Montaż i eksploatacja urządzenia akustyczno-fluidycznego w celu lepszego dostarczania związków molekularnych do komórek

Protokół ten opisuje montaż i działanie systemu akustofluidycznego, który może skutecznie dostarczać biomolekuły do różnych badań i zastosowań terapeutycznych opartych na komórkach. Główną zaletą tego systemu jest to, że umożliwia szybkie dostarczanie biomolekuł do komórek przy jednoczesnym zachowaniu ich żywotności. Jest to technologia platformowa, która umożliwia transformację komórek do różnych komórkowych zastosowań terapeutycznych, takich jak leczenie raka.

Zacznij od połączenia 54 gramów bazy PDMS i sześciu gramów utwardzacza w filiżance. Mieszać energicznie i dokładnie szpatułką przez co najmniej jedną minutę, a następnie umieścić kubek z roztworem PDMS w eksykatorze na około 30 minut lub do momentu usunięcia resztek pęcherzyków powietrza. Umieść płytkę pokrytą fotorezystem wzorami skierowanymi do góry na 150-milimetrowej szalce Petriego, a następnie wlej roztwór PDMS na formę.

W razie potrzeby umieścić szalkę Petriego w eksykatorze i zastosować próżnię, aż znikną resztki pęcherzyków powietrza. Przenieś szalkę Petriego do piekarnika laboratoryjnego i piecz przez dwie godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby utwardzić PDMS. Po utwardzeniu ostrożnie usuń PDMS z szalki Petriego, przecinając krawędzie wafla żyletką.

Wytnij każde urządzenie z osobna za pomocą noża lub żyletki, a następnie wybij otwory w otworach wlotowych i wylotowych za pomocą 2,5-milimetrowego dziurkacza do biopsji. Po potraktowaniu urządzenia PDMS plazmą tlenową należy natychmiast umieścić każde urządzenie na czystym szkiełku mikroskopowym ze szkła sodowo-wapniowego z kanałami skierowanymi w stronę powierzchni szkła. Pozwól urządzeniom połączyć się przez noc w temperaturze pokojowej.

Delikatnie nałóż silikon na powierzchnię przetwornika piezoelektrycznego o średnicy jednego centymetra o grubości od jednego do dwóch milimetrów, a następnie ostrożnie wyrównaj przetwornik za pomocą koncentrycznej spirali i delikatnie dociśnij go do dolnej części szklanego szkiełka mikroskopowego. Podłącz mikrokontroler do komputera za pomocą USB A do B. Powinny zaświecić się zielone wskaźniki LED zasilania.

Użyj odpowiedniego oprogramowania na komputerze, aby przesłać program, który generuje sygnał o częstotliwości ośmiu megaherców. jednocalowy drut o średnicy 22 do końca każdego przewodu na przetworniku PZT. Następnie użyj go do podłączenia ujemnego przewodu zaciskowego przetwornika PZT do pinu GND.

Podłącz dodatni przewód zaciskowy przetwornika PZT do pinu wyjściowego za pomocą przylutowanego przewodu. Wytnij od trzech do sześciu cali odcinków miękkiej plastikowej rurki z PVC tygon i wepchnij rurkę do portów wlotowych i wylotowych. Może być konieczne obrócenie rurki podczas wywierania nacisku, aż zmieści się w otworze.

Opcjonalnie można nałożyć klej na skrzyżowaniu, aby połączyć ze sobą PDMS i wężyki. Opcjonalnie zamontuj urządzenie akustyczne i mikrokontroler w obudowie wydrukowanej w 3D. Zbiornik mikroprzepływowy należy zamontować zgodnie z instrukcjami producenta.

Wytnij od trzech do sześciu cali odcinek miękkiej plastikowej rurki z tworzywa sztucznego tygon PVC o średnicy wewnętrznej 1/16 cala i wsuń ją na rurkę o średnicy wewnętrznej 1/32 cala z wyjścia zbiornika mikroprzepływowego. Opcjonalnie owiń złącze folią parafinową, aby zapobiec wyciekom. Napełnij 60-mililitrową strzykawkę powietrzem z otoczenia z boku zbiornika mikroprzepływowego.

Ustaw pompę strzykawkową na szybkość 200 mililitrów na godzinę, aby przepchnąć roztwory środka kontrastowego przez urządzenie akustofluidyczne z objętościowym natężeniem przepływu 50 mililitrów na godzinę i pobrać próbki z wyjścia urządzenia do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Przygotuj roztwór fosfolipidów w 20-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej, dodając 25 miligramów DSPC, 11,6 miligramów DSEPC, 0,26 miligramów DSPG i 0,88 miligramów stearynianu polioksyetylenu40. Dodawaj chloroform, aż wszystkie fosfolipidy się rozpuszczą.

Odparować chloroform w eksykatorze przez 48 godzin, aby utworzyć suchy film lipidowy. Ponownie nawodnij piankę 10 mililitrami sterylnego PBS, a następnie sonikuj roztwór lipidowy przez trzy minuty przy amplitudzie 40%, aby utworzyć kationowy roztwór micelarny. Po sonikacji roztwór fosfolipidów może być przechowywany w temperaturze od dwóch do sześciu stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca.

Aby przygotować ultradźwiękowe środki kontrastowe, dodaj 200 mikrolitrów kationowego roztworu micelarnego w 600 mikrolitrach sterylnego PBS do dwumililitrowej szklanej fiolki z przegrodą. Zapieczętować fiolkę, zaciskając nakrętkę. Użyj igły o rozmiarze 1.5 cala i rozmiarze 20, aby napełnić przestrzeń główki fiolki gazem dekafluorobutanem przez 30 sekund.

Połączyć fiolkę w celu wytworzenia ultradźwiękowych środków kontrastowych wypełnionych gazem perfluorobutanowym. Dodać 25 mikrolitrów roztworu ultradźwiękowego środka kontrastowego na jeden mililitr roztworu komórkowego. Następnie natychmiast przepompuj połączony środek kontrastowy i mieszaninę komórek przez urządzenie akustofluidyczne.

Protokół ten wytwarza system akustofluidyczny, który można wykorzystać do zwiększenia wewnątrzkomórkowego dostarczania molekularnego w wielu liniach komórkowych. Wewnątrzkomórkowe dostarczanie związku fluorescencyjnego, fluoresceiny, do pierwotnych ludzkich limfocytów T uległo poprawie dzięki leczeniu akustofluidycznemu w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. Intensywność fluorescencji limfocytów T wzrosła pięciokrotnie po leczeniu, co wskazuje na zwiększone dostarczanie fluoresceiny.

Żywotność komórek nieznacznie zmniejszyła się po leczeniu akustofluidycznym, ale pozostała powyżej 80%Leczenie akustofluidyczne zwiększyło wewnątrzkomórkowe dostarczanie związku konserwującego trehalozy do ludzkich komórek raka płuc A549 w porównaniu z samym przepływem i komórkami w nieleczonej grupie kontrolnej. Dodanie mikropęcherzyków kationowych do roztworu komórkowego ma kluczowe znaczenie. Wewnątrzkomórkowe dostarczanie biomolekuł będzie ograniczone bez mikropęcherzyków kationowych w roztworze.

Platforma ta umożliwia wewnątrzkomórkowe dostarczanie różnych biomolekuł, które mogą zmieniać funkcję komórkową w celach badawczych lub terapeutycznych. Po zakończeniu tej procedury można przeprowadzić dodatkową charakterystykę komórkową w celu oceny wpływu dostarczania różnych biomolekuł.