Name: Izolowanie i obrazowanie żywych, nienaruszonych obszarów rozrusznika serca miednicy nerkowej myszy poprzez wycięcie wibratomem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę izolacji i obrazowania żywych obszarów rozrusznika miednicy nerkowej myszy przy użyciu wibratomu. Technika umożliwia badanie mechanizmów komórkowych odpowiedzialnych za rytmiczne skurcze niezbędne do transportu moczu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez R01 DK124509 z NIDDK.

Wszystkie użyte myszy i protokoły opisane w tym badaniu były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz Institutional Animal Use and Care Committee na University of Nevada, Reno, NV. Eksperymenty i wykorzystanie zwierząt również były zgodne z zasadami i przepisami opisanymi przez Grundy28.
1. Generowanie myszy PDGFRα-GCaMP6f i SMCGCaMP3
<ol>
	<li>Skrzyżowanie myszy GCaMP6flox/+ (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/J) z myszami PDGFRαCre (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J), aby wygenerować myszy PDGFRα-GCaMP6f.</li>
	<li>Skrzyżowanie myszy GCaMP3lox/+ (B6.129S-Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J) z samcami myszysmMHC CreERT2 (B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J) do generowania myszy SMC-GCaMP3. 
	UWAGA: Tylko samce myszy krzyżówki (myszy GCaMP3lox/+ i myszy smMHCCreERT2) mogą być używane, ponieważ ekspresja Cre jest sterowana z chromosomu Y. MyszysmMHC CreERT2 można również krzyżować z myszami GCaMP6flox/+ w celu poprawy stosunku sygnału do szumu Ca2 + i szybszych właściwości czasowych sygnału Ca2 +.</li>
</ol>
2. Przygotuj i wstrzyknij transgenicznym myszom tamoksyfen, aby wywołać warunkową ekspresję GCaMP
<ol>
	<li>Aktywuj indukowalną rekombinazę Cre dla specyficznej dla komórki ekspresji GCaMP w określonych typach komórek, jak opisano wcześniej29.</li>
</ol>
3. Przygotuj rozwiązania
<ol>
	<li>Przygotować 1 l roztworu wodorowęglanu Krebsa-Ringera (KRB) zawierającego 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO3, 1,2 mM Na2HPO 4,1,2 mM MgCl2, 11,5 mM glukozy i 2,5 mM CaCl2. W dniu użycia roztwór KRB należy utrzymywać na lodzie. 
	UWAGA: KRB może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia i powinien być wstępnie bąbelkowany mieszanką 97%O2 i 3% CO2 przez co najmniej 10 minut przed użyciem.</li>
</ol>
4. Przygotuj naczynia do analizy i obrazowania mikroskopowego pokryte elastomerem silikonowym
<ol>
	<li>Wymieszaj składniki elastomeru silikonowego zgodnie z instrukcjami producenta. Napełnij szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm i szalkę Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm w około jednej czwartej ciekłym elastomerem krzemowym do eksperymentów obrazowych i sekcji. Polimeryzować elastomer krzemowy w temperaturze 37 °C przez 1 dzień przed użyciem. 
	UWAGA: Aby zwiększyć kontrast cienkich skrawków nerek, nałóż małe, czarne kółko papieru na podstawę obrazującej szalki Petriego przed wypełnieniem elastomerem silikonowym.</li>
</ol>
5. Rozwarstwienie nerki
<ol>
	<li>Myszy należy znieczulić poprzez inhalację 3-4% izofluranu w wentylowanym kapturze. Potwierdź indukcję głębokiego znieczulenia przez utratę odruchu szczypania palca u nogi i/lub ogona, a następnie poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Nałóż 70% etanolu na klatkę piersiową, aby zwilżyć sierść. Za pomocą zewnętrznych nożyczek preparacyjnych otwórz jamę brzuszną przez podłużne nacięcie, z ostrzami nożyczek ustawionymi pod kątem od zwierzęcia, aby zapobiec uszkodzeniu narządów wewnętrznych.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy do tkanek wewnętrznych i nożyczek do rozwarstwiania wewnętrznego uszczypnij jelita i oderwij je od ściany brzucha. Unosząc jelita, odetnij spód jelit z dala od ciała na bliższej dwunastnicy i dystalnej części okrężnicy, aby uzyskać dostęp do przestrzeni zaotrzewnowej zawierającej nerki.</li>
	<li>Po odsłonięciu nerek należy je usunąć pojedynczo. Delikatnie ściśnij i unieś dystalny koniec moczowodu (~4 mm od nerki) za pomocą kleszczyków tkankowych. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć pod ściśniętym moczowodem w kierunku nerki. Kontynuuj nacinanie pod nerką, aż zostanie uwolniona z otaczającej tkanki łącznej. 
	UWAGA: Aby zmaksymalizować integralność tkanki i spójność cięcia podczas cięcia wibratomem, nerka musi być tak nienaruszona, jak to możliwe. Aby to zapewnić, unikaj szczypania lub przecinania nerki kleszczami i nożyczkami preparacyjnymi.</li>
	<li>Umieść nerkę z dołączonym moczowodem w lodowatym roztworze KRB. Powtórz kroki 5.4 i 5.5 z przeciwległą nerką. Utrzymuj nerki w roztworze KRB na lodzie. 
	UWAGA: Natychmiast przejdź do następnej sekcji protokołu, aby zachować żywotność tkanki PKJ. Ze względu na swoje anatomiczne umiejscowienie głęboko w miąższu nerki, PKJ jest pozbawiony kontaktu z roztworem KRB.</li>
</ol>
6. Przygotuj nerkę do sekcji wibratomu
<ol>
	<li>Przenieść nerkę do naczynia rozwarstwiającego pokrytego elastomerem silikonowym (60 mm x 15 mm) i napełnić je lodowatym roztworem KRB, aż nerka zostanie całkowicie zanurzona.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym zakotwiczyć nerkę u podstawy naczynia, wprowadzając drobne szpilki do bliższego moczowodu i przez cienką przednią torebkę nerkową lub otaczającą tkankę tłuszczową. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie przebić tkanki miąższu nerki.</li>
	<li>Użyj cienkich nożyczek sprężynowych i kleszczy wewnętrznych, aby usunąć tkankę tłuszczową z podstawy nerki, aby odsłonić dystalną RP i proksymalny moczowód.</li>
	<li>Usuń bliższy moczowód i część dystalnego RP z podstawy RP za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie przeciąć otaczającego miąższu nerki. przerywana linia w Rysunek 1A wskazuje przybliżoną pozycję tego cięcia. To cięcie tworzy płaską podstawę na nerce dla bardziej równomiernego podziału tkanek. Podczas preparacji nerki należy zdawać sobie sprawę z anatomicznego położenia okolicy PKJ. <silna klasa="xfig">Rysunek 1B pokazuje, że nienaruszoną nerkę można przeciąć wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, aby odsłonić rdzeń, brodawkę (dystalny rdzeń, gdzie zbiegają się przewody zbiorcze) oraz proksymalną i dystalną RP. Gdyby brodawka była całkowicie odsłonięta, jak w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C, można by zobrazować PKJ i proksymalny RP (proxowy RP). Nie należy tego jednak robić w przypadku techniki wibratomowej; Opis ten ma na celu zorientowanie czytelnika w ogólnym położeniu PKJ, podkreślonym w różnicy anatomicznej pokazanej na obrazach w świetle przechodzącym regionu PKJ i regionu środkowego RP w <silna klasa="xfig">Rysunek 1D,E.</li>
	<li>Przekłuć zewnętrzną torebkę nerkową kleszczami z cienką końcówką, odchylając końcówki od trzonu nerki. Używając kleszczy każdą ręką, ściśnij luźne końce kapsułki i rozsuń je. Kontynuuj odklejanie pozostałej błony torebki nerkowej, aż zostanie całkowicie usunięta. 
	UWAGA: Torebka nerkowa to twarda, włóknista warstwa otaczająca nerkę. Należy go usunąć przed cięciem wibratomem w celu optymalnego cięcia.</li>
</ol>
7. Przygotuj i skalibruj wibratom
<ol>
	<li>Włóż żyletkę do uchwytu ostrza wibratomu i wyreguluj kąt prześwitu ostrza na ~18°. 
	UWAGA: Jako opcjonalny krok w celu uzyskania wyższej jakości cięcia, należy użyć bloku kalibracyjnego (dostarczonego z niektórymi przyrządami wibratomowymi) do regulacji pozycji ostrza dla każdego nowego używanego ostrza zgodnie z instrukcjami producenta. Zapewni to optymalne ustawienie ostrza i zminimalizuje drgania pionowe.</li>
	<li>Dostosuj prędkość posuwu ostrza do 0.2 mm/s, drgania/ścinanie poziome ostrza do amplitudy 2.00 mm, a rozmiar kroku Z ostrza do ~100-150 μm. Upewnij się, że grubość odcinka nerki nie przekracza 150 μm, ponieważ wpłynie to negatywnie na eksperymenty obrazowania Ca2+ (ponieważ ściana PKJ często toczy się i składa na sobie, jeśli jest zbyt gruba). 
UWAGA: Użytkownik powinien dostroić te parametry cięcia, ponieważ ustawienia będą się różnić między poszczególnymi preparatami nerkowymi a instrumentami wibratomowymi. Dostrajanie powinno odbywać się podczas przekroju, gdy użytkownik może wizualnie sprawdzić przekroje pod mikroskopem, jak opisano w kroku 7.2.</li>
	<li>Zainstaluj łaźnię lodową i tackę buforową na instrumencie wibratomicznym. Napełnij łaźnię lodową kruszonym lodem i napełnij wewnętrzny obszar stage lodowatym roztworem KRB (napełnij mniej więcej do połowy). Podczas cięcia wibratomu monitoruj i wymieniaj pokruszony lód, który się stopił.</li>
</ol>
8. Wibratom, który przecina nerkę
<ol>
	<li>Użyj tępo zakończonych kleszczyków, aby delikatnie chwycić i wyjąć przygotowaną nerkę z lodowatego roztworu KRB. Natychmiast umieść nerkę na bibule chłonnej na ~2-4 s, aby usunąć nadmiar wilgoci zewnętrznej. Delikatnie przetoczyć nerkę po bibule chłonnej, aby upewnić się, że wszystkie boki miąższu wyschły, aby zapewnić optymalne przyleganie nerki do etapu wibratomu. 
	UWAGA: Ponieważ RP znajduje się wewnątrz nerki, a zatem jest chroniony przez miąższ zewnętrzny, ten krótki okres suszenia nie byłby szkodliwy dla integralności tkanek.</li>
	<li>Natychmiast nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego (~1 cm2) na podstawę płytki próbki wibratomu i za pomocą szczypiec umieść nerkę moczowodem do dołu na obszarze pokrytym klejem. Delikatnie uciskaj w dół górną część nerki płaską krawędzią kleszczyków przez około 10-20 sekund, aby wysuszyć klej. 
	UWAGA: Aby ustabilizować nerkę podczas tej procedury, użyj dodatkowej pary kleszczy, aby utrzymać nerkę w pozycji pionowej po wyschnięciu kleju. Bardzo ważne jest, aby nerka przylegała do płytki próbki w pozycji pionowej, tak aby sekcje były cięte prosto. Aby upewnić się, że nerka pomyślnie przylega do płytki próbki, delikatnie popchnij bok nerki. Jeśli nerka pomyślnie przylgnęła do płytki, podstawa nerki powinna pozostać przymocowana do płytki.</li>
	<li>Mocno przymocuj płytkę z próbką do dna tacki buforowej. Dostosuj poziom roztworu KRB tak, aby górna część nerki była całkowicie zanurzona. Podczas etapów cięcia, gdy ostrze wibratomu przesuwa się głębiej w tacę buforową, należy usunąć roztwór KRB, aby uchwyt ostrza nie zanurzył się w roztworze. 
	UWAGA: Jeśli klej nie wyschnie całkowicie przed wykonaniem tego kroku, klej często przesuwa się w górę od podstawy do miąższu nerki. Ten nadmiar kleju sprawi, że cięcie będzie bardziej zróżnicowane. Jeśli tak się stanie, wyjmij nerkę z płytki i przystąp do świeżego preparatu nerkowego.</li>
	<li>Aby uzyskać automatyczne cięcie wibratomów, wybierz pozycję początkową i końcową cyklu cięcia ostrza wibratomowego. Sprawdź, czy te pozycje są oddalone od nerki o ~ 0,5-1 cm, aby upewnić się, że przy każdym posunięciu ostrza cała płaszczyzna nerki jest podzielona na sekcje.</li>
	<li>Przygotuj płytkę wielodołkową (24- lub 48-dołkową), wypełniając studzienki roztworem KRB i umieść płytkę na lodzie. 
	UWAGA: Po wygenerowaniu poszczególne sekcje należy umieścić w oddzielnych studzienkach, aby śledzić głębokość sekcji.</li>
	<li>Rozpocznij automatyczny proces cięcia. Podczas pierwszego przejścia ostrza upewnij się, że ostrze styka się z samą górną częścią nerki. Jeśli kontakt nie zostanie nawiązany, wyreguluj początkową pozycję Z ostrza.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zbierz odcinki, które są uwolnione z nerki. Natychmiast przenieś skrawki do poszczególnych studzienek i zanotuj głębokość Z sekcji, aby ocenić przybliżoną lokalizację PKJ w sekcjach nerkowych. 
	UWAGA: W zależności od parametrów cięcia, niektóre sekcje mogą nie zostać odcięte od bloku nerkowego. W takim przypadku ostrożnie użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby wyciąć odcinki z bloku nerkowego. Użytkownicy są również zachęcani do aktywnej wizualizacji skrawków pod mikroskopem świetlnym podczas swobodnego unoszenia się w poszczególnych studzienkach, aby zapewnić optymalne ustawienia cięcia i lokalizację tkanki. Sekcje zawierające PKJ zazwyczaj pochodzą z ~ 1000-1500 μm od górnej części nerki.</li>
	<li>Kontynuuj protokół sekcji, aż regiony PKJ staną się bardziej widoczne. Zapoznaj się z sekcją dotyczącą reprezentatywnych wyników, aby zapoznać się z opisem regionów PKJ w miarę postępu sekcji.</li>
	<li>W tym momencie zoptymalizuj parametry cięcia, aby upewnić się, że skrawki są równomiernie uwalniane z bloku nerkowego i są nienaruszone. Dodatkowo upewnij się, że regiony PKJ są ciągłe i nieprzerwane, ponieważ uszkodzone ściany PKJ nie pozwolą na odpowiednie obrazowanie komórek w ścianie z powodu zapadnięcia się. Jeśli ścianki zostaną uszkodzone, zmniejsz prędkość cięcia i zwiększ grubość przekroju, a następnie kontynuuj obserwację przekrojów pod mikroskopem świetlnym, aby dostroić parametry cięcia.</li>
	<li>Skrawki należy przechowywać w temperaturze 4°C w roztworze KRB do czasu rozpoczęcia eksperymentów.</li>
</ol>
9. Akwizycja obrazu Ca2+ wycinek nerki
<ol>
	<li>Przenieś pojedynczy wycinek nerki do naczynia do obrazowania pokrytego elastomerem silikonowym (35 mm x 10 mm) i natychmiast napełnij naczynie świeżym, lodowatym roztworem KRB.</li>
	<li>Umieść maleńkie szpilki na obwodzie wycinka nerki, aby przymocować sekcję do podstawy naczynia do obrazowania. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby zapobiec przesuwaniu się sekcji, gdy roztwory fizjologiczne są perfundowane na plasterku podczas obrazowania.</li>
	<li>Umieścić czaszę obrazowania na stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i natychmiast rozpocząć perfuzję roztworem KRB. 
	UWAGA: W tym protokole użyto mikroskopu pionowego wyposażonego w szybki skaner konfokalny z wirującym dyskiem Nipkowa.</li>
	<li>Utrzymać szybkość perfuzji na poziomie 3 ml/min, a temperaturę roztworu KRB na poziomie 36 ± 1 °C. Przed obrazowaniem należy odczekać, aż plasterek zrównoważy się przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią kostkę do obrazowania dichroicznego i lasery. Uzyskuj obrazy za pomocą urządzenia EMCCD (EMCCD) zwielokrotniającego elektrony lub naukowej kamery półprzewodnikowej z tlenkiem metalu. 
	UWAGA: System konfokalny w tym protokole jest wyposażony w laser o długości fali 488 nm do wzbudzania GCaMP6f lub GCaMP3. Zdjęcia zostały uzyskane za pomocą kamery EMCCD o wymiarach 512 x 512 pikseli.</li>
	<li>Użyj soczewki obiektywowej o małym powiększeniu, zanurzonej w wodzie (4x lub 10x), aby zlokalizować wycinek nerki. Wyśrodkuj pole obrazowania na obszarach przekroju, w których znajduje się PKJ. Zidentyfikuj punkty orientacyjne, jak pokazano w Rysunek 2D, aby zlokalizować PKJ (tj. półkola tkanek mięśniowych zawieszonych między tkanką miąższową).</li>
	<li>Po zlokalizowaniu PKJ użyj soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie o większym powiększeniu (20x, 40x lub 60x), aby powiększyć obszar zainteresowania. 
	UWAGA: W tym protokole apertura numeryczna obiektywu 20x (NA) wynosiła 1,0, obiektyw 40x NA wynosił 0,8, a obiektyw 60x NA wynosił 1,0.</li>
	<li>Rozróżnij różne interesujące komórki w ścianie PKJ za pomocą transgenicznych myszy eksprymujących GCaMP6f lub GCaMP3 odpowiednio w komórkach PDGFRα + lub SMC. Obserwuj różne typy przejściowych czasów trwania Ca2+ w komórkach PDGFRα + w ścianie PKJ w wycinkach nerkowych PDGFRα + GCaMP6f + (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C, patrz reprezentatywne wyniki dla opisu) oraz w GCaMP3 + SMC SMC GCaMP3 + wycinki nerkowe (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3D, zobacz reprezentatywne wyniki dla opisu).</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu interesujących komórek w ścianie PKJ dostosuj intensywność lasera, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu. Rejestruj obrazy z czasową częstotliwością próbkowania od 16 Hz do 32 Hz za pomocą odpowiedniego oprogramowania do akwizycji. 
	UWAGA: W zależności od intensywności lasera używanego podczas obrazowania zaleca się ograniczenie liczby nagrań ze względu na działanie wybielające na fluoroforyCa2+. Użytkownik powinien wybrać długość nagrania w oparciu o konkretne cele eksperymentu.</li>
</ol>
10. Analiza obrazowania Ca2+
<ol>
	<li>Wykonaj analizę obrazowania Ca2+ różnych typów komórek w regionach rozrusznika PKJ poprzez mapowanie czasoprzestrzenne, jak opisano wcześniej dla innych nienaruszonych preparatów stymulatora w przewodzie pokarmowym29,30.</li>
</ol>

<ol><li>Constantinou, C. E., Djurhuus, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyeloureteral+dynamics+in+the+intact+and+chronically+obstructed+multicalyceal+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pyeloureteral dynamics in the intact and chronically obstructed multicalyceal kidney.</a> The American Journal of Physiology. 241 (5), 398-411 (1981).</li>
<li>Constantinou, C. E., Yamaguchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-coupled+pacemaker+system+in+renal+pelvis+of+the+unicalyceal+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22TheAmerican+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiple-coupled pacemaker system in renal pelvis of the unicalyceal kidney.</a> TheAmerican Journal of Physiology. 241 (5), 412-418 (1981).</li>
<li>Constantinou, C. E., Hrynczuk, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urodynamics+of+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Urology%22%5BJournal%5D)">Urodynamics of the upper urinary tract.</a> Investigative Urology. 14 (3), 233-240 (1976).</li>
<li>Schmidt-Nielsen, B., Schmidt-Nielsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+function+of+the+mammalian+renal+papilla+and+the+peristalsis+of+the+surrounding+pelvis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">On the function of the mammalian renal papilla and the peristalsis of the surrounding pelvis.</a> Acta Physiologica. 202 (3), Oxford, England. 379-385 (2011).</li>
<li>Dwyer, T. M., Schmidt-Nielsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renal+pelvis%3A+machinery+that+concentrates+urine+in+the+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">The renal pelvis: machinery that concentrates urine in the papilla.</a> Physiology. 18 (1), 1-6 (2003).</li>
<li>Hill, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+urinary+drainage+and+voiding%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Control of urinary drainage and voiding.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 10 (3), 480-492 (2015).</li>
<li>Brading, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+the+mammalian+urinary+outflow+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The physiology of the mammalian urinary outflow tract.</a> Experimental Physiology. 84 (1), 215-221 (1999).</li>
<li>Dixon, J. S., Gosling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+musculature+of+the+human+renal+calices%2C+pelvis+and+upper+ureter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The musculature of the human renal calices, pelvis and upper ureter.</a> Journal of Anatomy. 135, Pt 1 129-137 (1982).</li>
<li>Lang, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyeloureteric+peristalsis%3A+role+of+atypical+smooth+muscle+cells+and+interstitial+cells+of+Cajal-like+cells+as+pacemakers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pyeloureteric peristalsis: role of atypical smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal-like cells as pacemakers.</a> The Journal of Physiology. 576, 695-705 (2006).</li>
<li>Lang, R. J., Takano, H., Davidson, M. E., Suzuki, H., Klemm, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+spontaneous+electrical+and+contractile+activity+of+smooth+muscle+cells+in+the+rat+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the spontaneous electrical and contractile activity of smooth muscle cells in the rat upper urinary tract.</a> Journal of Urology. 166 (1), 329-334 (2001).</li>
<li>Lang, R. J., Exintaris, B., Teele, M. E., Harvey, J., Klemm, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+basis+of+peristalsis+in+the+mammalian+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical basis of peristalsis in the mammalian upper urinary tract.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 25 (5), 310-321 (1998).</li>
<li>Morita, T., Ishizuka, G., Tsuchida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+propagation+of+stimulus+from+the+renal+pelvic+pacemaker+in+pig+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Urology%22%5BJournal%5D)">Initiation and propagation of stimulus from the renal pelvic pacemaker in pig kidney.</a> Investigative Urology. 19 (3), 157-160 (1981).</li>
<li>Tsuchida, S., Morita, T., Harada, T., Kimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+propagation+of+canine+renal+pelvic+peristalsis%5BTitle%5D)+AND+%22Urologia+Internationalis%22%5BJournal%5D)">Initiation and propagation of canine renal pelvic peristalsis.</a> Urologia Internationalis. 36 (5), 307-314 (1981).</li>
<li>Yamaguchi, O. A., Constantinou, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+calyceal+and+pelvic+contraction+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Regulatory+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Renal calyceal and pelvic contraction rhythms.</a> American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 257 (4), 788-795 (1989).</li>
<li>Klemm, M. F., Exintaris, B., Lang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cells+underlying+pacemaker+activity+in+the+guinea-pig+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of the cells underlying pacemaker activity in the guinea-pig upper urinary tract.</a> Journal of Physiology. 519 (3), 867-884 (1999).</li>
<li>Lang, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+electrical+and+Ca2%2B+signals+in+the+mouse+renal+pelvis+that+drive+pyeloureteric+peristalsis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous electrical and Ca2+ signals in the mouse renal pelvis that drive pyeloureteric peristalsis.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 37 (4), 509-515 (2010).</li>
<li>Lutzeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+process+of+ureteral+peristalsis+in+multicalyceal+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Urologia+Internationalis%22%5BJournal%5D)">Pacemaker process of ureteral peristalsis in multicalyceal kidneys.</a> Urologia Internationalis. 37 (4), 240-246 (1982).</li>
<li>Lang, R. J., Hashitani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+mechanisms+driving+pyeloureteric+peristalsis%3A+modulatory+role+of+interstitial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Pacemaker mechanisms driving pyeloureteric peristalsis: modulatory role of interstitial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 77-101 (2019).</li>
<li>Hashitani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+cell+modulation+of+pyeloureteric+peristalsis+in+the+mouse+renal+pelvis+examined+using+FIBSEM+tomography+and+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interstitial cell modulation of pyeloureteric peristalsis in the mouse renal pelvis examined using FIBSEM tomography and calcium indicators.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (5-6), 797-813 (2017).</li>
<li>Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ca2%2B+entry+and+Ca2%2B+stores+in+atypical+smooth+muscle+cell+autorhythmicity+in+the+mouse+renal+pelvis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).</li>
<li>Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Parkington, H. C., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+electrical+and+Ca2%2B+signals+in+typical+and+atypical+smooth+muscle+cells+and+interstitial+cell+of+Cajal-like+cells+of+mouse+renal+pelvis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous electrical and Ca2+ signals in typical and atypical smooth muscle cells and interstitial cell of Cajal-like cells of mouse renal pelvis.</a> The Journal of Physiology. 583, 1049-1068 (2007).</li>
<li>Hashitani, H., Lang, R. J., Mitsui, R., Mabuchi, Y., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+effects+of+CGRP+on+typical+and+atypical+smooth+muscle+cells+involved+in+generating+spontaneous+contractions+in+the+mouse+renal+pelvis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (8), 2030-2045 (2009).</li>
<li>Iqbal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+and+ANO1%2F+TMEM16A+chloride+channel+profiles+distinguish+atypical+and+typical+smooth+muscle+cells+from+interstitial+cells+in+the+mouse+renal+pelvis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Potassium and ANO1/ TMEM16A chloride channel profiles distinguish atypical and typical smooth muscle cells from interstitial cells in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 165 (7), 2389-2408 (2012).</li>
<li>Grainger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+classification+of+interstitial+cells+in+the+mouse+renal+pelvis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification and classification of interstitial cells in the mouse renal pelvis.</a> Journal of Physiology. 598 (15), 3283-3307 (2020).</li>
<li>Hashitani, H., Mitsui, R., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+PDGFR%CE%B1+%28%2B%29+cells+in+spontaneously+active+urogenital+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of PDGFRα (+) cells in spontaneously active urogenital tissues.</a> Neurourology and Urodynamics. 39 (6), 1667-1678 (2020).</li>
<li>Hashitani, H., Lang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATYPICAL+or+INTERSTITIAL%2C+take+your+PIC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">ATYPICAL or INTERSTITIAL, take your PIC.</a> Journal of Physiology. 598 (15), 3061-3062 (2020).</li>
<li>Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ca2%2B+entry+and+Ca2%2B+stores+in+atypical+smooth+muscle+cell+autorhythmicity+in+the+mouse+renal+pelvis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).</li>
<li>Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+standards+for+reporting+animal+experiments+in+The+Journal+of+Physiology+and+Experimental+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Principles and standards for reporting animal experiments in The Journal of Physiology and Experimental Physiology.</a> Experimental Physiology. 100 (7), 755-758 (2015).</li>
<li>Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+spatio-temporal+mapping+and+particle+analysis+techniques+to+quantify+intracellular+Ca+2%2B+signaling+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular Ca 2+ signaling in situ.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-13 (2019).</li>
<li>Leigh, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+machine-learning+driven+analysis+of+Ca2%2B+spatio-temporal+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A high throughput machine-learning driven analysis of Ca2+ spatio-temporal maps.</a> Cell Calcium. 91, 102260(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

