgowanego.</td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy (MS222)</td> <td>Sigma, Chiny</td><td>E10521</td><td>Do znieczulania zarodków danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Chiny</td><td>P1379</td><td></td></tr> <tr><td>i gamma; Przeciwciało H2AX</td><td>Abcam, USA</td><td>ab26350</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń dna wywołanych przez pm2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Narażenie na drobny pył zawieszony (PM2.5) może prowadzić do toksyczności rozwojowej serca, ale mechanizmy molekularne leżące u podstaw są nadal niejasne. 8-hydroksy-2'deoksygenaza (8-OHdG) jest markerem oksydacyjnego uszkodzenia DNA, a γH2AX jest wrażliwym markerem pęknięć podwójnej nici DNA. W tym badaniu naszym celem było wykrycie indukowanych przez PM2,5 zmian 8-OHdG i γH2AX w sercu zarodków danio pręgowanego za pomocą testu immunofluorescencyjnego. Zarodki danio pręgowanego traktowano ekstrahowalnymi substancjami organicznymi (EOM) z PM2,5 w stężeniu 5 μg/ml w obecności lub braku przeciwutleniacza N-acetylo-L-cysteiny (NAC, 0,25 μM) po 2 godzinach od zapłodnienia (hpf). DMSO służył jako sterowanie pojazdem. Przy 72 hpf serca zostały wycięte z zarodków za pomocą igły strzykawki, a następnie utrwalone i przepuszczalne. Po zablokowaniu próbki badano pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko 8-OHdG i γH2AX. Próbki następnie przemyto i inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi. Uzyskane obrazy obserwowano pod mikroskopią fluorescencyjną i określano ilościowo za pomocą ImageJ. Wyniki pokazują, że EOM z PM2,5 znacznie wzmocnił sygnały 8-OHdG i γH2AX w sercu zarodków danio pręgowanego. Jednak NAC, działając jako pochłaniacz reaktywnych form tlenu (ROS), częściowo przeciwdziałał uszkodzeniom DNA wywołanym przez EOM. W tym miejscu przedstawiamy protokół immunofluorescencyjny do badania roli uszkodzenia DNA w wadach serca wywołanych PM2,5, który można zastosować do wykrywania zmian ekspresji białek wywołanych chemikaliami środowiskowymi w sercach zarodków danio pręgowanego.

Niniejszy test immunofluorescencji jest czułą i swoistą metodą pomiaru zmian w ekspresji białek w sercach embrionów zebrafish eksponowanych na związki chemiczne występujące w środowisku.
W tej reprezentatywnej analizie embriony eksponowane na PM2.5 w obecności lub przy braku przeciwutleniacza NAC oceniano pod kątem występowania malformacji serca (Rycina 1). Jak zaobserwowano, EOM z PM<sub...

Ten protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych PM2.5 w wypreparowanych sercach zarodków danio pręgowanego.

Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Metoda ta może być wykorzystana do dokładnego i łatwego wykrywania ekspresji docelowych białek w sercu danio pręgowanego. Zmiany w białku docelowym są bezpośrednio wykrywane przez pomiar immunofluorescencji. Przeprowadzić pobieranie i leczenie zarodków danio pręgowanego, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.Po 72 godzinach od zapłodnienia przenieś zarodki na szkiełka podstawowe i obserwuj je pod mikroskopem stereoskopowym. Rejestruj wady rozwojowe serca, takie jak obrzęk osierdzia, zmienione pętle i zmniejszony rozmiar. Oblicz wskaźniki wad rozwojowych i przeanalizuj różnice między grupami za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA, a następnie tureckiego testu wielokrotnych porównań.Po znieczuleniu zarodków 0,6 miligrama na mililitr MS222, rejestruj bicie serca przez 30 sekund i określ ilościowo tętno za pomocą oprogramowania Image J. Ostrożnie wypreparuj serca z zarodków zebry za pomocą jednorazowej igły strzykawkowej pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg na czystym szkiełku.Dodaj 50 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do 1,25 mikrolitra PBS, aby uzyskać roztwór utrwalający, a następnie umieść trzy wycięte serca w jednym hydrofobowym okręgu barierowym i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować roztwór pod mikroskopem i suszyć próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć minut. Umyj szkiełka trzy razy w PBST przez pięć minut na pranie.Dodaj 50 mikrolitrów BSA do 1 000 mikrolitrów PBST, aby uzyskać 5% roztwór BSA, i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez godzinę, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez pięć minut na przemycie. Rozcieńczyć dwa mikrolitry mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko 8-hydroksydeoksyguanozynie i dwa mikrolitry króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko gamma-H2AX w 296 mikrolitrach PBST, aby uzyskać działający pierwszorzędowy roztwór koktajlu przeciwciał.Próbki serca inkubować z 50 mikrolitrami pierwszorzędowego roztworu koktajlu przeciwciał w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez pięć minut na przemycie. Rozcieńczyć jeden mikrolitr koziego przeciwciała wtórnego przeciwko myszom znakowanego FITC i jeden mikrolitr koziego przeciwciała wtórnego przeciwko królikowi psy-3 w 500 mikrolitrach PBST, aby uzyskać działający roztwór koktajlu przeciwciał drugorzędowych.Próbki należy inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez pięć minut na przemycie. Dodaj 20 mikrolitrów DAPI do próbek w celu barwienia jądrowego i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Nałóż szkiełko nakrywkowe na szkiełko i uszczelnij je lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i przemieszczaniu się. Zobrazuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym i określ ilościowo sygnał fluorescencyjny obszaru serca za pomocą oprogramowania ImageJ. Oblicz względne zmiany przy użyciu średniej z prób kontrolnych DMSO i określ istotność statystyczną danych.Zarodki narażone na PM 2,5 przy braku lub obecności przeciwutleniacza, N-acetylo-L-cysteiny lub NAC, oceniano pod kątem obecności wad rozwojowych serca. EOM z PM 2,5 kosztowało znaczny wzrost teratogenezy serca, takiego jak obrzęk osierdzia, zmieniona pętla i zmniejszony rozmiar, w porównaniu z sercami leczonymi DMSO. Częstość akcji serca była również znacznie zmniejszona u zarodków narażonych na EOM.Dodanie NAC osłabiało wady serca wywołane przez EOM. Test immunofluorescencyjny zastosowano w celu oceny stopnia uszkodzenia DNA w tkankach poddanych działaniu EOM. Poziomy ekspresji 8-hydroksydeoksyguanozyny i gamma-H2AX były znacznie zwiększone w sercach zarodków danio pręgowanego leczonych EOM, co wskazuje odpowiednio na wzrost oksydacyjnych uszkodzeń DNA i pęknięć podwójnej nici DNA.Uszkodzenia DNA wywołane przez EOM zostały częściowo zniwelowane przez suplementację NAC. Podczas korzystania z tego protokołu należy zachować ostrożność podczas mycia próbek PBS, ponieważ serce danio pręgowanego może odkleić się od szkiełka.

using-immunofluorescence-to-detect-pm25-induced-dna-damage-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Ten film demonstruje bardzo czuły test oparty na immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń oksydacyjnych wywołanych PM2.5 w sercach zarodków danio pręgowanego poprzez pomiar poziomów 8-OHdG i γH2AX, które wskazują odpowiednio na uszkodzenie DNA i pęknięcia dwuniciowego DNA.

Test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA za pośrednictwem PM2,5 w zarodkach ryb

Pewne zaburzenia genetyczne lub narażenie na toksyny mogą zakłócić normalne procesy rozwojowe, prowadząc do śmierci określonych typów komórek. Analiza aktywowanej kaspazy 3 metodą immunofluorescencji całej góry w zarodkach danio pręgowanego ujawnia specyficzną dla etapu i tkanki lokalizację komórek specyficznie ulegających apoptozie.

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.

Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Celem tego protokołu jest szczegółowe opracowanie nowatorskiej metody oceny segmentalnej funkcji serca u embrionalnych ryb danio pręgowanych, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych.

Analiza przemieszczenia mechanicznej deformacji mięśnia sercowego (DIAMOND) ujawnia segmentalną heterogeniczność funkcji serca u embrionalnego danio pręgowanego

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Badanie to ustanawia czułą metodę obrazowania opartą na immunofluorescencji do ilościowego określenia globalnej metylacji DNA w pojedynczych zarodkach danio pręgowanych. To podejście pokonuje wyzwanie ograniczonej ilości tkanek i pomija konieczność konwersji bisulfytów.

Wykrywanie globalnej metylacji DNA w sercach larw danio pręgowanych

Poznaj metodę immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków Danio rerio. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę ekspresji białek i ocenę wad rozwojowych serca.

Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM_2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów