Obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych (LISCA) - wszechstronna technika ilościowego określania kinetyki komórkowej

Obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych zwane LISCA to również automatyczny odczyt przebiegów czasu fluorescencyjnego setek pojedynczych komórek. Zaletą tego podejścia jest to, że odpowiedzi poszczególnych komórek są rejestrowane z przestrzennie izolowanych komórek w identycznych mikrośrodowiskach, co pozwala na wydajną analizę emisji z doskonałymi statystykami. Aby wytworzyć matrycę jednokomórkową, użyj skalpela, aby wyciąć pojedyncze arcydzieło PDM zawierające sześć mikro pasków proszku z warstwy PDM i umieść arcydzieło na stole laboratoryjnym z mikrowzorem skierowanym do góry.

Użyj żyletki, aby wyciąć każdy z sześciu pasków mikrowzoru na stempel PDM, odcinając niektóre wzorzyste obszary, aby upewnić się, że krawędzie stempla są otwarte. Następnie ostrożnie zdrap folię ochronną szkiełka nakrywkowego zjeżdżalni sześciokomorowej, aby zaznaczyć pozycje kanałów prowadnicy i połóż szkiełko nakrywkowe na ławce folią ochronną skierowaną w dół. Za pomocą pęsety umieść stemple na szkiełku nakrywkowym w zaznaczonych miejscach kanału, mikrowzorami skierowanymi w dół, a następnie sprawdź mocowanie stempli pod mikroskopem.

Kwadraty stykające się ze szkiełkiem będą ciemniejsze niż odstęp. Jakość wzoru jest obniżana przez kwadraty, które nie są prawidłowo przymocowane do slajdu. Jeśli stemple są bezpiecznie przymocowane, należy potraktować szkiełko nakrywkowe i stemple plazmą tlenową pod ciśnieniem 0,2 milibara i około 40 watami przez trzy minuty, aby powierzchnie między stemplami PDM a szkiełkiem nakrywkowym stały się hydrofilowe.

Pod koniec czyszczenia plazmowego umieść szkiełko nakrywkowe w komorze bezpieczeństwa biologicznego i dodaj 15 mikrolitrów pegylowanego roztworu poli-l-lizyny do każdego stempla, tak aby roztwór został wchłonięty przez hydrofilowy wzór stempla. Po 20 minutach spłucz stemple jednym mililitrem ultraczystej wody. Za pomocą pęsety usuń stemple ze szkiełka i spłucz szkiełko nakrywkowe po raz drugi drugim mililitrem ultraczystej wody.

Gdy szkiełko nakrywkowe całkowicie wyschnie, przymocuj sześciokanałowy lepki suwak do szkiełka nakrywkowego, uważając, aby obszary z mikrowzorami wyrównały się z dnem kanałów. I dodaj 40 mikrolitrów PBS i 40 mikrolitrów roztworu fibronektyny do każdego kanału. Aby wymieszać dwa roztwory, wyjmij 40 mikrolitrów z jednego zbiornika i dodaj go do przeciwległego zbiornika tego samego kanału trzy razy, aby uzyskać jednorodny roztwór.

Po wymieszaniu wszystkich kanałów, inkubować szkiełko przez 45 minut w temperaturze pokojowej przed trzykrotnym myciem każdego kanału 120 mikrolitrami PBS na pranie. Wymień PBS na 37 stopni Celsjusza, w pełni uzupełnioną pożywkę do wzrostu komórek w kanałach, dodając 120 mikrolitrów pożywki do jednego zbiornika i usuń ją z przeciwległego zbiornika. Dodać 40 mikrolitrów zawiesiny 400 000 komórek na mililitr komórek i 40 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek do każdego kanału i wymieszać roztwór komórkowy z pożywką, jak pokazano.

Po wymieszaniu usunąć 40 mikrolitrów zawiesiny z każdego kanału, tak aby tylko kanały były wypełnione zawiesiną komórkową, i umieścić szkiełko w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po godzinie sprawdź adhezję komórek za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i dodaj 120 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdego kanału, a następnie włóż szkiełko z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na kolejne trzy godziny. Aby skonfigurować system perfuzyjny, podłącz jednomililitrową strzykawkę wypełnioną pożywką do wzrostu komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza do rurki wlotowej systemu i użyj zaworu, aby napełnić rurkę medium.

Podłącz rurkę wlotową do zbiornika jednego kanału, uważając, aby nie zostały uwięzione żadne pęcherzyki powietrza, a następnie podłącz złącze szeregowe do zbiornika przeciwlegle do rurki wlotowej kanału prądowego. Podłącz pozostałe kanały, jak pokazano, aż wymagana liczba kanałów zostanie połączona szeregowo. I podłącz rurkę wylotową bezpośrednio do wolnego zbiornika kanału końcowego.