RP składa się z niejednorodnej populacji komórek o zróżnicowanej gęstości komórek obserwowanej w różnych regionach RP. PIC1 (wcześniej określane jako ASMC) są najliczniejsze w PKJ, gdzie aktywność rozrusznika serca pochodziz 24. Opisany tutaj protokół pozwala badaczom odizolować obszar rozrusznika serca od reszty nerki myszy. Poprzez wycinanie odcinków PKJ za pomocą wibratomu, obszary rozrusznika RP (zidentyfikowane jako pasma mięśniowe przyczepione do miąższu) pozostają nienaruszone, co umożliwia zastosowanie obrazowania in situ w celu dokładnego zbadania komórek rozrusznika RP w połączeniu ze specyficznymi dla komórki reporterami fluorescencji.
Chociaż takie podejście może dostarczyć nowych informacji na temat rozrusznika RP, istnieją pewne kwestie, z którymi eksperymentatorzy powinni być zaznajomieni, aby poprawić wyniki obrazowania i wydajność sekcji. Dla nieprzeszkolonego użytkownika ta metoda izolacji i obrazowania PKJ jest łatwiejsza do nauczenia niż typowa ostra sekcja preparatów RP z płaskich arkuszy. Ostra sekcja RP z całych nerek wymaga tygodni konsekwentnej praktyki, aby skutecznie wyizolować żywe tkanki do eksperymentów fizjologicznych. Ponieważ ten protokół sekcji wibratomu wymaga niewielkiej ostrej wiedzy na temat sekcji, jest dostępny dla użytkowników, którzy nie mają doświadczenia w preparowaniu innych struktur mięśni gładkich.
Istnieją jednak pewne krytyczne punkty, na które należy zwrócić uwagę w przypadku tego protokołu. Skuteczne przyleganie nerek do płytki próbki wibratomu wymaga zręczności i cierpliwości. Jeśli nerka jest nieprawidłowo zorientowana i przechyla się na jedną stronę, zostaną przecięte ukośne, a nie proste odcinki. Ze względu na delikatną naturę PKJ, kąt ukośny może często zniszczyć pasma mięśniowe w okolicy rozrusznika. Co więcej, obrazowanie odcinków skośnych powoduje słabą akwizycję obrazowania, ponieważ sieci komórkowe zwykle nie znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Procedura jest również czasochłonna, a sekcja pojedynczej nerki często trwa do godziny, w tym czasie konfiguracja wymaga monitorowania.
Podczas gdy ruch wibratomu może zostać przyspieszony, jeśli prędkość zostanie zwiększona zbyt mocno (>20% niż jest to zalecane w protokole), ostrze raczej rozdrobni niż czysto przetnie nerkę, powodując utratę delikatnych struktur PKJ. Podobnie, zbyt niska prędkość skrawania może spowodować postrzępienie sekcji. Niezbędna jest optymalizacja prędkości skrawania i amplitudy ostrza. Należy również zachować ostrożność podczas obchodzenia się z sekcjami wibratomu. Ze względu na swoją delikatną naturę, mięśnie PKJ łatwo ulegają zakłóceniu podczas przenoszenia i mogą się rozerwać. Dobrze wyszkolony użytkownik będzie w stanie zebrać około 1-2 regionów PKJ na 4 wycinki nerki, które są odpowiednie do eksperymentów obrazowania Ca2+ . Zazwyczaj sekcje PKJ, które nie spełniają kryteriów obrazowania Ca2+ , mają: 1) słabe wyrażenie GCaMP, 2) wykrzywioną ścianę PKJ lub 3) uszkodzoną ścianę PKJ. Do analizy danych można pobrać próbki z około 3-4 komórek na pole widzenia (FOV).
Chociaż w polu widzenia odcinków PKJ PDGFRα-GCaMP6f i SMC-GCaMP3 znajduje się wiele komórek, małe ruchy tkanek często wykluczają komórki z analizy. Zwykle można to rozwiązać, stosując protokół stabilizacji do obrazów. W warunkach, w których preparaty nie przemieszczają się, można pobrać co najmniej 3-5 komórek z odcinków PDGFRα-GCaMP6f i 5-6 komórek z odcinków SMC-GCaMP3. Zazwyczaj czas potrzebny od uśmiercenia zwierząt (optymalny wiek dla myszy to 8-16 tygodni) do przeprowadzenia eksperymentów obrazowania Ca2+ wynosi 2-3 godziny, co jest wystarczające do zapewnienia integralności tkanek, jeśli tkanki są inkubowane w lodowatych roztworach przez cały czas trwania procedury, gdy jest to wymagane. Podsumowując, opisano tutaj protokół cięcia wibratomu w celu wytworzenia nienaruszonych preparatów regionów RP PKJ z nerki myszy. Technika ta pozwala na zachowanie regionów rozrusznika RP do badań obrazowania in situ Ca2+ w celu zbadania mechanizmów rozrusznika RP.

