Name: Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii drożdży w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów. Ta metoda umożliwia śledzenie tysięcy mikrokolonii jednocześnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Naomi Ziv, Sashy Levy i Shuang Li za ich wkład w rozwój tego protokołu, Davidowi Greshamowi za udostępnienie sprzętu i Marissie Knoll za pomoc w produkcji wideo. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health w ramach grantu R35GM118170.

1. Przygotowanie Losowo Wybranych Płytek (Przed Dniem Eksperymentu)
<ol>
	<li>Zaplanuj szczepy i warunki, które mają być testowane za pomocą testu wzrostu. W tym momencie losowo przypisz szczepy i warunki do dowolnej studni. 
	UWAGA: Rozważając konfigurację płytki, zaleca się uwzględnienie więcej niż jednej powtórzonej próby na szczep i warunek wzrostu na jednej płytce, aby uwzględnić szum związany z odwiertem podczas pomiarów. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji.</li>
	<li>Obliczeniowo losowo dobieraj lokalizację każdego szczepu i warunki środowiskowe dla powtórzeń płytek, które będą uruchamiane w różnych dniach.</li>
	<li>Hodować wszystkie komórki, które zostaną użyte w eksperymencie, do nasycenia w pożywce z ekstraktem drożdżowym-peptonem-dekstrozą (YEPD; 2% glukozy) w wytrząsarce w temperaturze 30 °C (lub innej odpowiedniej temperatury).</li>
	<li>Twórz losowe tablice magazynowe ręcznie lub za pomocą robota do obsługi cieczy. Dodać 10 μl wyznaczonych nasyconych komórek do każdego dołka sterylnej płytki do hodowli tkankowej z dnem w kształcie litery U. Jeśli w jednym dołku będzie testowanych wiele szczepów, nie należy ich łączyć w tym momencie; To łączenie zostanie przeprowadzone tuż przed rozcieńczeniem komórek w dniu eksperymentu, aby upewnić się, że wszystkie szczepy mają prawidłowe stężenia po posianiu jako komórki założycielskie mikrokolonii.</li>
	<li>Dodaj 10 μl 30% glicerolu do każdego dołka każdej płytki. Pipetować w górę i w dół, aby komórki i glicerol dobrze się wymieszały.</li>
	<li>Każdą płytkę należy zamknąć foliową osłoną i natychmiast zamrozić w temperaturze -70 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Ważne jest, aby utworzyć wszystkie losowe płytki tego samego dnia i zamrozić je, tak aby warunki wstępnego wzrostu komórek na każdej płytce były identyczne i nie powodowały technicznych różnic w teście szybkości wzrostu.</li>
</ol>
2. Wstępny wzrost drożdży
UWAGA: Zazwyczaj zaczyna się to przed dniem eksperymentu i jest wysoce zależne od pytania eksperymentalnego. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać szczegółowe informacje.
<ol>
	<li>Wyjąć podstawową płytkę (10 μl drożdży, 10 μl glicerolu na studzienkę) z zamrażarki w temperaturze -70 °C i dodać 180 μl pożywki, która ma być użyta w doświadczeniu. Jeśli eksperyment będzie przeprowadzany przy użyciu pożywek ograniczających składniki odżywcze, nie należy wstępnie hodować drożdży do nasycenia w pożywce ograniczającej składniki odżywcze, ponieważ może dojść do zarodnikowania drożdży. Zamiast tego uprawiaj wstępnie na nieograniczających podłożach.</li>
	<li>Hodować drożdże, wytrząsając je w temperaturze 30 °C. Rozważyć, czy przeprowadzić test, zaczynając od komórek w fazie logarytmicznej, czy w fazie stacjonarnej, w celu określenia, czy konieczne będzie wielokrotne rozcieńczanie komórek przed eksperymentem. Jeśli oczekuje się, że szczepy drożdży lub warunki w teście będą miały znacznie różne tempo wzrostu, wówczas konieczny będzie dwudniowy okres wstępnego wzrostu, aby wszystkie różne warunki osiągnęły fazę stacjonarną.</li>
</ol>
3. Ustawienie mikroskopu
<ol>
	<li>Przygotowanie płytki mikroskopowej
	<ol>
		<li>Upewnij się, że inkubator mikroskopu jest włączony i ogrzewa komorę mikroskopu do żądanej temperatury wzrostu dla warunków doświadczalnych. W przypadku standardowych doświadczeń z wykorzystaniem komórek Saccharomyces cerevisiae, inkubator powinien podgrzać komorę mikroskopu do 30 °C, aby zapewnić, że warunki wzrostu komórek będą prawidłowe podczas oznaczania szybkości wzrostu.</li>
		<li>Zdezynfekuj stół warsztatowy, pipety i inne narzędzia za pomocą 70% etanolu. Wyjmij płytkę mikroskopu i połóż ją na stole na niestrzępiącej się i statycznej chusteczce. 
