Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa ze skaningiem blokowym (SBF-SEM) próbek tkanek biologicznych

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa zapewnia bezprecedensowy wgląd w trójwymiarowe ultrastruktury tkanek i może odpowiedzieć na wiele pytań, które wcześniej były niemożliwe lub niezwykle trudne do zbadania. Technika ta umożliwia szybkie i powtarzalne tworzenie trójwymiarowych zestawów danych przy minimalnym obciążeniu tkanek i artefaktach. I co ważne, pozwala na automatyczne przechwytywanie tysięcy obrazów dziennie.

Standardowa transmisyjna mikroskopia elektronowa zapewnia doskonałą ultrastrukturę komórkową. Jednak obrazy te nie mają trójwymiarowego kontekstu i mogą być trudne do interpretacji. Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa ze ścianą blokową zapewnia ten trójwymiarowy kontekst, umożliwiając interpretację złożonych procesów.

Chociaż protokół ten jest niezawodny i powtarzalny, niektóre kroki wymagają precyzji i są niezwykle ważne dla powodzenia tej metodologii. W tym filmie szczegółowo zademonstrujemy te kluczowe kroki. Po utrwaleniu próbek w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu, zawierającym 2,5% aldehydu glutarowego i dwa milimolowe chlorki wapnia, próbki należy pociąć na bloki nie większe niż dwa milimetry sześcienne i przemyć 0,1-molowym buforem kakodylanu sodu zawierającym dwa milimolowe chlorki wapnia.

Tkanka jest następnie sekwencyjnie barwiona żelazocyjankiem osmu, tiokarbohydrazydem i tetratlenkiem osmu. Po inkubacji tetratlenku osmu potraktuj tkankę 1% wodnym octanem uranylu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka rozpuść 0,066 grama azotanu ołowiu w 10 mililitrach 0,03 molowego roztworu kwasu asparaginowego i użyj jednego normalnego wodorotlenku potasu, aby dostosować pH roztworu asparaginianu ołowiu Waltona do 5,5.

Po podgrzaniu roztworu w piekarniku, umyj chusteczkę pięć razy przez trzy minuty na pranie w temperaturze pokojowej, podwójnie destylowanej wodzie, a następnie przenieś tkankę do ogrzanego o temperaturze 60 stopni Celsjusza roztworu asparaginianu ołowiu Waltona przez 30 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj tkankę i odwadnij ją w narastającej, lodowatej serii acetonu, a następnie wykonaj 10-minutową inkubację w acetonie o temperaturze pokojowej. Następnie umieść tkankę w stosunku 1:3 twardo zmieszanej żywicy z acetonem na cztery godziny infiltracji na obrotowej platformie, a następnie ośmiogodzinną lub nocną infiltrację w stosunku 1:1 roztworu żywicy do acetonu na obrotowej platformie, a następnie nocną infiltrację w stosunku 3:1 żywicy do acetonu na obracającej się platformie.

Następnego ranka naciekaj tkankę w świeżej 100% żywicy przez jedną cztero- do ośmiu godzin, jedną noc i jedną czterogodzinną infiltrację w temperaturze pokojowej na obrotowej platformie. Następnego ranka za pomocą drewnianego patyczka wymieszaj niewielką ilość żywicy z czarnym proszkiem, aż żywica zostanie nasycona proszkiem, ale nadal będzie płynna i nie stanie się ziarnista. Rezydencja powinna przypominać gęsty atrament i być w stanie powoli kapać bez widocznych grudek Umieść próbkę tkanki w formie z gumy silikonowej i uchwyć obraz do późniejszego odniesienia się do orientacji próbki w bloku żywicy.

Gdy próbka jest na miejscu, przykryj tkankę żywicą nasyconą sadzą na końcu formy silikonowej, z etykietą wskazującą szczegóły eksperymentalne i tkankowe w formie na przeciwległym końcu żywicy. Następnie umieść formę w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza pod kątem na około godzinę. Gdy żywica nasączona sadzą wystarczająco utwardzi się, wyjmij formę z piekarnika i zaczynając od pustej studzienki, wypełnij pozostałą część formy przezroczystą żywicą, uważając, aby etykieta pozostała widoczna.

Gdy próbka zostanie pokryta przezroczystą żywicą, umieść silikonową formę z powrotem w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza, a nie na pochyłości, na 48 godzin, a następnie wyjmij formę. Aby przygotować blok do obrazowania, umieść próbkę zatopioną w żywicy na uchwycie mikrotomowym tak, aby zwężający się koniec wystawał około pięciu do sześciu milimetrów z uchwytu. Zablokuj próbkę na miejscu za pomocą ustalającej i umieść próbkę pod lampą grzewczą.