Miedniczka nerkowa (RP) to lejkowata struktura mięśni gładkich, która transportuje mocz z nerki do moczowodu. RP transportuje mocz, generując regularne rytmiczne skurcze (perystaltykę)1,2,3,4,5, który kieruje bolus moczu z nerki dystalnie do moczowodu i ostatecznie do pęcherza, gdzie jest przechowywany do momentu wystąpienia mikcji6,7. Utrata tej regularnej aktywności ma tragiczne konsekwencje, w tym wodonercze i niewydolność nerek1,3,8; w związku z tym istnieje pilna potrzeba zbadania mechanizmów leżących u podstaw regularnych, rytmicznych skurczów RP. Skurcze perystaltyczne pochodzą z najbardziej proksymalnego obszaru RP - w połączeniu miednica-nerka (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 (Rysunek 1A-C) i rozchodzić się dystalnie, aby wypchnąć mocz z brodawki do RP (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B). Aktywność rozrusznika elektrycznego jest rejestrowana w PKJ jako spontaniczne depolaryzacje przejściowe 10,11,12,13,15,16,17, które uważa się za pochodzące z wyspecjalizowanych komórek rozrusznika serca. Uważa się, że te komórki rozrusznika serca, wcześniej nazywane atypowymi komórkami mięśni gładkich (ASMC), generują lub koordynują aktywność rozrusznika serca i napędzają skurcze "typowych" komórek mięśni gładkich (SMC)9,10,11,18,19,20,21,22,23.
ASMC są najliczniejsze w proksymalnym RP, w PKJ (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-C), skąd pochodzą skurcze perystaltyczne i aktywność rozrusznika elektrycznego5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21,22. Niedawno opublikowane badanie przeprowadzone przez tę grupę zidentyfikowało receptor alfa pochodzącego z płytek krwi czynnika wzrostu (PDGFRα), w połączeniu z łańcuchem ciężkim miozyny mięśni gładkich (smMHC), jako unikalny biomarker dla tych komórek śródmiąższowych (IC)24, odkrycie, które zostało potwierdzone przez inne grupy25. Opierając się na ich morfologii i wzorcu ekspresji białek, komórki te nazwano PDGFRα + IC typu 1 (PIC1)24,26. PIC1 znajdują się w warstwie mięśniowej PKJ, gdzie wykazują krótkotrwałe stany przejściowe Ca2+ o wysokiej częstotliwości, które uważa się za podstawę generowania potencjałów rozrusznika serca24. Jednak w PKJ istnieją inne typy komórek, w tym układy scalone PDGFRα+ bez ekspresji smMHC (PIC2) w warstwie przybyszowej. Poprzednie doniesienia sugerowały, że układy scalone inne niż smMHC mogą uczestniczyć w regulacji aktywności rozrusznika serca19. Jednak dalsze badania układów scalonych innych niż smMHC są utrudnione przez słabe rozróżnienie podczas badań obrazowania Ca2+. Zazwyczaj heterogeniczne typy komórek w preparatach RP są bezkrytycznie obciążone barwnikami wrażliwymi na Ca2+ (np. Fluo-4). Aby przezwyciężyć te wyzwania i zbadać różne typy komórek w RP, genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 + (GECI) mogą być wykorzystane do selektywnej ekspresji wrażliwych na Ca2 + fluoroforów w interesujących typach komórek.
Większość badań wyjaśniających przejściowe właściwości Ca2+ w PIC1s/ASMC uzyskano poprzez obrazowanie płaskich preparatów tkankowych RP na płaskim arkuszu19,21,27. Ponieważ PIC1 są jedynym typem komórek w PKJ, który wykazuje ekspresję smMHC, warunkowa ekspresja GECI, GCaMP, w komórkach smMHC+ jest odpowiednia do badania PIC1 w tej konfiguracji. Ponieważ jednak zarówno PIC1, jak i PIC2 wyrażają PDGFRα, warunkowa ekspresja wariantów GCaMP w komórkach PDGFRα+ uniemożliwia rozróżnienie komórek w preparatach z płaskim arkuszem. Aby obejść ten problem, zastosowano metodę podziału wibratomu w celu rozróżnienia PIC1 i PIC2 w poprzek ściany tkanki PKJ24. Aby ujawnić te dyskretne populacje komórkowe, RP poddano sekcji czołowej, co umożliwiło identyfikację PIC2 w przydankach i PIC1 w ścianie mięśniowej na podstawie znanego znakowania immunohistochemicznego i wzorców ekspresji GECI. W wyniku tego nowatorskiego podejścia do obrazowania PKJ stwierdzono, że PIC1 i PIC2 wykazują różne właściwości sygnalizacyjne Ca2+ 24. Ponadto, poprzez wyizolowanie najbardziej proksymalnych odcinków regionu PKJ (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), region rozrusznika RP został zachowany w sposób, który wcześniej nie został osiągnięty. W tym miejscu opisano protokół pokazujący, jak wyizolować preparaty PKJ z nerki myszy za pomocą sekcji wibratomowej, jak ustawić te preparaty do eksperymentów obrazowania Ca2 + oraz jak rozróżnić różne typy komórek w ścianie PKJ.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>hodowlana ThermoFisher Scientific</td><td>142485</td><td>Do przechowywania plastrów nerki na</td></tr><tr><td>szalkach Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165</td><td>Naczynie do obrazowania wapnia w plastrach nerek</td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka do hodowli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>152640</td><td>Do przechowywania plastrów nerki na</td></tr><tr><td>szalce Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5481</td><td>Naczynie do wycinków nerek</td></tr><tr><td>Papier chłonny</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Do suszenia nerki przed nałożeniem kleju</td></tr><tr><td>B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>13148</td><td>GCaMP3 Myszy</td></tr><tr><td>B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>24105</td><td>GCaMP6f Myszy</td></tr><tr><td>B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J</td><td>Myszy Jackson Laboratory</td><td>19079</td><td>smMHC-CRE</td></tr><tr><td>C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>13148</td><td>PDGFRa-CRE Myszy</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Amazon</td><td>B001PILFVY</td><td>Do przylegania nerki do płytki próbki</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Phamco-Aaper</td><td>SDA 2B-6</td><td>Do preparacji</td></tr><tr><td>Bardzo drobne nożyczki Bonn</td><td>Fine Science Tools</td><td>14083-08</td><td>Służy do wewnętrznych nożyczek preparacyjnych</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>Służy do zewnętrznych nożyczek preparacyjnych</td></tr><tr><td>Kleszcze z cienką końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Służy do dokładnego rozwarstwiania nerek</td></tr><tr><td>Gillette Srebrno-niebieskie ostrza o podwójnej krawędzi</td><td>Amazon</td><td>B009XHQGYO</td><td>Do włożenia do uchwytu ostrza wibratomu</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Do analizy obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>NDC 1001936060</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Szpilki</td><td>Minutien Fisher Scientific NC9677548</td><td></td><td>Szpilki zostały przecięte na pół, aby zmniejszyć ich długość</td></tr><tr><td>Elastomer krzemowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>Kleszcze studenckie Adson</td><td>Narzędzia</td> <td>do nauki o naukach91106-12</td><td>Do delikatnego trzymania i przesuwania nerki</td></tr><tr><td>Kleszcze studenckie Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Używany do wewnętrznych kleszczy preparacyjnych</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>Do ostrego preparowania i czyszczenia izolowanej nerki</td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica</td><td>14048142075</td><td>Opcjonalny element do kalibracji ruchu ostrza podczas cięcia</td></tr><tr><td>VT1200 S Wibrujące ostrze Mikrotom</td><td>Leica</td><td>14912000001</td><td>Konfiguracja 1 jest używana w naszym protokole</td></tr></tbody></table>

izolowanie i obrazowanie żywych, nienaruszonych obszarów rozrusznika serca miednicy nerkowej myszy poprzez wycięcie wibratomem

