Oznaczanie zawartości celulozy krystalicznej w biomasie roślinnej metodą Updegraff

W tym miejscu przedstawiamy metodę Updegraffa, najczęściej stosowaną na świecie metodę oznaczania zawartości celulozy krystalicznej. Celuloza składa się zasadniczo z monomerów glukozy połączonych wiązaniami beta-1, 4 glikozydowymi. Podzieliliśmy ten protokół na pięć etapów.

W pierwszej fazie przygotowujemy materiał z biomasy roślinnej. W drugiej fazie ekstrahujemy surową ścianę komórkową. W trzeciej fazie stosujemy obróbkę Updegraff, w której Updegraff składa się z kwasu octowego i kwasu azotowego, który pomaga w usuwaniu hemicelulozy i ligniny z naszych próbek.

W czwartej fazie poddajemy go hydrolizie kwasowej za pomocą kwasu siarkowego, który wytwarza monomery glukozy. Wreszcie, w piątej fazie, używamy testu antronowego do oszacowania zawartości celulozy krystalicznej. Zebrać materiał roślinny ze szklarni, umyć go dokładnie wodą, wysuszyć na powietrzu przez dwa dni, oddzielić tkankę i przenieść tkankę do indywidualnie oznakowanych pojemników i inkubować w inkubatorze w temperaturze 49 stopni Celsjusza przez 10 dni.

Następnie na koniec pokrój na kawałki za pomocą nożyczek lub ostrza. Zamroź chusteczkę i załaduj do moździerza i tłuczka w celu drobnego zmielenia na jednolity proszek lub alternatywnie użyj zamrażarki/młynka. Tutaj demonstrujemy użycie zamrażarki / młynka, więc ładujemy nasze próbki tkanek do tych fiolek do mielenia i umieszczamy je w zamrażarce / młynie i uruchamiamy prędkość 10 CP przez trzy cykle.

Sproszkowana tkanka jest zbierana w probówce Falcon, jak pokazano tutaj. Odważyć 20 mg sproszkowanej tkanki i przenieść do wstępnie zważonej probówki o pojemności dwóch ml. Dodaj jeden ml buforu do rozpuszczania białek, aby usunąć białka. Wir.

Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut. Odrzucić supernatant. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.

Dodać jeden ml sterylnej wody do zatrzymanego osadu. Wir. Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.

Dodaj jeden ml 70% etanolu do zatrzymanego osadu. Wir. Przenieś do podgrzanego bloku o temperaturze 70 stopni Celsjusza, jednocześnie wstrząsając przez godzinę. Po godzinnej inkubacji odwirować z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut.

Powtórz ten krok jeszcze raz. Do zaoszczędzonej osadki dodaj jeden ml 100% metylonu. Wir. Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut.

Dodać jeden ml metanolu chloroformowego. Wir. Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut. Odrzucić supernatant i dodać jeden ml acetonu. Wir.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut. Ponownie wyrzuć supernatant i wysusz go na powietrzu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc lub kontynuuj suszenie próżniowe.

Załaduj próbki do suszarki próżniowej i susz na powietrzu przez dwie do trzech godzin lub do momentu, gdy granulka całkowicie wyschnie. Odważyć pięć mg ekstraktu ze ściany komórkowej otrzymanego w poprzednim etapie. Przenieść do probówki z nakrętką o pojemności dwóch ml.

W tym momencie należy również uwzględnić kontrolę pozytywną. W tym celu należy użyć dwóch mg bibuły filtracyjnej Whatman. Przenieść do probówki z nakrętką o pojemności dwóch ml.

Dodać 1,5 ml odczynnika Updegraff do każdego zważonego ekstraktu ze ściany komórkowej. Wirować i inkubować w temperaturze 100 stopni Celsjusza w podgrzanym bloku przez 30 minut. Po 30 minutach inkubacji przenieś na stojak.

Pozostaw do ostygnięcia na ławce przez 10 minut. Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez 10 minut. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu.

Dodaj jeden ml sterylnej wody. Wir. Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez 10 minut. Wyrzucić 500 mikrolitrów supernatantu.

Dodaj jeden ml acetonu. Wir. Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut. Wyrzucić jeden ml supernatantu.

Dodaj jeden ml acetonu. Wir. Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut. Całkowicie odrzucić supernatant.

Dodaj jeden ml acetonu. Wir. Wirować z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut. Odrzucić supernatant.

Suszyć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po jednodniowej inkubacji przenieś do stojaka. Dodaj jeden ml 67% kwasu siarkowego. Wir.

Inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę z jednoczesnym wstrząsaniem. Po godzinnej inkubacji upewnij się, że osad jest całkowicie rozpuszczony. Przenieś do stojaka.

Jest to ostatni etap ekstrakcji celulozy. Teraz próbki są gotowe do rozcieńczenia. Do rozcieńczenia próbki należy użyć 10 mikrolitrów każdej próbki z poprzedniego kroku i dodać 490 mikrolitrów sterylnej wody.

Powtórz tę czynność dla wszystkich próbek eksperymentalnych. W celu przygotowania krzywej wzorcowej glukozy należy przygotować świeży zapas w ilości jednej mg na ml glukozy i przygotować stężenia od zera mikrogramów do 200 mikrogramów, dodając jedną mg na ml glukozy w odstępach co 20 mikrolitrów i uzupełnić końcową objętość do jednego ml sterylną wodą. Weź 500 mikrolitrów każdego przygotowanego wzorca do zakrętki i dodaj jeden ml 0,2% antronu.

A teraz próbki są gotowe do testu antronowego. Dodaj jeden ml świeżo przygotowanego tronu. Natychmiast wymieszaj przez wirowanie i przenieś do lodu.

Powtórzyć te czynności dla wszystkich wzorców i próbek w ten sam sposób. Następnie przenieś do podgrzanego bloku o temperaturze 100 stopni Celsjusza na 10 minut. Po 10 minutach inkubacji przenieść do lodu i inkubować przez pięć minut na lodzie.

Po inkubacji pobrać 200 mikrolitrów każdej próbki w trzech powtórzeniach. Powtórzyć te czynności zarówno dla wzorców, jak i próbek w ten sam sposób. Załadowana 96-dołkowa płytka została załadowana do detektora wielomodowego.

Za pomocą programu Smart Max Pro ustawiamy ustawienie filtra na 620 nanometrów. Typ płytki do typu 96-dołkowego. Zaznacz cały obszar odczytu.

Kliknij przycisk OK. Czytać. Odczyt tabliczki. Uzyskuje się odczyty absorbancji zarówno wzorców, jak i próbek, które zostaną zebrane w arkuszu Excela w celu dalszej analizy i oszacowania zawartości celulozy.

Krzywą wzorcową stężenia glukozy przygotowuje się, wykorzystując stężenia glukozy w mikrogramach na ml na osi x i znormalizowane wartości absorbancji odpowiedniego stężenia przy 620 nanometrach na osi y. Otrzymujemy linię regresji z wartościami m i c na wykreślonym wykresie punktowym, którego używamy do oszacowania zawartości celulozy krystalicznej w próbce. W pierwszym kroku uśredniliśmy wartości OD na poziomie 620 nanometrów.

Następnie znormalizowaliśmy dane, odejmując pustą wartość. Stężenie glukozy obliczamy za pomocą wzoru x jest równe OD minus c/m, gdzie wprowadzamy wartości c i m z poprzedniego kroku linii regresji na krzywej standardowej. Ponieważ całkowita objętość, która została użyta do testu antronowego, wynosi 500 mikrolitrów, dzielimy ją przez współczynnik rozcieńczenia dwa.

Ponieważ objętość użytej próbki wynosiła tylko 10 mikrolitrów, podzielimy dalej przez 10, aby uzyskać stężenie glukozy w mikrogramach na mikrolitr, które jest równe stężeniu mg na ml. Następnie użyliśmy współczynnika wilgotności 1,11, który jest przyrostem wilgoci w procesie. I na koniec obliczamy procentową zawartość celulozy krystalicznej, dzieląc ją przez masę ściany komórkowej, która jest bliska pięciu mg, i mnożymy przez 100, aby uzyskać procent.

Następnie uśredniliśmy zawartość celulozy krystalicznej w trzech kontrpróbach biologicznych, aby uzyskać wartość dla poszczególnych próbek, która zostanie porównana ze średnią z innej linii eksperymentalnej wynoszącą trzy kontrpróby biologiczne. A test t może być używany do testowania ich poziomu istotności. Tutaj w tabeli A pokazujemy tabelaryczne wartości stężenia i odpowiedniego OD przy 620 nanometrach, które zostały następnie wykorzystane do wykreślenia wykresu punktowego i linii regresji z wartościami m i c, które zostały użyte w C do uzyskania różnic w zawartości celulozy między dwiema liniami eksperymentalnymi.

Podsumowując, obie próbki wykazują różnice w celulozie. Dzięki za oglądanie.