		UWAGA: Nigdy nie dotykaj dolnej części płytki mikroskopu, nawet w rękawiczkach, i zawsze kładź płytkę mikroskopu na niestrzępiącej się i statycznej chusteczce za każdym razem, gdy dotyka jakiejkolwiek powierzchni. Zapobiega to powstawaniu smug lub zadrapań, które utrudniają pomiary szybkości wzrostu podczas obrazowania eksperymentu.</li>
		<li>Rozmrozić 5 ml 5x roztworu konkanawaliny A, rozcieńczyć do 1x wodą i przefiltrować sterylizować przez strzykawkę wyposażoną w filtr 0,2 μm.</li>
		<li>Filtr Wysterylizuj wszystkie inne ciecze, które zostaną użyte w teście, za pomocą filtra 0,2 μm, w tym pożywki eksperymentalne, w celu usunięcia wszelkich kryształów lub zanieczyszczeń, które mogły zmaterializować się w roztworach. Obecność kryształów obniżyłaby jakość obrazów mikroskopowych.</li>
		<li>Odmierzyć pipetą 200 μl roztworu konkanawaliny A do każdej studzienki płytki mikroskopu.</li>
		<li>Wirować płytkę przez 2 minuty przy 411 x grawitacji (g) za pomocą niestrzępiącej się i statycznej chusteczki pod płytką, aby upewnić się, że roztwór konkanawaliny A równomiernie pokrywa dno każdej studzienki i że nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Przykryj talerz pokrywką i odstaw na 1-2 godziny. Dokładny czas, w którym płytka jest osadzona, jest elastyczny, ale ważne jest, aby zachować spójność między różnymi przebiegami eksperymentu.</li>
		<li>Usuń cały roztwór konkanawaliny A z talerza przez odsysanie lub przez mocne wylanie go do zlewu lub pojemnika. Uważaj, aby nie dotknąć szklanej części talerza. Dopuszczalne jest, jeśli w studzienkach pozostaną kilka kropli roztworu konkanawaliny A.</li>
		<li>Umyj studzienki płytki mikroskopu, dodając 400 μl sterylnej wody. Usuń wodę, tak jak w przypadku konkanawaliny A w poprzednim kroku. Nie pozwól, aby talerz pozostał suchy.</li>
		<li>Natychmiast dodaj 185 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej do płytki. Do tej płytki zostanie dodanych 15 μl prawidłowo rozcieńczonych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczenie komórek drożdży 
	UWAGA: Poniższe kroki opisują rozcieńczenie drożdży z nasyconej kultury (około 10-8 komórek/ml) 400-krotnie w celu uzyskania stężenia 250 000 komórek/ml, z czego 15 μl zostanie rozcieńczone do 400 μl na płytce ze szklanym dnem, co daje końcową liczbę około 4000 komórek na studzienkę w płytce 96-dołkowej. W przypadku stosowania płytki 384-dołkowej ostateczna liczba komórek na studzienkę powinna wynosić około 700, a rozcieńczenia należy odpowiednio dostosować. Stosunek ten należy dostosować do komórek pobranych w fazie logarytmicznej, rosnących w bogatszych lub uboższych pożywkach przedwzrostowych lub pochodzących z różnych szczepów. Końcowa gęstość komórek na studzienkę powinna zostać zmniejszona podczas przeprowadzania testu szybkości wzrostu dla okresów dłuższych niż 10 godzin.
	<ol>
		<li>Ustawić dwie 96-dołkowe płytki hodowlane do seryjnych rozcieńczeń: oznaczyć jako płytkę 1 i 2 i dodać 90 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej (tj. pożywki, w której drożdże będą rosły pod mikroskopem) do każdej płytki do rozcieńczania seryjnego. 
		UWAGA: Niezależnie od tego, jakie końcowe rozcieńczenie zostanie użyte, zaleca się co najmniej dwa seryjne rozcieńczenia komórek, w każdym z których niewielka objętość drożdży jest pipetowana do większej objętości pożywki doświadczalnej, a następnie energicznie miesza się dużą objętość pożywki doświadczalnej za pomocą pipety (jak w krokach 3.2.5 i 3.2.6 poniżej).</li>
		<li>Pobrać płytkę z komórkami ze wstępnego wzrostu i odwirować płytkę przez 2 minuty przy 411 x g. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie zanieczyszczać krzyżowo różnych studzienek w płycie. Celem tego etapu wirowania przed usunięciem pokrycia foliowego z płytek jest upewnienie się, że kropelki wypełnione drożdżami z jednej studzienki nie odlecą z folii i nie trafią do innych studzienek. Należy uważać, aby nigdy nie przechylać ani nie wstrząsać płytkami, aby uniknąć kontaktu drożdży z folią pokrytą po odwirowaniu.</li>
		<li>Ostrożnie odkleić folię i ponownie zawiesić komórki, energicznie pipetując komórki pipetą ustawioną na około połowę całkowitej objętości płytki, przesuwając pipetę po dołku w celu wymieszania. Sprawdź, czy wszystkie komórki zostały ponownie zawieszone na dnie studzienek.</li>
		<li>Jeżeli w poszczególnych studzienkach ma być użytych wiele szczepów, szczepy powinny być w tym czasie mieszane w proporcji niezbędnej do przeprowadzenia eksperymentu. Jeżeli do wygenerowania pomiarów szybkości wzrostu ma być użyty szczep odniesienia, stosunek odkształcenia odniesienia do szczepu testowego powinien wynosić 1:1.</li>
		<li>Odmierzyć pipetą 10 μl drożdży z pożywki wzrostowej na płytkę rozcieńczającą 1. Dodać 100 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 200 μl na studzienkę. Energicznie pipetować w górę i w dół.</li>
		<li>Odpipetować 10 μl drożdży z płytki 1 na płytkę 2. Dodać 100 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki i energicznie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. 
		UWAGA: Te etapy rozcieńczania mają kluczowe znaczenie, aby pomóc oddzielić skupiska drożdży, które są sklejone ze sobą pod koniec etapu wstępnego wzrostu i zapewnić, że w każdym dołku znajdzie się w przybliżeniu równa liczba komórek drożdży. Posiadanie stałej liczby drożdży w każdym dołku pomaga usunąć eksperymentalny szum i błędy w pomiarach szybkości wzrostu (patrz Reprezentatywne wyniki).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sonikacja 
	UWAGA: Sonikacja jest opcjonalna i musi być wykonywana tylko w przypadku szczepów drożdży, które mają dużą skłonność do przylegania do siebie (np. niektóre dzikie szczepy). W przypadku szczepów laboratoryjnych sonikacja na ogół nie jest konieczna i można ją pominąć, przechodząc do kroku 3.4.