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Miedniczka nerkowa (RP) to lejkowata struktura mięśni gładkich, która ułatwia prawidłowy transport moczu z nerki do moczowodu poprzez regularne, napędzające skurcze. Regularne skurcze RP zależą od aktywności rozrusznika serca, która pochodzi z najbardziej proksymalnego obszaru RP na połączeniu miednica-nerka (PKJ). Ze względu na trudności w dostępie i zachowaniu nienaruszonych preparatów PKJ, większość badań nad rozrusznikiem RP koncentrowała się na elektrofizjologii pojedynczych komórek i eksperymentach obrazowania Ca2+. Chociaż w wyniku takich prac wyłoniły się ważne odkrycia na temat rozrusznika serca RP, eksperymenty te mają kilka wewnętrznych ograniczeń, w tym niemożność dokładnego określenia tożsamości komórkowej w mieszanych zawiesinach oraz brak obrazowania in situ aktywności rozrusznika RP. Czynniki te spowodowały ograniczone zrozumienie mechanizmów, które leżą u podstaw normalnych rytmicznych skurczów RP. W niniejszej pracy opisano protokół przygotowania nienaruszonych segmentów mysiego PKJ przy użyciu techniki przekroju wibratomowego. Łącząc to podejście z myszami wykazującymi ekspresję specyficznych dla komórek reporterów i genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +, badacze mogą być w stanie dokładniej zbadać określone typy komórek i mechanizmy odpowiedzialne za perystaltyczne skurcze RP, które są niezbędne do prawidłowego transportu moczu.

