Przewodnik krok po kroku po elektroantennografii komarów
10 marca 2021
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje krok po kroku protokół udanych i nisko stosowanych elektroantennogramów u kilku rodzajów komarów, w tym zarówno u samic, jak i u samców.
W przypadku elektroantennografii wykorzystanie komarów w określonym i stałym stanie fizjologicznym ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników. Protokół krok po kroku pozwala na trwałe zapisy elektroantennograficzne u komarów. Metodę można stosować u kilku gatunków komarów, zarówno u samców, jak i samic.
Technikę elektroantennograficzną można również przenieść na inne modele owadów, w tym chrząszcze, muchy, całujące robaki i mrówki. Na początek wyjmij 1,5-mililitrowe bursztynowe fiolki zawierające mieszaniny substancji zapachowych i kontrolę rozpuszczalnika z zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza, w której są przechowywane, aby zapobiec degradacji. Następnie odpipetuj 10 mikrolitrów roztworu środka zapachowego na kawałek bibuły filtracyjnej załadowanej do oznakowanej szklanej strzykawki.
Odizoluj komary w dniu eksperymentu. Pracując pod mikroskopem, delikatnie rozbij końcówkę dwóch kapilar borokrzemianowych za pomocą włókien za pomocą kleszczy. Przed uruchomieniem elektroantennografii lub eksperymentu EAG upewnij się, że uchwyty elektrod są czyste w środku, bez zanieczyszczeń borokrzemianowych.
Następnie wykonaj chloryzację, mocząc srebrne druty uchwytów elektrod w czystym wybielaczu przez pięć minut, aż druty zmienią kolor na ciemny, matowoszary. Następnie opłucz przewody. Poluzuj gumowy korek i za pomocą igły o rozmiarze 20 napełnij wnętrze kapilary roztworem soli fizjologicznej.
Przepłucz naczynia włosowate i włóż druty do dwóch naczyń włosowatych. Trzymaj końcówkę drutu w odległości mniejszej niż jeden milimetr od końcówki kapilary. Przełóż kapilar przez gumowy pierścień wewnątrz uchwytu elektrody, nie łamiąc go i delikatnie dokręć gumowy korek, po upewnieniu się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
Użyj kapilary z szerszym otworem w uchwycie elektrody odniesienia i mniejszym otworem w uchwycie elektrody rejestrującej. Pozostaw dwa zamontowane uchwyty elektrod na mokrej chusteczce do czyszczenia, aby zapobiec wysychaniu końcówki do czasu, gdy będzie gotowa do zamontowania głowicy. Upewnij się, że stół powietrzny jest podniesiony.
W linii lotniczej nie ma blokady, a powietrze jest włączone. Sprawdź, czy zbiornik z powietrzem medycznym jest pełny, aby uniknąć jego wymiany w trakcie eksperymentu i potwierdź, że w nawilżaczu znajdują się pęcherzyki. Włącz komputery, aplikacje i zasilanie zaworu.
Po zweryfikowaniu połączenia internetowego dostarcz impuls sterujący, aby sprawdzić, czy zawór dostarczający impulsy działa. Umieść aluminiową płytkę na lodzie z kawałkiem mokrej chusteczki do czyszczenia i umieść małą porcję żelu elektrodowego w rogu. Umieść kubek na komary na lodzie, aby komar ostygł.
Przypnij końcówkę każdej anteny komara mikronożyczkami. Użyj kleszczy, aby przeciągnąć komara obok porcji żelu elektrody i delikatnie zanurz końcówkę każdej anteny w żelu. Za pomocą kleszczy wyciągnij czułki komarów, trzymając je obok siebie.
Posiekaj głowę komara za pomocą mikronożyczek. Delikatnie zanurz końcówkę elektrody referencyjnej w żelu i umieść ją w kontakcie z szyją, pozwalając, aby głowa przykleiła się do niej. Umieść elektrodę głowicy referencyjnej na mikromanipulatorze.
Podłącz oba uchwyty elektrod do amplifier. Użyj mikromanipulatora, aby umieścić elektrodę rejestrującą jak najbliżej końcówek anteny. Następnie włóż końcówki anteny do elektrody nagrywającej.
Umieść rurkę powietrzną blisko preparatu na głowę komara, w odległości jednego centymetra. Włącz amplifier i reduktor szumów i upewnij się, że sygnał linii podstawowej nie jest zaszumiony. Gdy poziom hałasu jest zadowalający, włóż pierwszą strzykawkę zapachową do otworu w przewodzie powietrznym, aby wykonać test i zamknij klatkę Faradaya.
Następnie kliknij przycisk nagrywania w oprogramowaniu EAG, aby dostarczyć impuls. Zmierz odpowiedzi EAG jako amplitudę w miliwoltach, a następnie przejdź do następnego zapachu lub stężenia. Eksperyment z powodzeniem pokazuje, że gatunki komarów mogą wykazywać zmienne reakcje węchowe na różne substancje chemiczne.
Nie stwierdzono reakcji na olej mineralny, który stosowano jako kontrolę negatywną. Błąd w wynikach spowodowany szumem elektrycznym można zmniejszyć, uziemiając elementy do klatki Faradaya za pomocą zacisków krokodylkowych. Próg reakcji na ten sam środek zapachowy może mieć różną wielkość dla różnych gatunków komarów.
Na przykład komary Toxorhynchites rutilus septentrionalis wytwarzają bardzo duże EAG w porównaniu z Aedes aegypti, Anopheles stephensi i Culex quinquefasciatus. Zauważono duże ugięcie w odpowiedzi na kontrolę pozytywną, benzaldehyd. Chociaż nie było odpowiedzi na negatywną kontrolę, olej mineralny.