Następnie napełnij podłączoną rurkę pożywką, aby upewnić się, że system perfuzyjny nie przecieka. W przypadku obrazowania poklatkowego komórek, aby skonfigurować protokół poklatkowy do rejestrowania obrazu kontrastu fazowego i obrazu fluorescencji, należy ustawić konfigurację optyczną dla obrazowania z kontrastem fazowym i obrazowania fluorescencyjnego. Użyj 10-krotnego obiektywu, odpowiednich filtrów fluorescencyjnych i automatycznego systemu korekcji ostrości, aby zapewnić lepszą jakość obrazu w przypadku pomiarów długotrwałych.

Wybierz 10-milisekundowy czas ekspozycji dla obrazowania z kontrastem fazowym i czas ekspozycji 750 milisekund dla rejestracji intensywności fluorescencji EGFP. Ustaw harmonogram z 10-minutowym odstępem czasu między kolejnymi pętlami na liście pozycji i czasem obserwacji wynoszącym 30 godzin. Następnie umieść szkiełko sześciokanałowe na pojedynczym wzniesieniu piwnicy w uchwycie próbki komory grzewczej mikroskopu o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przyklej rurkę systemu perfuzji do stolika.

Włóż wolne końce rurek wylotowych do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, aby zebrać płynne odpady. I ustaw listę pozycji dla pomiaru poklatkowego skanowania, dbając o to, aby liczba pozycji mogła być skanowana w zdefiniowanym przedziale czasu między kolejnymi pętlami na liście pozycji. Następnie rozpocznij pomiar poklatkowy.

Do transfekcji komórek za pomocą markera fluorescencyjnego użyj strzykawki, aby przepłukać system rurek jednym mililitrem PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza, uważając, aby stolik mikroskopu się nie poruszał. Po przepłukaniu napełnij system 300 mikrolitrami zredukowanej pożywki surowicy uzupełnionej interesującym mRNA, do końcowego stężenia 0,5 nanograma mRNA na mikrolitr i pozwól lipopleksom inkubować przez godzinę. Pod koniec inkubacji przepłukać system jednym mililitrem kompletnej pożywki do wzrostu komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć wszelkie niezwiązane mRNA.

Pod koniec analizy wyświetl kanały wymienione w menu kanałów i przewiń przedziały czasowe, aby sprawdzić, czy wstępnie wybrane komórki i ich zintegrowane sygnały fluorescencyjne. Kliknij interesującą Cię komórkę, aby podświetlić jej przebieg czasu fluorescencji, lub kliknij przebieg czasu, aby znaleźć odpowiednią komórkę. Naciśnij Shift podczas klikania komórki, aby ją zaznaczyć lub odznaczyć.

Usuń zaznaczenie wszystkich komórek, które nie są żywotne lub nie są ograniczone do miejsca adhezji lub które są przyłączone do innej komórki, aby wykluczyć je z dalszej analizy. Gdy wszystkie komórki zostaną odpowiednio zaznaczone lub odznaczone, zapisz przebiegi czasowe pojedynczej komórki dla obszaru komórki i zintegrowaną fluorescencję w odpowiednim katalogu. Aby określić ilościowo czas początku translacji po transfekcji oraz siłę komórkowej ekspresji EGFP, można zastosować trzyetapowy model translacji.

Modelowe rozwiązanie dla EGFP można dopasować do jednokomórkowych przebiegów czasowych, jak pokazano na ilustracji. Tutaj można zaobserwować histogramy czasu rozpoczęcia transfekcji i szybkość ekspresji komórek transfekowanych lipoplexem. Ponieważ oba parametry są szacowane dla każdej komórki, korelację tych parametrów można przeanalizować, jak pokazano na wykresie punktowym, i porównać z komórkami transfekowanymi nanocząstkami lipidowymi.

Jak pokazano, komórki transfekowane nanocząstkami lipidowymi wykazują mniejszą zmienność między komórkami w porównaniu z komórkami transfekowanymi lipopleksami. Średnia populacji wskazuje na szybszy początek translacji, a także wyższy wskaźnik ekspresji. Nasze podejście można również dostosować do alternatywnych metod mikromodelowania.

Najważniejsze dla LISCA jest dobre zamknięcie komórek i połączenie automatycznej analizy obrazu z wygodnym nadzorem użytkownika. Jak widzieliście, zachowanie komórek jest niejednorodne. Filmy poklatkowe z pojedynczymi komórkami zapewniają dostęp do bezstronnej dynamiki nieodłącznych sieci biochemicznych.

Na przykład w zielonym wyrażeniu, apoptozie lub testach zabijania komórek.