Po kilku minutach umieść uchwyt w uchwycie mikroskopu stereoskopowego i użyj nowej, obosiecznej żyletki, aby wykonać cienkie odcinki równoległe do powierzchni bloku, aż tkanka będzie widoczna, która będzie mniej odblaskowa i ziarnista w porównaniu z częściami żywicy, które są pozbawione tkanki. Zabezpiecz aluminiowy kołek do próbkowania w uchwycie kołka do przycinania i wykonaj kilka głębokich, krzyżujących się zadrapań na powierzchni szpilki, aby zapewnić większą powierzchnię dla kleju używanego do utrzymywania próbki na miejscu. Umieść próbkę pod lampą grzewczą i wepchnij maszynkę do golenia od jednego do dwóch milimetrów prosto w dół do bloku żywicy przed wykonaniem drugiego, prostopadłego cięcia o równej głębokości w bloku, aby odciąć nadmiar żywicy z próbki tkanki tak, aby blok miał około trzech milimetrów średnicy i dwa do trzech milimetrów wysokości.

Po tym wstępnym przycięciu ponownie ogrzej blok pod lampą grzewczą i użyj nowej, obosiecznej żyletki, aby odciąć górną część bloku żywicy około jednego milimetra poniżej przyciętej części w jednym, gładkim cięciu. Umieść uchwyt kołka do przycinania, zawierający wycięty aluminiowy kołek, w gnieździe mikroskopu stereoskopowego i nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na powierzchnię szpilki tak, aby całkowicie zakryła szpilkę, nie tworząc widocznego menisku. Za pomocą kleszczy dociśnij przycięty kawałek tkanki do środka powierzchni szpilki próbki przez kilka sekund i pozwól klejowi zastygnąć przez kilka minut.

Gdy klej dokładnie wyschnie, zlokalizuj tkankę na podniesionej części bloku żywicy i użyj obosiecznej brzytwy, aby przyciąć podniesioną część żywicy zawierającą próbkę tkanki do obszaru nie większego niż jeden milimetr kwadratowy. Powoli i ostrożnie usuń jak najwięcej nadmiaru żywicy, pozostawiając blok nieco dłuższy w jednym wymiarze, i użyj końcowego metalowego pilnika, aby ustawić nadmiar żywicy pod kątem w obszarze poza podniesioną częścią zawierającą próbkę tkanki w dół w kierunku krawędzi szpilki. Usuń cząstki żywicy i pył z przygotowanej próbki przed nałożeniem cienkiej warstwy srebrnej farby i napylania złota na całą powierzchnię bloku próbki.

Po nałożeniu powłoki należy przyciąć nadmiar srebrnej farby z powierzchni czołowych bloków i umieścić zamontowany i przycięty blok w bulwiastym końcu wykonanej na zamówienie rurki do pipet transferowych z dołączoną odpowiednią etykietą. Za pomocą obrazowania SBF-SEM zidentyfikowano sieć wiązek mikrofibryli wolnych od elastyny w rogówce dorosłej myszy. Sieć ta jest zorganizowana w odrębne warstwy, z włóknami ściśle związanymi z keratocytami, nawet leżącymi w płytkich wgłębieniach na powierzchni keratocytów.

Zastosowanie tego protokołu doprowadziło do odkrycia nieznanej wcześniej populacji centralnych nerwów rogówki, które łączą się z komórkami podstawnego nabłonka na granicy zrębu i nabłonka. Obrazowanie SBF-SEM centralnej rogówki ujawnia obecność naczyń rąbkowych, wiązek nerwowych i powiązanych komórek, które można ręcznie podzielić na segmenty w celu rekonstrukcji 3D. Niektóre pułapki tej procedury obrazowania obejmują użycie zbyt długiego czasu przebywania pikseli, co może powodować faliste i zniekształcone kolejne obrazy, małe wyładowania elektronów z powierzchni bloku, prowadzące do szybkich zmian kontrastu w liniach, zadrapania noża na powierzchni bloku z powodu uszkodzonego noża lub nagromadzenie zanieczyszczeń na krawędzi noża, Artefakty z wydłużonej wiązki elektronów skupiają się na powierzchni bloku, gdy próbka znajduje się jeszcze w komorze obrazowania, niewłaściwe utrwalenie tkanki, prowadzące do oddzielenia struktur komórkowych i tkanki łącznej oraz przeskakiwanie obrazu w wyniku dużej ilości ładunku w tkance lub bloku żywicy.

Podczas cięcia bloku tkanki ważne jest, aby dobrze zrozumieć, gdzie znajduje się tkanka w bloku, aby przypadkowo nie odciąć żadnych ważnych obszarów próbki. Jeśli pożądane są obrazy o wyższej rozdzielczości określonych struktur komórkowych lub interakcji, obrazowanie można zatrzymać, usunąć blok z mikroskopu, a skrawki wyciąć na ultramikrotomie, gdzie można je obejrzeć w transmisyjnym mikroskopie elektronowym Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa z blokową powierzchnią pozwala na całkowicie unikalny widok tkanek biologicznych. Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie szybko pozyskać wysokiej jakości zestawy danych i rozszerzyć zakres tkanek, które możemy badać.