Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Nasz protokół dla wysokowydajnych komórek drożdży umożliwia śledzenie wzrostu i ekspresji genów dla tysięcy mikrokolonii jednocześnie. Różnice między szczepami, między środowiskami, a nawet między genetycznie identycznymi komórkami hodowanymi we wspólnym środowisku mogą być określone ilościowo. Protokół dostarcza precyzyjnych szacunków średniego tempa wzrostu i średniej intensywności fluorescencji reporterów ekspresji genów.

Ponadto, ponieważ testuje się tak wiele pojedynczych mikrokolonii, uzyskuje się precyzyjne szacunki całkowitych rozkładów wartości wzrostu i ekspresji. Protokół ten składa się z dwóch głównych etapów: przygotowania płytki doświadczalnej i przygotowania komórek do obrazowania. Komórki należy posiać natychmiast po rozcieńczeniu i wymieszaniu.

Dlatego zalecamy najpierw ustawienie płytki eksperymentalnej. Zauważysz powtarzające się mieszanie komórek w całym tym protokole, co jest niezwykle ważne na kolejnych etapach aż do posiewu. W dniu eksperymentu wszystkie pożywki i inne roztwory użyte do testu muszą zostać przefiltrowane filtrem dwumikronowym, nawet jeśli są już sterylne, w celu usunięcia wszelkich kryształów, które mogą pojawić się na obrazach mikroskopowych.

Obejmuje to pożywki eksperymentalne i roztwór Concanavalin A. Następnie przygotuj płytkę mikroskopu. Aby szklana powierzchnia studzienek była wolna od zanieczyszczeń i zadrapań, zawsze trzymaj pod płytą chusteczkę bez kłaczków i ładunków elektrostatycznych.

Użyj sterylnej techniki na wysterylizowanej ławce. Przefiltruj 25 mililitrów roztworu 1X Concanavalin A i odpipetuj 200 mikrolitrów do każdej studzienki płytki mikroskopu. Zalecamy ustabilizowanie pipety, aby zapewnić odpowiednią wysokość.

Odwirować płytkę mikroskopu z chusteczką niestrzępiącą się i nieelektrostatyczną znajdującą się pod nią przez dwie minuty w temperaturze 411 razy G, w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków powietrza, które mogłyby uniemożliwić równomierne pokrycie dna studzienek przez konkanawalinę A. Pozostawić płytkę zawierającą roztwór Concanavalin A na jedną do dwóch godzin. Zachowaj spójność we wszystkich eksperymentach.

Po inkubacji konkanawaliny A należy usunąć konkanawalinę A z płytki 96-dołkowej za pomocą urządzenia ssącego lub przez mocne wylanie roztworu z płytki, jak pokazano tutaj. Niektóre kropelki pozostaną. Następnie umyj studzienki, dodając do każdej studzienki 400 mikrolitrów sterylnej wody.

Dodać wodę natychmiast po usunięciu roztworu Concanavalin A. Nie pozwól, aby talerz pozostał suchy. Ważne jest, aby unikać dotykania końcówkami pipet powlekanego dna płytki, aby nie przemieścić ani nie usunąć Concanavalin A ze szklanej powierzchni studzienek.

Usuń wodę w taki sam sposób, jak roztwór Concanavalin A i natychmiast dodaj 185 mikrolitrów pożywki eksperymentalnej do płytki mikroskopu. Nie pozwól, aby talerz pozostał suchy. Płytka jest teraz gotowa do dodania 50 mikrolitrów rozcieńczonych komórek.

Odzyskaj swoją wstępnie wyhodowaną losową 96-dołkową płytkę. Twoje pytanie eksperymentalne określi, czy komórki są nasycone, czy w fazie logarytmicznej oraz liczbę randomizowanych powtórzeń, które należy zastosować w teście. Wiruj płytkę przez dwie minuty w temperaturze 411 razy G, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego podczas usuwania pokrycia foliowego.

Pamiętaj, aby nigdy nie przechylać talerza podczas jego obsługi. Jeśli drożdże i pożywka wejdą w kontakt z folią pokrywającą płytkę, może dojść do zanieczyszczenia w poprzek studzienek. Najpierw przygotuj płytki, na których będziesz przeprowadzać swoje seryjne rozcieńczenia.

Dodaj 90 mikrolitrów pożywki eksperymentalnej do każdej z płytek rozcieńczających. Następnie przygotuj swoje komórki. Zachowaj szczególną ostrożność podczas zdejmowania folii z płytki 96-dołkowej, aby zapobiec przedostawaniu się kropelek z jednego dołka do drugiego.

Drożdże zostaną skoncentrowane na dnie płytki w wyniku odwirowania. Aby upewnić się, że komórki są dobrze wymieszane podczas rozcieńczania, zawsze dodawaj małą objętość komórek do większej objętości pożywki. Następnie dodaj kolejną dużą objętość pożywki do mieszanki.

Pamiętaj, aby energicznie mieszać pipetami na każdym kroku. W tym filmie przeprowadziliśmy rozcieńczenia komórek drożdży przy nasyceniu i syntetycznych kompletnych pożywkach, które rozcieńczymy 10 000 razy, aby osiągnąć końcowe stężenie około 4 000 komórek na studzienkę na płytce mikroskopowej. Aby ponownie zawiesić komórki, energicznie pipetuj w górę i w dół, a następnie przesuwaj końcówkę pipety wokół studzienki ruchem okrężnym.

Po wymieszaniu nie powinny pozostać żadne ślady osiadłych drożdży w żadnej studzience, jak to widać tutaj w studzience A1. Wszystkie inne pokazane tutaj studnie nie zostały ponownie zawieszone dla porównania. Policz komórki na swojej wstępnie wyhodowanej płytce, na przykład za pomocą hemocytometru, i połącz z dowolnym innym szczepem, który dodasz do tej samej studni w równych proporcjach. Tutaj mieszamy komórki z naszej wstępnie wyhodowanej płytki z fluorescencyjnym szczepem referencyjnym w stosunku jeden do jednego.

Po standaryzacji stężeń komórek dodaj dziesięć mikrolitrów komórek do pierwszej płytki do rozcieńczania szeregowego. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki do końcowej objętości 200 mikrolitrów. Po dodaniu komórek i pożywki należy energicznie mieszać pipety, przesuwając końcówkę pipety wokół studzienek ruchem okrężnym.

Od tego momentu, dopóki komórki nie zostaną dodane do płytki mikroskopu, szybko postępuj zgodnie z protokołem. Następnie dodać dziesięć mikrolitrów drożdży z pierwszej płytki do rozcieńczania szeregowego do drugiej płytki do rozcieńczania szeregowego. Następnie dodaj do tego 100 mikrolitrów pożywki eksperymentalnej.

Dobrze wymieszaj. Jeśli twoje drożdże nie mają tendencji do flokulacji, są gotowe do dodania do płytki mikroskopu bezpośrednio po tym kroku. Natychmiast przejdź do galwanizacji.

Jeśli jednak używane szczepy drożdży mają umiarkowaną tendencję do flokulacji, konieczny będzie następujący opcjonalny etap sonikacji. W przypadku sonikacji, najpierw pipetą wymieszaj roztwór drożdży jeszcze raz, przed sonikacją. Umieść rozcieńczone drożdże na sonikatorze i zanurz 96-dołkowe kołki w roztworze każdej studzienki, ale nie dotykając dna studzienki.

Ustaw program sonikacji, który jest wystarczająco silny, aby rozbić flokulowane komórki drożdży, ale nie zabija komórek ani nie powoduje podwyższonych reakcji na stres. Niektóre testy mogą być wymagane w celu zidentyfikowania najlepszego programu sonikacji dla danego eksperymentu. Po zakończeniu programu usuń komórki i natychmiast przejdź do następnego kroku.

Dodać 15 mikrolitrów drożdży z drugiej płytki do rozcieńczania szeregowego do płytki mikroskopu. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, ale rób to ostrożnie, aby nie naruszyć Concanavalin A przymocowanego do dna dołków płytki. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki eksperymentalnej do końcowej objętości 400 mikrolitrów na płytkę mikroskopu.

Ostrożnie mieszać pipetą. Przykryj płytkę oddychającą membraną. Upewnij się, że krawędzie płyty są dobrze uszczelnione.

Odwirować płytkę mikroskopu z kłaczkami i tkanką wolną od ładunków elektrostatycznych pod nią przez dwie minuty w temperaturze 411 razy G, aby komórki drożdży przyłączyły się do konkanawaliny A znajdującej się na dnie płytki. Płyta jest teraz gotowa do obrazowania. Pod mikroskopem przetrzyj górną i dolną część płytki chusteczką niestrzępiącą się i nieelektryzującą się, a następnie wdmuchnij sprężone powietrze na spód płytki, aby usunąć zanieczyszczenia.

Umieść płytkę na mikroskopie. Upewnij się, że studzienka A1 znajduje się w lewym górnym rogu i że mikroskop jest podgrzany do temperatury odpowiedniej do wzrostu komórek. Upewnij się również, że płytka jest starannie schowana w mikroskopie i że spód płytki jest płaski.

