Izolowanie i obrazowanie żywych, nienaruszonych obszarów rozrusznika serca miednicy nerkowej myszy poprzez wycięcie wibratomem

Protokół ten daje nienaruszone obszary rozrusznika serca w miedniczce nerkowej, narządzie mięśni gładkich w nerce, który pompuje mocz do moczowodu i pęcherza. W przeciwieństwie do izolowania komórek z miedniczki nerkowej, podejście to zapewnia nienaruszone środowisko in situ obszarów rozrusznika miedniczki nerkowej i bardziej fizjologiczne przygotowanie do badania rozrusznika miednicy nerkowej. Osoba, która nigdy nie wykonywała tej techniki, może mieć trudności z wycinaniem jednolitych odcinków.

Początkujący użytkownik musi upewnić się, że nerka jest wypoziomowana na etapie wibratomu i nie przyspiesza procesu cięcia. Za pomocą kleszczy do tkanek wewnętrznych i nożyczek do rozwarstwiania wewnętrznego uszczypnij jelita i oderwij je od ściany brzucha. Jednocześnie odetnij spód jelit od ciała na bliższej dwunastnicy i dystalnej części okrężnicy, aby uzyskać dostęp do przestrzeni zaotrzewnowej zawierającej nerki.

Delikatnie ściśnij i unieś dystalny koniec moczowodu za pomocą kleszczy tkankowych. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć pod ściśniętym moczowodem w kierunku nerki, aż zostanie uwolniony od otaczającej tkanki łącznej. Po odsłonięciu nerek należy je usunąć pojedynczo.

Napełnij naczynie pokryte elastomerem silikonowym lodowatym roztworem KRB. Przenieś nerkę do naczynia preparacyjnego i upewnij się, że jest całkowicie zanurzona. Użyj cienkich nożyczek sprężynowych i kleszczyków wewnętrznych, aby usunąć tkankę tłuszczową z podstawy nerki, aby odsłonić dystalną miedniczkę nerkową lub RP i proksymalny moczowód.

Usuń bliższy moczowód i część dystalnego RP z podstawy za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych i kleszczyków. Przebić zewnętrzną torebkę nerkową kleszczami z cienką końcówką, odchylając końcówki od trzonu nerki. Za pomocą kleszczy każdą ręką ściśnij luźne końce kapsułki i rozsuń je, aż pozostała błona torebki nerkowej zostanie całkowicie usunięta.

Włóż żyletkę do uchwytu ostrza wibratomu i wyreguluj kąt prześwitu ostrza na około 18 stopni. Dostosuj parametry ostrza zgodnie z opisem w manuskrypcie, upewniając się, że grubość odcinka nerkowego nie przekracza 150 mikrometrów, co negatywnie wpłynęłoby na eksperymenty obrazowania jonów wapnia. Użyj tępo zakończonych kleszczy, aby delikatnie chwycić i usunąć przygotowaną nerkę z lodowatego roztworu KRB.

Natychmiast umieść nerkę na bibułie chłonnej na około dwie do czterech sekund, aby usunąć nadmiar wilgoci zewnętrznej. Delikatnie przetoczyć nerkę po bibule chłonnej, aby upewnić się, że wszystkie boki miąższu wyschły, aby zapewnić optymalne przyleganie nerki do etapu wibratomu. Natychmiast nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na podstawę płytki próbki wibratomu i za pomocą tępo zakończonych kleszczyków umieść moczowód nerki stroną do dołu na obszarze pokrytym klejem.

Delikatnie uciskaj w dół górną część nerki płaską krawędzią kleszczy przez około 10 do 20 sekund, aby wysuszyć klej. Mocno przymocować płytkę z próbką do dna tacki buforowej i wyregulować poziom roztworu KRB tak, aby górna część nerki była całkowicie zanurzona. Aby uzyskać automatyczne cięcie wibratomowe, wybierz pozycję początkową i końcową cyklu cięcia ostrza wibratomu w odległości od 0.5 do 1 centymetra od nerki, aby upewnić się, że cała płaszczyzna nerki zostanie przecięta.

Rozpocznij automatyczny proces cięcia, upewniając się, że ostrze styka się z nerką. Za pomocą kleszczy zbierz skrawki, które są uwolnione z nerki i natychmiast przenieś je do poszczególnych studzienek. Kontynuuj protokół sekcji i użyj mikroskopu świetlnego, aby zidentyfikować regiony PKJ w wycinkach nerki, aż regiony PKJ staną się bardziej widoczne.

Napełnij naczynie obrazowe pokryte elastomerem silikonowym lodowatym roztworem KRB. Przenieś pojedynczy plasterek nerki na naczynie. Włóż szpilki Minutien na obwodzie wycinka nerki, aby przymocować sekcję do podstawy naczynia do obrazowania.

Umieść czaszę obrazowania na stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i natychmiast rozpocznij perfuzję roztworem KRB. Użyj soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie o małym powiększeniu, aby zlokalizować wycinek nerki. Wyśrodkuj pole obrazowania na obszarach przekroju, w których znajduje się PKJ, za pomocą punktów orientacyjnych.

Po zlokalizowaniu PKJ użyj soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie o większym powiększeniu, aby powiększyć obszar zainteresowania. Rozróżnij różne interesujące komórki w różnych typach przejściowych czasów trwania jonów wapnia w ścianie PKJ. Po zidentyfikowaniu interesujących komórek dostosuj intensywność lasera, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu i rejestruj obrazy z czasową częstotliwością próbkowania od 16 do 32 Hz.

Lekkie obrazy mikroskopowe całych odcinków nerek pokazują opatrzone adnotacjami punkty orientacyjne pojedynczego regionu PKJ. Wiele regionów PKJ występuje w pobliżu rdzenia wewnętrznego i dystalnej nerki. Lokalizacje tętnic nerkowych PKJ i granice PKJ są pokazane tutaj.

Pokazano tutaj przekrój PKJ myszy wyrażający GCaMP w komórkach alfa-dodatnich PDGFR. Cienką ścianę PKJ zawieszoną między tkanką miąższową można odróżnić za pomocą punktów orientacyjnych, takich jak tętniczka nerkowa. Ekspresja GCaMP6f w tej specyficznej tkance transgenicznej jest rozłożona na całej szerokości PKJ zarówno w warstwie mięśniowej, jak i przybyszowej.

W dodatnich wycinkach nerki PDGFR alfa GCaMP6f sieć komórek, która zwykle rozciąga się na całej szerokości ściany PKJ, jest fluorescencyjna i wykazuje oscylujące stany przejściowe jonów wapnia o różnym czasie trwania i częstotliwości. W wycinkach nerek SMC GCaMP3 dodatnich w warstwie mięśniowej znajduje się warstwa komórek GCaMP3 dodatnich. Mapa czasoprzestrzenna pokazuje, że komórki alfa-dodatnie PDGFR zlokalizowane w przydance PKJ wywołują długotrwałe stany przejściowe jonów wapnia o niskiej częstotliwości, podczas gdy SMC częściej wystrzeliwały krótkotrwałe stany przejściowe jonów wapnia.

Podobnie, zaobserwowano również szereg fluorescencyjnych sygnałów jonów wapnia w kanałach zbiorczych i wokół nich oraz oscylujące stany przejściowe jonów wapnia w SMC. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby nerka była jak najbardziej wypoziomowana podczas sekcji wibratomowej, aby zapewnić uwolnienie jednolitych wycinków nerki z bloku. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak izolacja pojedynczych komórek, immunohistochemia i badania molekularne, aby lepiej zrozumieć mechanizmy rozrusznika serca w miedniczce nerkowej.