	<ol>
		<li>Zdezynfekuj 96-pinową głowicę sonikatora 70% etanolem, umieszczając ją w 96-dołkowej płytce wypełnionej 70% etanolem i osusz chusteczką bez kłaczków i ładunków elektrostatycznych.</li>
		<li>Ustaw program sonikacji, który jest wystarczająco silny, aby rozbić flokulowane komórki drożdży, ale nie zabija komórek ani nie powoduje podwyższonych reakcji na stres. Niektóre testy mogą być wymagane w celu zidentyfikowania najlepszego programu sonikacji dla danego eksperymentu. Program sonikacyjny zastosowany w tym eksperymencie to: amplituda = 10, czas procesu = 10 s, impuls włączony = 1 s, impuls wyłączony = 1 s. Ten dokładny program prawdopodobnie nie ma zastosowania do wszystkich sonikatorów, dlatego sugeruje się przeprowadzenie testów przed dniem eksperymentu.</li>
		<li>Ponownie wymieszać drożdże na płytce do rozcieńczania seryjnego 2, energicznie pipetując pięć razy w górę i w dół.</li>
		<li>Umieść płytkę rozcieńczającą 2 na platformie i zabezpiecz ją kołkami sonitora w zawiesinie ogniwa, ale nie dotykając dolnej części płytki. Uruchom program sonikacji, używając odpowiedniej ochrony słuchu.</li>
		<li>Po uruchomieniu programu należy oczyścić głowicę sonikatora 70% etanolem, a następnie wodą, a następnie natychmiast przystąpić do przygotowania płytki mikroskopowej, aby komórki nie uległy ponownemu flokulacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj płytkę pod mikroskop:
	<ol>
		<li>Odpipetować 15 μl drożdży z płytki 2 do rozcieńczania seryjnego do objętości 200 μl. Dodać 200 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki do końcowej objętości 400 μl na studzienkę i energicznie pipetować w górę i w dół w celu wymieszania.</li>
		<li>Przykryj płytkę oddychającą membraną. Ważne jest, aby dobrze uszczelnić płytę tą membraną, na przykład za pomocą gumowego wałka.</li>
		<li>Aby przykleić komórki drożdży do konkanawaliny A na szklanej powierzchni, należy odwirować płytkę z niestrzępiącą się i statyczną chusteczką pod nią przez 2 minuty przy 411 x g.</li>
		<li>Pod mikroskopem przetrzyj górną i dolną część płytki niestrzępiącą się i statyczną chusteczką, a następnie wdmuchnij sprężone powietrze na płytkę, aby pozbyć się zanieczyszczeń.</li>
		<li>Umieść płytkę na mikroskopie, upewniając się, że jest wypoziomowana i że studzienka A1 znajduje się w lewym górnym rogu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiary tempa wzrostu w mikroskopii poklatkowej
UWAGA: Podczas mikroskopii poklatkowej następujące funkcje są sterowane komputerowo: pozycja x, y i z, przesłony i filtry fluorescencyjne. Sprzętowy system automatycznego ustawiania ostrości jest optymalny, aby zapobiec dryfowaniu płaszczyzny ogniskowej podczas obrazowania poklatkowego. Alternatywnie można użyć pętli automatycznego ustawiania ostrości opartej na oprogramowaniu. Aby utrzymać wilgotność w komorze mikroskopu, zaleca się trzymanie zlewki z oczyszczoną wodą w komorze przez cały czas trwania eksperymentu.
<ol>
	<li>Utwórz listę pozycji (x,y) do zobrazowania, tak aby każde gniazdo płytki mikroskopu było w pełni zobrazowane. Unikaj nakładania się obrazów, aby żadna komórka nie była analizowana wiele razy.</li>
	<li>Obraz w jasnym polu z oświetleniem diaskopowym (DIA) przy powiększeniu 15x. Ustaw ekspozycję na ~5 ms.</li>
	<li>Powiększ obraz cyfrowo, aby komórki były wyraźnie widoczne. Użyj pokręteł ostrości, aby określić idealną ostrość do eksperymentu w czterech dołkach w rogu płytki i w jednym dołku na środku płytki. Ustaw ostrość w taki sposób, aby uzyskać maksymalny kontrast komórek.</li>
	<li>Ustaw pozycję z (lub pozycję autofokusa) dla eksperymentu tak, aby była średnią pozycji z/autofokusa zidentyfikowanych dla każdej z tych studzienek. Jeśli płytka mikroskopu jest dobrze wykonana, a szklane dno nie ma wad, idealne pozycje ostrości powinny być podobne dla każdej studzienki. 