Jeśli płytka ma plastikową osłonę, zdejmij ją przed rozpoczęciem mikroskopii. Będzie to ważne, aby uchwycić dobre obrazy do dalszej analizy. Ładujemy automatycznie wygenerowany plik ze współrzędnymi X i Y oraz pozycjami ogniskowej, aby zobrazować całą płytkę mikroskopu.

Jeśli używasz wstępnie wygenerowanego pliku, sprawdź wyrywkowo kilka pozycji na płytce mikroskopu, aby upewnić się, że komórki znajdują się we właściwej płaszczyźnie ogniskowej. Pomocne jest, aby płaszczyzna ogniskowej znajdowała się nieco powyżej komórek, tak aby były otoczone ciemną obwódką i były jaśniejsze niż tło. Ustaw liczbę punktów czasowych i odstępy między punktami czasu, które będą używane w eksperymencie.

Jeśli zbierasz zarówno dane dotyczące szybkości wzrostu, jak i intensywności fluorescencji, skonfiguruj również program do obrazowania fluorescencji. Dostosuj jasność w każdym kanale, który ma być obrazowany, tak, aby żadna pozycja na płycie mikroskopu nie była prześwietlona. Przetestuj ekspozycję, której będziesz używać, gdy nie jesteś w trybie na żywo.

W przypadku obrazów fluorescencyjnych fluorescencja powinna być widoczna gołym okiem. W przeciwnym razie zalecamy ustawienie niskich wartości ekspozycji. Odpowiednio rozmieszczone kolonie wysiane przez poszczególne komórki rosną w monowarstwie wzdłuż powierzchni płytki.

W rezultacie, zautomatyzowana analiza obrazu może być wykorzystana do dokładnego obliczenia tempa wzrostu dla wielu pojedynczych mikrokolonii. Markery fluorescencyjne mogą być używane do różnicowania wielu szczepów rosnących w tej samej studni. W rezultacie można obliczyć pełne rozkłady tempa wzrostu dla poszczególnych mikrokolonii rosnących we wspólnym środowisku.

Duże rozmiary próbek, które można osiągnąć w tym eksperymencie, pozwalają również na precyzyjne oszacowanie średnich różnic między różnymi szczepami lub warunkami wzrostu. W tym miejscu pokazano tempo wzrostu dla sparowanych zestawów kolonii wyhodowanych w pojedynczych studzienkach z zestawu linii akumulacji mutacji oraz referencyjnych kolonii kontrolnych GFP w studni. Jeśli na płytce mikroskopu zaobserwuje się zlepianie się komórek, grudki muszą zostać rozbite przez sonikację przed posiewem.

Komórki w grudkach, które nie zostaną rozbite, nie będą rosły w płaskiej mikrokolonii wzdłuż powierzchni płytki, co uniemożliwia prawidłowe obliczenie szybkości wzrostu. Nie wszystkie pożywki są zgodne z testem szybkości wzrostu mikrokolonii. Niektóre formy pożywki, w tym pożywki zawierające ekstrakt drożdżowy lub o niskim pH, zapobiegają wiązaniu się komórek z konkanawaliną A. Powoduje to odpływ komórek od rosnących mikrokolonii w trakcie eksperymentu i błędne pomiary szybkości wzrostu.

Ważne jest, aby unikać zbyt gęstego powlekania komórek. Gdy komórki są posiane zbyt blisko, szybciej rosnące mikrokolonie łączą się we wcześniejszych punktach czasowych, co pokazuje się tutaj jako utrata śledzenia kolorów. Efekt ten może zniekształcić szacunki tempa wzrostu, ponieważ wolno rosnące kolonie są mniej skłonne do łączenia się z sąsiadami, zanim zostaną zebrane dane z wystarczającej liczby punktów czasowych.

W zależności od warunków wzrostu, podzbiór komórek może przejść fazę opóźnienia przed rozpoczęciem wzrostu. Ważne jest, aby wziąć to pod uwagę przy użyciu obszarów kolonii do obliczania tempa wzrostu, a nie dopasowywania krzywej wzrostu do wszystkich dostępnych punktów czasowych. Opisany protokół może być wykorzystany do zbadania szerokiego zakresu pytań związanych ze wzrostem i ewolucją drożdży.

Jego elastyczny format mikropłytki oznacza, że można go dostosować do innych gatunków drożdży, różnych warunków wzrostu, innych drobnoustrojów i potencjalnie innych komórek w hodowli.