Obrazowanie Ca2+ in situ w obrębie PKJ może ujawnić istotną aktywność komórkową komórek rozrusznikowych RP. Dzięki zastosowaniu myszy wykazujących ekspresję genetycznie zakodowanych wskaźników Ca2+ (takich jak GCaMP), sterowanych przez specyficzne dla komórek promotory, informacje o rozrusznikowej aktywności RP można uzyskać z dokładnością i szczegółowością nieosiągalną w eksperymentach obrazowania Ca2+ na preparatach RP w formie płaskich arkuszy. Początek PKJ charakteryzuje się nagłym pojawieniem się półkoli mięśni zawieszonych pomiędzy tkanką miąższową nerki (Rycina 2C; proksymalny odcinek PKJ objęty przerywanym prostokątem). Podczas kolejnych serii cięcia rdzeń wewnętrzny staje się odróżnialny od otaczającej go tkanki korowej. W mikroskopie świetlnym rdzeń wewnętrzny wydaje się w niektórych obszarach prążkowany, ma jaśniejszy kolor w porównaniu z tkanką korową i jest nieciągły wzdłuż swojej osi długiej względem reszty nerki (Rycina 2B,D). W tym momencie zaczną pojawiać się kolejne obszary PKJ. Przykłady tego przedstawiono na Rycynie 2D (przerywane prostokąty H i G), gdzie 3 półkola mięśni są zawieszone w tkance miąższowej. Prążki mięśniowe te będą ściśle przylegać do brodawki wewnętrznej i zazwyczaj będą sąsiadować z tętniczką nerkową (Rycina 2D, przerywane prostokąty; Rycina 2F-H, czarne groty strzałek). W miarę uzyskiwania bardziej dystalnych przekrojów, prążki mięśniowe te zintegrują się, tworząc bardziej kompletną, jednolitą strukturę, co wskazuje na koniec obszaru PKJ (Rycina 2E). 
Rycina 3A,B przedstawia przekrój PKJ przy małym powiększeniu (4-10x) z myszy wykazującej ekspresję GCaMP w komórkach PDGFRα+ (GCaMP6f wykazany przez indukowalną rekombinazę Cre sterowaną przez Pdgfra). Korzystając z punktów orientacyjnych, takich jak tętniczka nerkowa (Rycina 3A; gwiazdka), badacze powinni być w stanie łatwo odróżnić cienką ścianę PKJ zawieszoną pomiędzy tkanką miąższową (Rycina 3B; gwiazdki). Ekspresja GCaMP6f w tej specyficznej tkance transgenicznej rozciąga się na całą szerokość PKJ, obejmując zarówno warstwę mięśniową, jak i osierdzie (Rycina 3C).
W skrawkach nerki PDGFRα+ GCaMP6f+ sieć komórek, która zazwyczaj rozciąga się na całą szerokość ściany PKJ, będzie fluorescencyjna (Rycina 3C) i wykaże oscylujące przejściowe stężenia Ca2+ o różnych czasach trwania i częstotliwościach. Komórki PDGFRα+ w ścianie PKJ wykazują dwa różne typy czasu trwania przejść Ca2+. W warstwie błony zewnętrznej (zorientowanej bliżej kory) komórki PDGFRα+ występują jako sieć komórek o zdefiniowanych wypustkach. Komórki PDGFRα+ błony zewnętrznej wykazują niski częstotliwości (4 ± 2.7 Hz) i długi czas trwania (1 ± 0.67 s) przejść Ca2+. Druga warstwa komórek PDGFRα+ , obecna w warstwie mięśniowej (zorientowanej bliżej rdzenia), wykazuje podobne częstotliwości i czasy trwania przejść Ca2+ jak komórki SMC GCaMP3+ (opisane poniżej), ponieważ są one tym samym typem komórek.
W przekrojach nerkowych SMC GCaMP3+ warstwa komórek GCaMP3+ znajduje się w warstwie mięśniowej (Rycina 3D). W warstwie zewnętrznej nie występuje sygnał fluorescencyjny (Rycina 3D; gwiazdka). Komórki SMC GCaMP3+ w warstwie mięśniowej zazwyczaj wykazują przejściowe wzrosty stężenia Ca2+ o wysokiej częstotliwości (10 ± 4 Hz) i krótkim czasie trwania (632 ± 74 s). Komórki PDGFRα+ zlokalizowane w warstwie zewnętrznej PKJ wykazują długotrwałe, niskoczęstotliwościowe przejścia Ca2+ (Rycina 3E, Wideo 1). Jednakże eksperymenty obrazowania Ca2+ w tkance wykazującej ekspresję GCaMP3 sterowaną przez promotor Myh11 są ograniczone do części mięśniowej PKJ (Rycina 3D). W porównaniu z komórkami PDGFRα+ w warstwie zewnętrznej, komórki SMC generowały częściej przejścia Ca2+ o krótszym czasie trwania (Rycina 3F, Wideo 2).
Oprócz zrozumienia właściwości sygnalizacyjnych w komórkach IC PDGFRα+ PKJ, w niniejszej pracy zademonstrowano zastosowanie tej techniki do badania innych typów komórek w przekrojach nerki wykonanych wibratomem. Po dokładnym zbadaniu rdzenia nerki (u myszy wykazujących ekspresję GCaMP6f w komórkach PDGFRα+) zaobserwowano szereg fluorescencyjnych sygnałów Ca2+ w obrębie i wokół cewek zbiorczych (Wideo 3). Komórki PDGFRα+ rdzenia nerki wykazywały spontaniczne przejściowe wzrosty poziomu Ca2+ o zmiennej częstotliwości i czasie trwania. Badania obrazowania Ca2+ w przekrojach nerek wykonanych wibratomem można również rozszerzyć na badanie tętniczek nerkowych (o średnicy ~50-80 mm), które często sąsiadują z segmentami mięśniowymi PKJ (Rysunek 2F,G; białe strzałki). Obrazowanie Ca2+ w tętniczkach nerkowych (z tkanki wykazującej ekspresję GCaMP w komórkach mięśni gładkich) wykazuje oscylacyjne przejścia Ca2+ w SMC (Wideo 4).
<img alt="Schemat anatomii nerki oraz zdjęcia mikroskopowe przedstawiające strukturę miąższu, rdzenia i brodawek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62040/62040fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Podstawowa anatomia nerki i lokalizacja regionu rozrusznikowego PKJ. (A) Schemat nienaruszonej nerki przedstawiający orientację RP i moczowodu. Tętnica nerkowa i żyła nerkowa są zaznaczone odpowiednio na czerwono i niebiesko. (B) Nienaruszoną nerkę można przeciąć wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, aby odsłonić wewnętrzną część nerki, w tym rdzeń, brodawkę (dystalna część rdzenia, w której zbiegają się cewki zbiorcze) oraz proksymalną i dystalną część RP. (C) Rdzeń i brodawkę można wyciąć, aby całkowicie odsłonić PKJ i proksymalną część RP. (D i E) przedstawiają odpowiednio obrazy w świetle przechodzącym z regionu rozrusznikowego PKJ i dystalnej części RP. Sekwencyjne cięcia w kierunku końca dystalnego miednicy prowadzą do połączenia się półkoli mięśniowych w regionie PKJ (Di) w jeden, grubszy pierścień mięśniowy (Ei), który otacza całą brodawkę. Czarne, przerywane prostokąty na Di i Ei wskazują przybliżone obszary w koronarnych przekrojach nerki, z których pozyskano obrazy w świetle przechodzącym. Orientacja obrazów D i E jest obrócona o 90° przeciwnie do ruchu wskazówek zegara względem odpowiednich wstawek (Di i Ei). Paski skali na D i E = 20 µm. Skróty: RP = miedniczka nerkowa; prox RP = proksymalna miedniczka nerkowa; PKJ = połączenie miedniczki z nerką; PICs = komórki śródmiąższowe dodatnie pod kątem receptora alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego; SMC = komórka mięśni gładkich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/62040fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu sekcjonowania nerki; ustawienie wibratomu; mikroskopowa analiza tkanki nerkowej; histologia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62040/62040fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Rycina 2: Sekcjonowanie całych nerek za pomocą wibratomu w celu uzyskania cienkich przekrojów. (A) Nerki są montowane stroną moczowodu do dołu na podstawie wibratomu, a standardowe ostrze (zamocowane w głowicy wibratomu) jest wykorzystywane do wycinania kolejnych przekrojów od końca proksymalnego do dystalnego nerki. (B) Schematyczny rysunek cienkiego przekroju wyciętego z całej nerki z naniesionymi punktami orientacyjnymi. Segmenty mięśniowe PKJ (czarny przerywany prostokąt) często znajdują się w zawieszeniu pomiędzy tkanką miąższową. (C) Obraz mikroskopowy w świetle przesyłanym proksymalnego przekroju nerki. Obecność pasm mięśniowych zawieszonych między tkanką miąższową wskazuje na początek proksymalnych projekcji PKJ (oznaczone wewnątrz białego przerywanego prostokąta). (D) Obraz mikroskopowy w świetle przesyłanym reprezentujący optymalny obszar, w którym można znaleźć wiele (2-3) segmentów PKJ (obszary wewnątrz białych przerywanych prostokątów). Cienkie paski mięśniowe PKJ są zawieszone między miąższem nerki i ściśle przylegają do tętniczek nerkowych oraz rdzenia. (E) Obraz mikroskopowy w świetle przesyłanym dystalnego przekroju nerki. Poszczególne segmenty mięśniowe zlały się, tworząc pojedyncze, ciągłe pasmo mięśniowe (biały przerywany prostokąt), które otacza wewnętrzną papillę (niewidoczną na tym obrazie). Paski skali C-E = 500 µm. F-H Powiększone (20x) obszary z panelu D wskazują lokalizację PKJ (czarne groty strzałek), tętniczek nerkowych (białe groty strzałek) oraz miejsca cięcia do izolacji PKJ (białe przerywane linie). Paski skali F-H = 100 µm. Skrót: PKJ = połączenie miedniczkowo-nerkowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/62040fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie histologiczne kory i rdzenia nerki; wykresy częstotliwości i czasu trwania przejściowych wzrostów poziomu wapnia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62040/62040fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Ca2+ obrazowanie skrawków wykonanych za pomocą wibratomu. (A) Reprezentatywny obraz przy małym powiększeniu (4x) przekroju wykonanego w wibrotomie, wskazujący lokalizację tętniczki nerkowej (gwiazdka). Pasek skali = 200 µm. (B) Powiększony (20x) reprezentatywny obraz PKJ (oznakowany), zawieszonego pomiędzy tkanką miąższową nerki, wskazujący lokalizację mięśnia PKJ (biała grot), tętniczki nerkowej (gwiazdka). Pasek skali = 50 µm. (C) Obraz przy dużym powiększeniu (40x) PKJ wykazujących ekspresję GCaMP w PDGFRα+ komórki. Pasek skali = 20 µm. (DZdjęcie przy dużym powiększeniu (20x) PKJ wykazującej ekspresję GCaMP w komórkach mięśni gładkich. Pasek skali = 20 µm. (E) Spacjoczasowa mapa Ca2+ przejściowe sygnały fluorescencji zarejestrowane z GCaMP+ PDGFRα+ komórka wskazana na panelu CTabela wyszukiwania zakodowana dla F/F0. (F) Spatiotemporalna mapa Ca2+2+ transjenty pobrane z GCaMP+ PDGFRα+ komórka wskazana na panelu DTabela wyszukiwania zakodowana dla F/F0. (G) Reprezentatywne dane dla Ca2+ częstotliwość przejściowa (Hz) dla GCaMP+ PDGFRα+ komórki i GCaMP+ komórki smMHC. (H) Reprezentatywne dane dla Ca2+ czas trwania przejściowego (s) dla GCaMP+ PDGFRα+ komórki i GCaMP+ komórki smMHC. Skróty: PKJ = miejsce połączenia miednicy z nerką; PDGFRα+ = dodatni w kierunku receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego alfa; smMHC = ciężki łańcuch miozyny mięśni gładkich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/62040fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo 1: Spontaniczne przejściowe wzrosty stężenia Ca2+ w komórkach GCaMP+ PDGFRα+ w przekrojach vibratomowych PKJ. Skróty: PKJ = połączenie miedniczno-nerkowe; PDGFRα+ = dodatnie pod kątem receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego alfa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/Video_1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Wideo 2: Spontaniczne przejścia Ca2+ w komórkach mięśni gładkich GCaMP+ w przekrojach wibratomem z połączenia miedniczno-nerkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/Video_2.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
Wideo 3: Spontaniczne przejściowe zmiany stężenia Ca2+ w komórkach GCaMP+ PDGFRα+ w przekrojach rdzenia nerki wykonanych przy użyciu wibratomu. Skrót: PDGFRα+ = dodatnie pod kątem receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego alfa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/Video_3.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Wideo 4: Aktywność przejściowa Ca2+ o niskiej amplitudzie w przekrojach tętniczki nerkowej wykonanych w wibratomie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/Video_4.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Celem tego protokołu jest wyizolowanie nienaruszonych obszarów rozrusznika miednicy nerkowej myszy za pomocą sekcji wibratomowej. Skrawki te można następnie wykorzystać do obrazowania Ca2 + in situ w celu wyjaśnienia przejściowych właściwości Ca2 + komórek rozrusznika serca i innych komórek śródmiąższowych w warstwach wibratomu.

Izolowanie i obrazowanie żywych, nienaruszonych obszarów rozrusznika serca miednicy nerkowej myszy poprzez wycięcie wibratomem