	UWAGA: Podczas analizowania obrazów za pomocą potoku analizy obrazów PIE (Processing Images Easily - Processing Images Easily - PIE) 11, 12 pomocne jest, aby komórki były nieco nieostre pod mikroskopem, tak aby na zewnątrz komórki znajdowała się ciemna obwódka, a wnętrze było jasne, co pomaga w dokładnym rozpoznawaniu kolonii i szacowaniu wielkości.</li>
	<li>Jeśli używasz odkształceń fluorescencyjnych, zidentyfikuj kanały i ekspozycje, za pomocą których chcesz obrazować, upewniając się, że żadne piksele nie są prześwietlone. Ustawiając czas ekspozycji dla kanałów fluorescencyjnych, wyłącz tryb "przechwytywania na żywo" w mikroskopie, aby uniknąć narażania komórek na wzbudzenie fluorescencyjne przez długi czas, ponieważ może to zarówno fotowybielać komórki, jak i powodować stres.</li>
	<li>Skonfiguruj akwizycję sekwencji czasowej, aby przechwytywać obrazy w żądanym interwale czasu przez żądany okres czasu.</li>
	<li>Uruchom eksperyment.</li>
</ol>

<ol><li>Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+condition-dependent+intracellular+protein+levels+enables+high-precision+fitness+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates.</a> PloS one. 8 (9), 75320(2013).</li>
<li>Kussell, E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+diversity%2C+population+growth%2C+and+information+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments.</a> Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>King, O. D., Masel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+bet-hedging+adaptations+to+rare+scenarios%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+population+biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios.</a> Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).</li>
<li>Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+switching+as+a+survival+strategy+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments.</a> Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).</li>
<li>Avery, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+cell+individuality+and+the+underlying+sources+of+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity.</a> Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS biology. 10 (5), 1001325(2012).</li>
<li>van Dijk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-growing+cells+within+isogenic+populations+have+increased+RNA+polymerase+error+rates+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage.</a> Nature communications. 6, 7972(2015).</li>
<li>Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+Complex+Genetic+Basis+of+Phenotypic+Variation+and+Variability+of+Cellular+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth.</a> Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).</li>
<li>Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+nongenetic+heterogeneity+in+growth+rate+and+stress+tolerance+of+Saccharomyces+cerevisiae+by+cyclic+AMP-regulated+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors.</a> PLoS genetics. 14 (11), 1007744(2018).</li>
<li>Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+colony+recognition+for+high-throughput+growth+analysis+from+suboptimal+low-magnification+brightfield+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Siegallab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://github.com/Siegallab/PIE">http://github.com/Siegallab/PIE</a> (2020).</li>
<li>Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+nongenetic+determinants+of+cell+growth+variation+assessed+by+high-throughput+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy.</a> Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).</li>
<li>Hall, D. W., Joseph, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+frequency+of+beneficial+mutations+across+multiple+fitness+components+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Saleemuddin, M., Husain, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concanavalin+A%3A+a+useful+ligand+for+glycoenzyme+immobilization--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+microbial+technology%22%5BJournal%5D)">Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review.</a> Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).</li>
<li>Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+details+in+the+distributions%3A+why+and+how+to+study+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability.</a> Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).</li>
<li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data%3A+a+practical+guide+for+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+reviews+of+the+Cambridge+Philosophical+Society%22%5BJournal%5D)">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).</li>
<li>Bolker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exemplary+and+surrogate+models%3A+two+modes+of+representation+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Perspectives+in+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology.</a> Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół jest wszechstronnym testem, który pozwala na jednoczesne monitorowanie wzrostu komórek i ekspresji genów na poziomie poszczególnych mikrokolonii. Połączenie tych dwóch modalności daje unikalne informacje biologiczne. Na przykład w poprzednich pracach wykorzystano ten test, aby wykazać ujemną korelację między ekspresją genu TSL1 a szybkością wzrostu mikrokolonii w izogenicznych komórkach typu dzikiego, mierząc oba jednocześnie 7,10....

Fenotypy wzrostu mają krytyczne znaczenie dla przystosowania drożdży. Dobór naturalny potrafi efektywnie rozróżnić linie różniące się tempem wzrostu o wartość odwrotną do efektywnej wielkości populacji, która może przekraczać 108 osobniki1Ponadto zmienność tempa wzrostu osobników w obrębie populacji jest parametrem istotnym z punktu widzenia ewolucyjnego, ponieważ może ona stanowić podstawę strategii przetrwania, takich jak zabezpieczenie ryzyka (ang. bet hedging).2,3,4,5,6Z tego względu testy umożliwiające wysoką dokładność pomiarów fenotypów wzrostu i ich rozkładów są kluczowe dla badania mikroorganizmów. Opisany tutaj test wzrostu mikrokolon pozwala na wygenerowanie indywidualnych pomiarów tempa wzrostu dla około 105 mikrokolonii na eksperyment. Niniejszy test stanowi zatem wydajny protokół do badania genetyki i genomiki ewolucyjnej drożdży. Szczególnie dobrze nadaje się on do badania sposobów generowania i utrzymywania zmienności w obrębie populacji genetycznie identycznych pojedynczych komórek oraz tego, w jaki sposób wpływa ona na dostosowanie populacji.7,8,9,10.
Opisana tutaj metoda (Rycina 1) wykorzystuje okresowo rejestrowane obrazy komórek rosnących w pożywce płynnej na szklanym dnie płytki 96- lub 384-dołkowej, wykonane w technice jasnego pola przy niskim powiększeniu, w celu śledzenia wzrostu mikrokolonii. Komórki przylegają do lektyny konkanawaliny A, która pokrywa dno płytki mikroskopowej, tworząc kolonie dwuwymiarowe. Ponieważ mikrokolonie rosną w jednej warstwie, powierzchnia mikrokolonii jest silnie skorelowana z liczbą komórek7. Dzięki temu za pomocą specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazu, które śledzi tempo zmian powierzchni każdej mikrokolonii, można uzyskać dokładne szacunki tempa wzrostu i czasu adaptacji (lag time). Ponadto układ doświadczalny pozwala monitorować obfitość, a nawet lokalizację subkomórkową białek znakowanych fluorescencyjnie, ekspresowanych w tych mikrokoloniach. Dalsze przetwarzanie danych z tego testu wzrostu mikrokolonii można przeprowadzić za pomocą własnych analiz lub istniejącego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Processing Images Easily (PIE)11 — algorytmu do stabilnego rozpoznawania powierzchni kolonii i wysokoprzepustowej analizy wzrostu na podstawie obrazów w jasnym polu przy niskim powiększeniu, który jest dostępny za pośrednictwem GitHub12.
