Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Technika ta zachowuje wszystkie warstwy siatkówki i typy komórek in situ, dzięki czemu jest bardziej przydatna klinicznie w porównaniu z modelami zwierzęcymi i in vitro. Główną zaletą tego protokołu jest to, że minimalizuje on naruszenie integralności siatkówki podczas pracy z tkankami, co jest niezbędne przy porównywaniu zdrowej i chorej siatkówki. Choroby siatkówki można naśladować poprzez hodowlę tkanki w określonych warunkach.

Pozwala to na testowanie nowych terapii lekowych. Procedury preparacji i pobierania próbek są złożone. Dlatego demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, aby pomóc czytelnikom zrozumieć pisemny protokół i pomyślnie przeprowadzić procedurę.

Procedurę zademonstruje Charisse Kuo, doktorantka drugiego roku z mojego laboratorium. Przygotować pożywkę zawierającą zmodyfikowaną mieszaninę pożywki i składników odżywczych Dulbecco Eagle Medium F-12 oraz jednorazową mieszaninę antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych. Najpierw umieść 500 mikrolitrów pożywki na 24-dołkowej płytce i zrównoważ ją w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Przygotowanie podłoża przed ekstrakcją po eksplantacji pozwala uniknąć przemieszczenia siatkówki po późniejszym dodaniu implantu. W celu ekstrakcji eksplantatów siatkówki należy rozpocząć od umieszczenia muszli ocznej na szalce Petriego z tęczówką i soczewką skierowanymi do góry, a ONH stykającym się z szalką Petriego. Przytrzymaj muszlę oczną stabilnie na rąbku za pomocą kleszczy i odłącz tęczówkę i soczewkę, wykonując małe nacięcia wzdłuż zewnętrznej krawędzi rąbka.

Ostrożnie usuń tęczówkę i soczewkę, uważając, aby nie naruszyć siatkówki. Zidentyfikuj ONH za pomocą jasnego białego źródła światła i naciąć w czterech kwadrantach w kierunku ONH, obracając szalkę Petriego dla łatwiejszej obsługi. Ostrożnie rozłóż i spłaszcz muszlę oczną.

Przyłóż kleszcze do twardówki zamiast do siatkówki, aby uniknąć naruszenia integralności siatkówki. Wyjąć z inkubatora płytkę zawierającą przygotowane podłoże. Umieść chirurgiczną trepanację na siatkówce w obszarze bez fałdów siatkówki i mocno dociśnij, aby przeniknąć do twardówki, która powinna generować trzaskający dźwięk podczas przebijania się przez szalkę Petriego.

Obrócić trepanację, aby upewnić się, że twardówka została całkowicie przebita, tak że eksplant siatkówki jest teraz oddzielony od reszty próbki. Przyłóż kleszcze do twardówki i przenieś eksplant siatkówki kanapkowej do pożywki hodowlanej. Hoduj zebrane eksplantaty siatkówki kanapkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do 72 godzin w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało, że eksplantaty siatkówki kanapkowej zachowały integralność i wyraźną strukturę blaszek od GCL do ONL ze zwartymi jądrami w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie jądrowej. Zakłóconą integralność siatkówki stwierdzono na krawędziach tej samej próbki, gdzie siatkówka odłączyła się od leżącej poniżej naczyniówki i twardówki RPE, wykazując zmniejszoną grubość siatkówki i utratę jąder w INL i ONL. W eksplantatach siatkówki hodowanych w warunkach bazowych nie stwierdzono TUNEL-dodatnich jąder komórkowych, które oznaczają apoptozę komórkową, wykazując utrzymującą się żywotność komórkową nawet po 72 godzinach.

Znakowanie GFAP było ograniczone do GCL i IPL bez zwłóknienia glejowego, oznaki patologii, która zostałaby zidentyfikowana jako rozszerzona ekspresja GFAP do ONL. Wimentyna ulegała silnej ekspresji od warstwy komórek zwojowych do zewnętrznej warstwy jądrowej, wykazując zachowaną integralność komórek Muellera, jak to widać w normalnych tkankach siatkówki. Test magnetyczny Luminex wykazał, że poziomy IL-18, VEGF, IL-6 i IL-8 wzrosły znacznie powyżej wartości wyjściowej w kulturach eksplantatów siatkówki kanapkowej w cytokinach o wysokim poziomie glukozy i cytokin prozapalnych po 24 godzinach.

Po 72 godzinach poziomy IL-18 i VEGF pozostały znacznie podwyższone, ale nie stwierdzono istotnej różnicy w poziomach IL-6 i IL-8. Podczas wykonywania tej procedury należy pozostawić wystarczającą ilość resztkowego ciała szklistego, które obciąży siatkówkę, aby nie oderwała się od naczyniówki RP i nie unosiła się w pożywce hodowlanej. Hodowaną siatkówkę można dalej scharakteryzować za pomocą immunohistochemii i histologii, podczas gdy cytokiny zapalne uwalniane do hodowanej pożywki można zmierzyć za pomocą testu magnetycznego Luminex.

Model ten jest bardziej przekładalny klinicznie w porównaniu z modelami zwierzęcymi i modelami in vitro, co sprawia, że jest bardziej odpowiedni do testowania skuteczności nowych leków terapeutycznych w chorobach siatkówki.