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Protokół ten daje nienaruszone obszary rozrusznika serca w miedniczce nerkowej, narządzie mięśni gładkich w nerce, który pompuje mocz do moczowodu i pęcherza. W przeciwieństwie do izolowania komórek z miedniczki nerkowej, podejście to zapewnia nienaruszone środowisko in situ obszarów rozrusznika miedniczki nerkowej i bardziej fizjologiczne przygotowanie do badania rozrusznika miednicy nerkowej. Osoba, która nigdy nie wykonywała tej techniki, może mieć trudności z wycinaniem jednolitych odcinków.Początkujący użytkownik musi upewnić się, że nerka jest wypoziomowana na etapie wibratomu i nie przyspiesza procesu cięcia. Za pomocą kleszczy do tkanek wewnętrznych i nożyczek do rozwarstwiania wewnętrznego uszczypnij jelita i oderwij je od ściany brzucha. Jednocześnie odetnij spód jelit od ciała na bliższej dwunastnicy i dystalnej części okrężnicy, aby uzyskać dostęp do przestrzeni zaotrzewnowej zawierającej nerki.Delikatnie ściśnij i unieś dystalny koniec moczowodu za pomocą kleszczy tkankowych. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć pod ściśniętym moczowodem w kierunku nerki, aż zostanie uwolniony od otaczającej tkanki łącznej. Po odsłonięciu nerek należy je usunąć pojedynczo.Napełnij naczynie pokryte elastomerem silikonowym lodowatym roztworem KRB. Przenieś nerkę do naczynia preparacyjnego i upewnij się, że jest całkowicie zanurzona. Użyj cienkich nożyczek sprężynowych i kleszczyków wewnętrznych, aby usunąć tkankę tłuszczową z podstawy nerki, aby odsłonić dystalną miedniczkę nerkową lub RP i proksymalny moczowód.Usuń bliższy moczowód i część dystalnego RP z podstawy za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych i kleszczyków. Przebić zewnętrzną torebkę nerkową kleszczami z cienką końcówką, odchylając końcówki od trzonu nerki. Za pomocą kleszczy każdą ręką ściśnij luźne końce kapsułki i rozsuń je, aż pozostała błona torebki nerkowej zostanie całkowicie usunięta.Włóż żyletkę do uchwytu ostrza wibratomu i wyreguluj kąt prześwitu ostrza na około 18 stopni. Dostosuj parametry ostrza zgodnie z opisem w manuskrypcie, upewniając się, że grubość odcinka nerkowego nie przekracza 150 mikrometrów, co negatywnie wpłynęłoby na eksperymenty obrazowania jonów wapnia. Użyj tępo zakończonych kleszczy, aby delikatnie chwycić i usunąć przygotowaną nerkę z lodowatego roztworu KRB.Natychmiast umieść nerkę na bibułie chłonnej na około dwie do czterech sekund, aby usunąć nadmiar wilgoci zewnętrznej. Delikatnie przetoczyć nerkę po bibule chłonnej, aby upewnić się, że wszystkie boki miąższu wyschły, aby zapewnić optymalne przyleganie nerki do etapu wibratomu. Natychmiast nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na podstawę płytki próbki wibratomu i za pomocą tępo zakończonych kleszczyków umieść moczowód nerki stroną do dołu na obszarze pokrytym klejem.Delikatnie uciskaj w dół górną część nerki płaską krawędzią kleszczy przez około 10 do 20 sekund, aby wysuszyć klej. Mocno przymocować płytkę z próbką do dna tacki buforowej i wyregulować poziom roztworu KRB tak, aby górna część nerki była całkowicie zanurzona. Aby uzyskać automatyczne cięcie wibratomowe, wybierz pozycję początkową i końcową cyklu cięcia ostrza wibratomu w odległości od 0.5 do 1 centymetra od nerki, aby upewnić się, że cała płaszczyzna nerki zostanie przecięta.Rozpocznij automatyczny proces cięcia, upewniając się, że ostrze styka się z nerką. Za pomocą kleszczy zbierz skrawki, które są uwolnione z nerki i natychmiast przenieś je do poszczególnych studzienek. Kontynuuj protokół sekcji i użyj mikroskopu świetlnego, aby zidentyfikować regiony PKJ w wycinkach nerki, aż regiony PKJ staną się bardziej widoczne.Napełnij naczynie obrazowe pokryte elastomerem silikonowym lodowatym roztworem KRB. Przenieś pojedynczy plasterek nerki na naczynie. Włóż szpilki Minutien na obwodzie wycinka nerki, aby przymocować sekcję do podstawy naczynia do obrazowania.Umieść czaszę obrazowania na stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i natychmiast rozpocznij perfuzję roztworem KRB. Użyj soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie o małym powiększeniu, aby zlokalizować wycinek nerki. Wyśrodkuj pole obrazowania na obszarach przekroju, w których znajduje się PKJ, za pomocą punktów orientacyjnych.Po zlokalizowaniu PKJ użyj soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie o większym powiększeniu, aby powiększyć obszar zainteresowania. Rozróżnij różne interesujące komórki w różnych typach przejściowych czasów trwania jonów wapnia w ścianie PKJ. Po zidentyfikowaniu interesujących komórek dostosuj intensywność lasera, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu i rejestruj obrazy z czasową częstotliwością próbkowania od 16 do 32 Hz.Lekkie obrazy mikroskopowe całych odcinków nerek pokazują opatrzone adnotacjami punkty orientacyjne pojedynczego regionu PKJ. Wiele regionów PKJ występuje w pobliżu rdzenia wewnętrznego i dystalnej nerki. Lokalizacje tętnic nerkowych PKJ i granice PKJ są pokazane tutaj.Pokazano tutaj przekrój PKJ myszy wyrażający GCaMP w komórkach alfa-dodatnich PDGFR. Cienką ścianę PKJ zawieszoną między tkanką miąższową można odróżnić za pomocą punktów orientacyjnych, takich jak tętniczka nerkowa. Ekspresja GCaMP6f w tej specyficznej tkance transgenicznej jest rozłożona na całej szerokości PKJ zarówno w warstwie mięśniowej, jak i przybyszowej.W dodatnich wycinkach nerki PDGFR alfa GCaMP6f sieć komórek, która zwykle rozciąga się na całej szerokości ściany PKJ, jest fluorescencyjna i wykazuje oscylujące stany przejściowe jonów wapnia o różnym czasie trwania i częstotliwości. W wycinkach nerek SMC GCaMP3 dodatnich w warstwie mięśniowej znajduje się warstwa komórek GCaMP3 dodatnich. Mapa czasoprzestrzenna pokazuje, że komórki alfa-dodatnie PDGFR zlokalizowane w przydance PKJ wywołują długotrwałe stany przejściowe jonów wapnia o niskiej częstotliwości, podczas gdy SMC częściej wystrzeliwały krótkotrwałe stany przejściowe jonów wapnia.Podobnie, zaobserwowano również szereg fluorescencyjnych sygnałów jonów wapnia w kanałach zbiorczych i wokół nich oraz oscylujące stany przejściowe jonów wapnia w SMC. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby nerka była jak najbardziej wypoziomowana podczas sekcji wibratomowej, aby zapewnić uwolnienie jednolitych wycinków nerki z bloku. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak izolacja pojedynczych komórek, immunohistochemia i badania molekularne, aby lepiej zrozumieć mechanizmy rozrusznika serca w miedniczce nerkowej.

isolating-imaging-live-intact-pacemaker-regions-mouse-renal-pelvis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie opisujemy procedurę pobierania nerki z przestrzeni zaotrzewnowej myszy. Wyekstrahowaną nerkę można następnie poddać mikrosekcji w celu uzyskania nienaruszonej nerki bez torebki nerkowej i otaczającej warstwy tłuszczu.

Ekstrakcja nienaruszonej nerki od myszy: technika uzyskiwania nerki bez torebki nerkowej z modeli mysich

W tym filmie pokazujemy wibratom przekroju całej nerki myszy w celu uzyskania cienkich plasterków. Te pokrojone skrawki tkanki mogą być przechowywane w niskich temperaturach do czasu dalszej analizy.

Przekroje wibratomowe całej mysiej nerki: technika generowania cienkich odcinków mysiej nerki

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Tutaj prezentujemy protokół optycznego mapowania aktywności elektrycznej z prawego przedsionka myszy, a zwłaszcza węzła zatokowo-przedsionkowego, w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy przygotowanie żywotnych wycinków komorowych od dorosłych myszy i ich wykorzystanie do rejestracji potencjału czynnościowego elektrod ostrych. Te wielokomórkowe preparaty zapewniają zachowaną in vivo strukturę tkankową, co czyni je cennym modelem do badań elektrofizjologicznych i farmakologicznych in vitro.

Mysie plastry serca o krótkiej osi do badań elektrofizjologicznych

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.

Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Poznaj metodę izolacji i obrazowania żywych obszarów rozrusznika miednicy nerkowej myszy przy użyciu wibratomu. Technika umożliwia badanie mechanizmów komórkowych odpowiedzialnych za rytmiczne skurcze niezbędne do transportu moczu.

Izolowanie i obrazowanie żywych, nienaruszonych obszarów rozrusznika serca miednicy nerkowej myszy poprzez wycięcie wibratomem

Przeglądaj więcej filmów