Ponieważ szacunki tempa wzrostu uzyskane z testu wzrostu mikrokolon są generowane na podstawie dużej liczby pomiarów pojedynczych kolonii, są one niezwykle dokładne, a błędy standardowe są o kilka rzędów wielkości mniejsze niż same szacunki w eksperymencie o odpowiedniej skali. W związku z tym test ten wykazuje wysoką moc w wykrywaniu różnic w tempie wzrostu między różnymi genotypami, sposobami traktowania lub warunkami środowiskowymi. Format płytki wielodołkowej pozwala na porównanie licznych kombinacji środowiskowych i genotypowych w ramach jednego eksperymentu. Jeśli szczepy konstytutywnie ekspresują różne markery fluorescencyjne, można je zmieszać w tym samym dołku i rozróżnić podczas późniejszej analizy obrazu, co mogłoby dodatkowo zwiększyć moc testu poprzez umożliwienie normalizacji danych w obrębie każdego dołka.
<img alt="Proces wzrostu komórek i mikroskopii. Schemat randomizacji płytek, rozcieńczania i etapów inkubacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczna reprezentacja protokołu. Protokół ten składa się z dwóch głównych etapów: przygotowania płytki eksperymentalnej oraz przygotowania komórek do obrazowania. Randomizacja płytek i hodowla komórek powinny zostać przeprowadzone przed dniem eksperymentu i w okresie bezpośrednio go poprzedzającym. Wielokrotne mieszanie komórek na każdym etapie rozcieńczania jest niezbędne aż do momentu wysiewania; dlatego zaleca się, aby w pierwszej kolejności przygotować płytkę eksperymentalną, tak aby była gotowa do wysiewu natychmiast po zakończeniu rozcieńczania komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>General Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL Filtr butelkowy .22 i mikro; m PES Sterylizacja, niskie wiązanie białek, z szyjką 45 mm</td><td>Fisher</td><td>CLS431154</td><td>służy do filtrowania pożywki</td></tr><tr><td>BD Falcon*Płytki do hodowli tkankowych, mikrotest U-bottom</td><td>Fisher</td><td>08-772-54</td><td>96-dołkowe probówki hodowlane używane do zamrażania komórek, komórek przed wzrostem i rozcieńczania</td></tr><tr><td>Strzykawki BD bez igły, 50 ml</td><td>Fisher</td><td>13-689-8</td><td>Służy do filtrowania</td></tr><tr><td>sterylnych jednorazowych zbiorników na odczynniki Concanavalin A Costar</td><td>Zbiorniki</td> na odczynniki Fisher <td>07-200-127</td><td>używane do pipetowania roztworów za pomocą pipety wielokanałowej</td></tr><tr><td>Aluminiowa taśma uszczelniająca Costar Thermowell</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>96-dołkowa uszczelka płytkowa do wstępnego wzrostu i zamrażania</td></tr><tr><td>kłaczków i ładunków elektrostatycznych Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>06-666A</td><td>Chusteczki wolne od kłaczków i ładunków elektrostatycznych, aby dno płytki mikroskopu było wolne od zanieczyszczeń i zadrapań</td></tr><tr><td>Filtry</td> <td>strzykawkowe NalgeneThermoFisher Scientific</td><td>199-2020</td><td>0,2 &mu; m wielkość porów, średnica 25 mm; służy do filtrowania roztworu konkanawaliny A</td></tr> <tr><td>Media Składniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimalnie zdefiniowane chemicznie pożywki (MD; 2% glukozy)</td><td></td><td></td> <td>alternatywne podłoża mikroskopowe stosowane do wstępnego wzrostu i wzrostu drożdży podczas mikroskopii</td></tr><tr><td>Syntetyczne kompletne podłoża mikroskopowe (SC; 2% glukozy)</td><td></td><td></td> <td>stosowane do wstępnego wzrostu i wzrostu drożdży podczas mikroskopii</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza (YEPD; 2% glukozy) średni</td><td></td><td></td><td>wzrost komórek przed zamrożeniem randomizowanych płytek</td></tr> <tr><td> Materiały mikroskopowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy membrana uszczelniająca</td><td>Oddychające membrany Millipore Sigma</td><td>Z380059-1PAK</td><td>używane do uszczelniania płytki podczas eksperymentu mikroskopowego. Na tym etapie zalecane są membrany oddychające, ponieważ zapobiegają one kondensacji pary wodnej w studzienkach i pozwalają na uzyskanie lepszych obrazów mikroskopowych</td></tr><tr><td>Brooks 96-well płaska płytka mikroskopowa z przezroczystego szkła</td><td>Dot Scientific</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td>Płytka mikroskopowa</td></tr><tr><td>Concanavalin A z canavalia ensiformis (Jack Bean), liofilizowany proszek</td><td>Millipore Sigma</td><td>45-C2010-1G</td><td>Przygotować 5x roztwór konkanawaliny A i zamrozić 5 ml 5x konkanawaliny A w 50 ml stożkowych probówkach w temperaturze -80 & stopni; Używane</td></tr> <tr><td>szczepy C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132</td><td></td><td></td><td>Szczepy akumulacji mutacji haploidalnych w tle laboratoryjnym, opisane w Hall and Joseph 2010</td></tr><tr><td>EP026.2A-2C</td><td></td><td></td><td>Potomstwo przodka Halla i Josepha 2010 szczep akumulacji mutacji, przekształcony za pomocą YFR054c&Delta;::Scw11P: :GFP</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator S-4000 z 96-pinową nasadką</td><td></td><td></td><td>Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E z systemem</td><td></td><td></td> Perfect Focus <td>Mikroskop odwrócony z automatycznym stolikiem i systemem autofokusa</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Precyzyjne pomiary niejednorodności między i wewnątrz szczepów w tempie wzrostu mikroorganizmów są niezbędne do zrozumienia genetycznych i środowiskowych czynników wpływających na tolerancję na stres, chorobotwórczość i inne kluczowe składniki sprawności. Ten manuskrypt opisuje test oparty na mikroskopie, który śledzi około 105 mikrokolonii Saccharomyces cerevisiae na eksperyment. Po zautomatyzowanym obrazowaniu poklatkowym drożdży unieruchomionych na płytce wielodołkowej, tempo wzrostu mikrokolonii można łatwo przeanalizować za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy obrazu. Dla każdej mikrokolonii można również monitorować ekspresję i lokalizację białek fluorescencyjnych oraz przeżywalność ostrego stresu. Test ten pozwala na precyzyjne oszacowanie średniego tempa wzrostu szczepów, a także kompleksowy pomiar niejednorodności wzrostu, ekspresji genów i tolerancji na stres w populacjach klonów.