Te średnie odpowiedzi anteny są pokazane na diagramie słupkowym. Dodatkowo próg wykrywania określonej substancji chemicznej dla każdego gatunku komarów określono poprzez przedstawienie anteny, rosnących stężeń substancji chemicznej i wykreślenie krzywej odpowiedzi na dawkę. Ważne jest, aby rozpocząć nagrywanie jak najszybciej po ścięciu i zamontowaniu głowy, aby zapewnić doskonałą responsywność preparatu.
EAG pozwala określić, czy czułki komarów reagują na daną substancję chemiczną w danym stężeniu. Nie pozwala jednak na określenie równowagi tej substancji chemicznej. Na przykład, czy jest to atraktant, czy pokuta.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy, krok po kroku opis protokołu przeprowadzania elektroantenogramów (EAG) u przedstawicieli różnych rodzajów komarów, podkreślając znaczenie stanu fizjologicznego dla uzyskania dokładnych pomiarów. Metoda ta jest możliwa do zastosowania zarówno w przypadku samców, jak i samic komarów, a także może zostać rozszerzona na inne modele owadzie.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Elektrofizjologia
- Odpowiedź węchowa owadów
- Ekologia behawioralna
Wstęp
- Znaczenie spójnego stanu fizjologicznego w elektroantenografii
- Zastosowania u wielu gatunków komarów
- Potencjał do przeniesienia metody na inne modele owadzie
Zastosowane metody
- Elektroantenografia (EAG)
- Gatunki komarów: Toxorhynchites rutilus septentrionalis, Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus
- Zastosowanie mieszanin zapachowych i roztworów soli fizjologicznej
Główne wyniki
- Wykazano zmienność reakcji węchowych różnych gatunków komarów na poszczególne związki chemiczne
- Zwrócono uwagę na brak reakcji na kontrole negatywne oraz zmienność odpowiedzi w badaniu EAG
- Określono progi odpowiedzi na konkretne związki chemiczne u różnych gatunków
Wnioski
- Badanie pomyślnie ustanawia niezawodny protokół pomiaru reakcji węchowych u komarów.
- Technika EAG pomaga w zrozumieniu chemicznego przyciągania lub odstraszania w zachowaniu komarów, co jest istotne dla strategii zwalczania szkodników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektroantenografia (EAG) umożliwia ilościową ocenę odpowiedzi węchowych komarów na poszczególne substancje chemiczne oraz złożone mieszaniny, co wspiera wczesny etap walidacji celów dla strategii kontroli wektorów. Metoda ta zapewnia pewność prognostyczną w identyfikacji związków wywołujących detekcję sensoryczną, co pozwala na dobór potencjalnych atraktantów lub repelentów do badań translacyjnych. Integracja danych EAG z procesem odkrywania zwiększa możliwość mitygacji ryzyka mechanistycznego oraz priorytetyzację portfela programów interwencyjnych skierowanych przeciwko wektorom chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia analizę szlaków węchowych komarów w celu funkcjonalnej walidacji celów.
- Wspiera identyfikację związków aktywnych sensorycznie na potrzeby przesiewania opartego na hipotezach.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie odpowiedzi specyficznych dla gatunku i płci.
- Dostarcza danych do wstępnej selekcji cząsteczek kandydackich do dalszych testów behawioralnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane odczyty biologiczne w celu standaryzacji i powtarzalności testów.
- Generuje ilościowe pomiary amplitudy dla rzetelnej oceny związków.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy dla wielu rodzajów komarów.
- Umożliwia przygotowanie do przesiewu złożonych mieszanin odorantów oraz gradientów stężeń.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie danych o odpowiedziach węchowych do zachowań wektorów istotnych z punktu widzenia choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od detekcji molekularnej do walidacji behawioralnej w modelach przedklinicznych.
- Dostarcza informacji niezbędnych do dostosowania ryzyka przy wyborze związków kandydackich do kontroli wektorów.
- Wspiera identyfikację translacyjnych biomarkerów dla badań nad ekologią i interakcjami z gospodarzem.
Integracja potoku i procesu roboczego
EAG integruje proces odkrywania leków, od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną interwencji celowanych w wektory.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie reakcji czułków na wybrane związki chemiczne, wyjaśniające zaangażowanie szlaku węchowego.
- Screening: Dostarczanie powtarzalnych, ilościowych wyników do porównywania związków i opracowywania testów.
- Analityka: Umożliwienie analizy statystycznej zależności dawka-odpowiedź oraz progów detekcji specyficznych dla gatunku.
- Badania translacyjne: Połączenie detekcji molekularnej z efektami behawioralnymi w celu zapewnienia ciągłości przedklinicznej.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji dla różnych gatunków komarów i innych modeli owadzich w celu szerokiego zastosowania w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad węchem wektorów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar odpowiedzi węchowej w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań nad kandydowanymi związkami do kontroli wektorów, optymalizując alokację zasobów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację interwencji ukierunkowanych na wektory przenoszące choroby z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii i pracy z owadami.
- Wymaga specjalistycznej aparatury do rejestracji EAG oraz analizy danych.
- Wymaga standaryzacji stanu fizjologicznego i kontroli eksperymentalnych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do wielu rodzajów komarów i innych modeli owadzich po wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji protokołu.
- Kluczowe dla jakości danych są odpowiednie przygotowanie preparatów oraz zarządzanie szumem elektrycznym.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Odor Storage and Electrode Holder-Capillary Preparation
2:22
Electroantennography (EAG) Rig Preparation
2:57
Mosquito Head Preparation and Mounting
4:10
Recordings and Data Analysis
4:47
Results: Olfactory Mediated Behaviors of Mosquito Species from Various Genera
6:01
Conclusion