Nowością w tym protokole jest możliwość obliczenia szybkości wzrostu dla poszczególnych komórek w obrębie populacji poprzez śledzenie ich rozwoju w mikrokolonie za pomocą obrazowania poklatkowego (Ryc. 2A). Ponieważ mikrokolonie rosną przez wiele godzin w sposób płaski dzięki obecności konkanawaliny A, ich powierzchnie mogą być monitorowane przez cały czas trwania eksperymentu, a dopasowanie liniowe do zmiany logarytmu naturalnego powierzchni w czasie może służyć do obliczenia szybkości wzro...

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Nasz protokół dla wysokowydajnych komórek drożdży umożliwia śledzenie wzrostu i ekspresji genów dla tysięcy mikrokolonii jednocześnie. Różnice między szczepami, między środowiskami, a nawet między genetycznie identycznymi komórkami hodowanymi we wspólnym środowisku mogą być określone ilościowo. Protokół dostarcza precyzyjnych szacunków średniego tempa wzrostu i średniej intensywności fluorescencji reporterów ekspresji genów.Ponadto, ponieważ testuje się tak wiele pojedynczych mikrokolonii, uzyskuje się precyzyjne szacunki całkowitych rozkładów wartości wzrostu i ekspresji. Protokół ten składa się z dwóch głównych etapów: przygotowania płytki doświadczalnej i przygotowania komórek do obrazowania. Komórki należy posiać natychmiast po rozcieńczeniu i wymieszaniu.Dlatego zalecamy najpierw ustawienie płytki eksperymentalnej. Zauważysz powtarzające się mieszanie komórek w całym tym protokole, co jest niezwykle ważne na kolejnych etapach aż do posiewu. W dniu eksperymentu wszystkie pożywki i inne roztwory użyte do testu muszą zostać przefiltrowane filtrem dwumikronowym, nawet jeśli są już sterylne, w celu usunięcia wszelkich kryształów, które mogą pojawić się na obrazach mikroskopowych.Obejmuje to pożywki eksperymentalne i roztwór Concanavalin A. Następnie przygotuj płytkę mikroskopu. Aby szklana powierzchnia studzienek była wolna od zanieczyszczeń i zadrapań, zawsze trzymaj pod płytą chusteczkę bez kłaczków i ładunków elektrostatycznych.Użyj sterylnej techniki na wysterylizowanej ławce. Przefiltruj 25 mililitrów roztworu 1X Concanavalin A i odpipetuj 200 mikrolitrów do każdej studzienki płytki mikroskopu. Zalecamy ustabilizowanie pipety, aby zapewnić odpowiednią wysokość.Odwirować płytkę mikroskopu z chusteczką niestrzępiącą się i nieelektrostatyczną znajdującą się pod nią przez dwie minuty w temperaturze 411 razy G, w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków powietrza, które mogłyby uniemożliwić równomierne pokrycie dna studzienek przez konkanawalinę A. Pozostawić płytkę zawierającą roztwór Concanavalin A na jedną do dwóch godzin. Zachowaj spójność we wszystkich eksperymentach.Po inkubacji konkanawaliny A należy usunąć konkanawalinę A z płytki 96-dołkowej za pomocą urządzenia ssącego lub przez mocne wylanie roztworu z płytki, jak pokazano tutaj. Niektóre kropelki pozostaną. Następnie umyj studzienki, dodając do każdej studzienki 400 mikrolitrów sterylnej wody.Dodać wodę natychmiast po usunięciu roztworu Concanavalin A. Nie pozwól, aby talerz pozostał suchy. Ważne jest, aby unikać dotykania końcówkami pipet powlekanego dna płytki, aby nie przemieścić ani nie usunąć Concanavalin A ze szklanej powierzchni studzienek.Usuń wodę w taki sam sposób, jak roztwór Concanavalin A i natychmiast dodaj 185 mikrolitrów pożywki eksperymentalnej do płytki mikroskopu. Nie pozwól, aby talerz pozostał suchy. Płytka jest teraz gotowa do dodania 50 mikrolitrów rozcieńczonych komórek.Odzyskaj swoją wstępnie wyhodowaną losową 96-dołkową płytkę. Twoje pytanie eksperymentalne określi, czy komórki są nasycone, czy w fazie logarytmicznej oraz liczbę randomizowanych powtórzeń, które należy zastosować w teście. Wiruj płytkę przez dwie minuty w temperaturze 411 razy G, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego podczas usuwania pokrycia foliowego.Pamiętaj, aby nigdy nie przechylać talerza podczas jego obsługi. Jeśli drożdże i pożywka wejdą w kontakt z folią pokrywającą płytkę, może dojść do zanieczyszczenia w poprzek studzienek. Najpierw przygotuj płytki, na których będziesz przeprowadzać swoje seryjne rozcieńczenia.Dodaj 90 mikrolitrów pożywki eksperymentalnej do każdej z płytek rozcieńczających. Następnie przygotuj swoje komórki. Zachowaj szczególną ostrożność podczas zdejmowania folii z płytki 96-dołkowej, aby zapobiec przedostawaniu się kropelek z jednego dołka do drugiego.Drożdże zostaną skoncentrowane na dnie płytki w wyniku odwirowania. Aby upewnić się, że komórki są dobrze wymieszane podczas rozcieńczania, zawsze dodawaj małą objętość komórek do większej objętości pożywki. Następnie dodaj kolejną dużą objętość pożywki do mieszanki.Pamiętaj, aby energicznie mieszać pipetami na każdym kroku. W tym filmie przeprowadziliśmy rozcieńczenia komórek drożdży przy nasyceniu i syntetycznych kompletnych pożywkach, które rozcieńczymy 10 000 razy, aby osiągnąć końcowe stężenie około 4 000 komórek na studzienkę na płytce mikroskopowej. Aby ponownie zawiesić komórki, energicznie pipetuj w górę i w dół, a następnie przesuwaj końcówkę pipety wokół studzienki ruchem okrężnym.Po wymieszaniu nie powinny pozostać żadne ślady osiadłych drożdży w żadnej studzience, jak to widać tutaj w studzience A1. Wszystkie inne pokazane tutaj studnie nie zostały ponownie zawieszone dla porównania. Policz komórki na swojej wstępnie wyhodowanej płytce, na przykład za pomocą hemocytometru, i połącz z dowolnym innym szczepem, który dodasz do tej samej studni w równych proporcjach. Tutaj mieszamy komórki z naszej wstępnie wyhodowanej płytki z fluorescencyjnym szczepem referencyjnym w stosunku jeden do jednego.Po standaryzacji stężeń komórek dodaj dziesięć mikrolitrów komórek do pierwszej płytki do rozcieńczania szeregowego. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki do końcowej objętości 200 mikrolitrów. Po dodaniu komórek i pożywki należy energicznie mieszać pipety, przesuwając końcówkę pipety wokół studzienek ruchem okrężnym.Od tego momentu, dopóki komórki nie zostaną dodane do płytki mikroskopu, szybko postępuj zgodnie z protokołem. Następnie dodać dziesięć mikrolitrów drożdży z pierwszej płytki do rozcieńczania szeregowego do drugiej płytki do rozcieńczania szeregowego. Następnie dodaj do tego 100 mikrolitrów pożywki eksperymentalnej.Dobrze wymieszaj. Jeśli twoje drożdże nie mają tendencji do flokulacji, są gotowe do dodania do płytki mikroskopu bezpośrednio po tym kroku. Natychmiast przejdź do galwanizacji.Jeśli jednak używane szczepy drożdży mają umiarkowaną tendencję do flokulacji, konieczny będzie następujący opcjonalny etap sonikacji. W przypadku sonikacji, najpierw pipetą wymieszaj roztwór drożdży jeszcze raz, przed sonikacją. Umieść rozcieńczone drożdże na sonikatorze i zanurz 96-dołkowe kołki w roztworze każdej studzienki, ale nie dotykając dna studzienki.Ustaw program sonikacji, który jest wystarczająco silny, aby rozbić flokulowane komórki drożdży, ale nie zabija komórek ani nie powoduje podwyższonych reakcji na stres. Niektóre testy mogą być wymagane w celu zidentyfikowania najlepszego programu sonikacji dla danego eksperymentu. Po zakończeniu programu usuń komórki i natychmiast przejdź do następnego kroku.Dodać 15 mikrolitrów drożdży z drugiej płytki do rozcieńczania szeregowego do płytki mikroskopu. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, ale rób to ostrożnie, aby nie naruszyć Concanavalin A przymocowanego do dna dołków płytki. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki eksperymentalnej do końcowej objętości 400 mikrolitrów na płytkę mikroskopu.Ostrożnie mieszać pipetą. Przykryj płytkę oddychającą membraną. Upewnij się, że krawędzie płyty są dobrze uszczelnione.Odwirować płytkę mikroskopu z kłaczkami i tkanką wolną od ładunków elektrostatycznych pod nią przez dwie minuty w temperaturze 411 razy G, aby komórki drożdży przyłączyły się do konkanawaliny A znajdującej się na dnie płytki. Płyta jest teraz gotowa do obrazowania. Pod mikroskopem przetrzyj górną i dolną część płytki chusteczką niestrzępiącą się i nieelektryzującą się, a następnie wdmuchnij sprężone powietrze na spód płytki, aby usunąć zanieczyszczenia.Umieść płytkę na mikroskopie. Upewnij się, że studzienka A1 znajduje się w lewym górnym rogu i że mikroskop jest podgrzany do temperatury odpowiedniej do wzrostu komórek. Upewnij się również, że płytka jest starannie schowana w mikroskopie i że spód płytki jest płaski.Jeśli płytka ma plastikową osłonę, zdejmij ją przed rozpoczęciem mikroskopii. Będzie to ważne, aby uchwycić dobre obrazy do dalszej analizy. Ładujemy automatycznie wygenerowany plik ze współrzędnymi X i Y oraz pozycjami ogniskowej, aby zobrazować całą płytkę mikroskopu.Jeśli używasz wstępnie wygenerowanego pliku, sprawdź wyrywkowo kilka pozycji na płytce mikroskopu, aby upewnić się, że komórki znajdują się we właściwej płaszczyźnie ogniskowej. Pomocne jest, aby płaszczyzna ogniskowej znajdowała się nieco powyżej komórek, tak aby były otoczone ciemną obwódką i były jaśniejsze niż tło. Ustaw liczbę punktów czasowych i odstępy między punktami czasu, które będą używane w eksperymencie.Jeśli zbierasz zarówno dane dotyczące szybkości wzrostu, jak i intensywności fluorescencji, skonfiguruj również program do obrazowania fluorescencji. Dostosuj jasność w każdym kanale, który ma być obrazowany, tak, aby żadna pozycja na płycie mikroskopu nie była prześwietlona. Przetestuj ekspozycję, której będziesz używać, gdy nie jesteś w trybie na żywo.W przypadku obrazów fluorescencyjnych fluorescencja powinna być widoczna gołym okiem. W przeciwnym razie zalecamy ustawienie niskich wartości ekspozycji. Odpowiednio rozmieszczone kolonie wysiane przez poszczególne komórki rosną w monowarstwie wzdłuż powierzchni płytki.W rezultacie, zautomatyzowana analiza obrazu może być wykorzystana do dokładnego obliczenia tempa wzrostu dla wielu pojedynczych mikrokolonii. Markery fluorescencyjne mogą być używane do różnicowania wielu szczepów rosnących w tej samej studni. W rezultacie można obliczyć pełne rozkłady tempa wzrostu dla poszczególnych mikrokolonii rosnących we wspólnym środowisku.Duże rozmiary próbek, które można osiągnąć w tym eksperymencie, pozwalają również na precyzyjne oszacowanie średnich różnic między różnymi szczepami lub warunkami wzrostu. W tym miejscu pokazano tempo wzrostu dla sparowanych zestawów kolonii wyhodowanych w pojedynczych studzienkach z zestawu linii akumulacji mutacji oraz referencyjnych kolonii kontrolnych GFP w studni. Jeśli na płytce mikroskopu zaobserwuje się zlepianie się komórek, grudki muszą zostać rozbite przez sonikację przed posiewem.Komórki w grudkach, które nie zostaną rozbite, nie będą rosły w płaskiej mikrokolonii wzdłuż powierzchni płytki, co uniemożliwia prawidłowe obliczenie szybkości wzrostu. Nie wszystkie pożywki są zgodne z testem szybkości wzrostu mikrokolonii. Niektóre formy pożywki, w tym pożywki zawierające ekstrakt drożdżowy lub o niskim pH, zapobiegają wiązaniu się komórek z konkanawaliną A. Powoduje to odpływ komórek od rosnących mikrokolonii w trakcie eksperymentu i błędne pomiary szybkości wzrostu.Ważne jest, aby unikać zbyt gęstego powlekania komórek. Gdy komórki są posiane zbyt blisko, szybciej rosnące mikrokolonie łączą się we wcześniejszych punktach czasowych, co pokazuje się tutaj jako utrata śledzenia kolorów. Efekt ten może zniekształcić szacunki tempa wzrostu, ponieważ wolno rosnące kolonie są mniej skłonne do łączenia się z sąsiadami, zanim zostaną zebrane dane z wystarczającej liczby punktów czasowych.W zależności od warunków wzrostu, podzbiór komórek może przejść fazę opóźnienia przed rozpoczęciem wzrostu. Ważne jest, aby wziąć to pod uwagę przy użyciu obszarów kolonii do obliczania tempa wzrostu, a nie dopasowywania krzywej wzrostu do wszystkich dostępnych punktów czasowych. Opisany protokół może być wykorzystany do zbadania szerokiego zakresu pytań związanych ze wzrostem i ewolucją drożdży.Jego elastyczny format mikropłytki oznacza, że można go dostosować do innych gatunków drożdży, różnych warunków wzrostu, innych drobnoustrojów i potencjalnie innych komórek w hodowli.

high-throughput-live-imaging-microcolonies-to-measure-heterogeneity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), do obrazowania produkcji cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia stochastycznej dynamiki ekspresji czynnika transkrypcyjnego, represora λ CI 1.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

ScanLag to wysokoprzepustowa metoda pomiaru opóźnienia wzrostu, a mianowicie czasu opóźnienia, a także tempa wzrostu kolonii dla tysięcy komórek równolegle. Badania przesiewowe za pomocą ScanLag umożliwiają rozróżnienie między długim czasem opóźnienia a powolnym wzrostem na poziomie pojedynczego wariantu.

ScanLag: Wysokoprzepustowa kwantyfikacja wzrostu kolonii i czasu opóźnienia

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Wzrost kultur bakterii znakowanych radioaktywnie w mikromiareczkowych szalkach ułatwia pobieranie próbek o wysokiej przepustowości, co pozwala na wiele technicznych i biologicznych testów replikacji obfitości puli nukleotydów, w tym (p)ppGpp. Można monitorować skutki przemian wzrostowych wywołanych przez źródła stresu fizjologicznego, a także powrót do zdrowia po stresie.

Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Ta metoda określa ilościowo obfitość mikroorganizmów za pomocą formatu 96-dołkowej płytki do płytek tworzących kolonie (CFU) i jest stosowana do mikrobiomu Drosophila w próbkach homogenatu całych much. Jednostki CFU są zliczane za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu, które jest dostępne tutaj.

Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Poznaj wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii drożdży w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów. Ta metoda umożliwia śledzenie tysięcy mikrokolonii jednocześnie.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Przeglądaj więcej filmów