Name: Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj technikę patch-clamp do rejestrowania prądów jonowych w plemnikach ssaków. Metoda umożliwia badanie kanałów CatSper i ich roli w płodności męskiej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały wsparte przez grant NIH R01GM111802, Pew Biomedical Scholars Award 00028642, Alfred P. Sloan Award FR-2015-65398 oraz Packer Wentz Endowment Will (dla P.V.L.). Prace te były również wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (Niemiecką Fundację Badawczą) 368482240/GRK2416 (dla Nowego Meksyka) oraz przez China Scholarship Council Fellowship dla B.L. Dziękujemy dr Danowi Feldmanowi za udostępnienie tkanek szczura, Katie Klooster i Stuartowi Meyersowi z UC Davis za pomoc w pozyskiwaniu plemników naczelnych oraz Stevenowi Mansellowi za pomoc w analizie danych z plemników dzików i byków.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy szczegółowy protokół przeprowadzania rejestracji elektrofizjologicznych z komórek plemników różnych gatunków. Biorąc pod uwagę fizjologiczne znaczenie kanałów jonowych i elektrogennych transporterów dla plemników, technika ta jest potężnym narzędziem do badania fizjologii plemników oraz wad prowadzących do męskiej niepłodności. Eksperymentator może początkowo uznać wykonanie tej techniki za trudne, ale wraz z wytrwałością i wytrwałością przychodzi sukces.
Nasienie ssaków są długie (zwykle >50 μm), wąskie i bardzo ruchome. Podstawowa częstotliwość bicia (BF) plemników ssaków znacznie się różni, ze średnimi wartościami od 4 Hz (mysz 69), 7-15 Hz (dzik 70,71), 11 Hz (szczur 72), 11-20 Hz (byk 18), 24 Hz (makak rezus 23) oraz do 25 Hz (człowiek 3). Kropla cytoplazmatyczna (CD) jest wejściem do rejestracji z plemników. U plemników gryzoni płyta CD często znajduje się dystalnie, ale porusza się wzdłuż wicia (Rysunek 10), co stanowi dodatkową przeszkodę w nagrywaniu. Jednak w ludzkich komórkach plemników CD częściej znajduje się w pobliżu główki. Kluczowymi elementami skutecznego patch-clampu na plemniki są zatem doskonałe optyki umożliwiające wyraźny, ostry widok na CD oraz bardzo precyzyjny system mikromanipulacji bez dryfu czy drgań. Początkowo przewiduje się wysoki wskaźnik niepowodzenia, który jest normalny w ciągu pierwszych kilku dni od założenia plemnika. Zalecamy rutynowe ćwiczenia obejmujące wiele prób tygodniowo. Wykonywanie kilku nagrań dziennie w tygodniu ustanowi rutynę i poprawi umiejętności motoryczne.
Do niedawna identyfikacja i farmakologiczna charakterystyka kanałów jonowych plemników była utrudniona przez brak możliwości ich bezpośredniego badania. Dziedzina ta w dużej mierze opierała się na badaniach immunocytochemii, które często cierpią na niespecyficzność przeciwciał i/lub brak odpowiadających im modeli genetycznych. Do badania kanałów wapniowych szeroko stosowano klasyczną metodę obrazowania wapnia, która ma swoje zalety i ograniczenia 73,74,75,76,77. Chociaż obrazowanie wapnia jest stosunkowo prostą metodą, stosowalną w badaniach średnio- i wysokoprzepustowych 78,79,80,81 i jest mniej inwazyjna, wymaga stosunkowo nienaruszonych komórek, co stanowi przeszkodę w rozłożeniu funkcji kanałów jonowych oddzielonych od kaskad sygnalizacji wewnątrzkomórkowej lub w odróżnieniu ich od wymienników jonów wapnia. Dodatkowo trudno jest kontrolować potencjał błonowy, a tym samym trudniej jest wykluczyć wkład kanałów wapniowych zależnych od napięcia. Jedną z wielu zalet fluorometrii wapnia jest zastosowanie barwników proporcjonalnych wapnia, które pozwalają precyzyjnie mierzyć zmiany stężenia jonów wapnia. Jednocześnie należy pamiętać, że wrażliwość tych barwników może się różnić w zależności od zmian pH wewnątrzkomórkowego.
Poniżej opisujemy kluczowe kroki w protokole, w tym kroki rozwiązywania problemów metody. Niezbędne jest stosowanie wyłącznie czystych odczynników do przygotowania roztworów eksperymentalnych, ponieważ nawet niewielkie zanieczyszczenia niepożądanymi jonami (takimi jak magnez czy metale ciężkie) mogą utrudniać wykrywanie prądów jednowartościowych. Biorąc pod uwagę niewielki rozmiar plemników, można się spodziewać stosunkowo niewielkiej liczby kanałów jonowych na komórkę. W związku z tym prąd netto waha się od kilku pA do kilkuset pA. Dlatego wewnętrzny hałas elektryczny platformy musi być minimalny, aby wykryć niewielkie prądy, dlatego zaleca się stosowanie urządzeń wolnych od dryfu. Aby odróżnić konkretną przewodność od szumu elektrycznego i tła, aparat nagrywający i system uziemiający muszą być maksymalnie wykorzystane. Osiąga się to poprzez prawidłowe uziemienie urządzenia, aby uniknąć zakłóceń elektrycznych82. Zaleca się stosowanie klatki Faradaya, aby chronić przed zakłóceniami elektrycznymi wywołanymi przez różne urządzenia elektryczne, takie jak oświetlenie budynków czy instalacje elektryczne w ścianie. Niezbędne jest, aby wszystkie elektryczne elementy zestawu, w tym klawiatura komputerowa i myszka, emitowały niewiele lub wcale szumów elektrycznych (50 Hz lub 60 Hz) oraz aby wszystkie elementy były prawidłowo uziemione. Szum elektryczny w konfiguracji całej komórki, gdy wszystkie kanały jonowe są zamknięte, powinien wynosić < 0,5-1 pA.
Kolejnym ważnym punktem jest monitorowanie prawidłowej osmolarności roztworów roboczych. Skład roztworów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych musi być precyzyjnie określony, a ich osmolaria prawidłowo zmierzona. Roztwór zewnątrzkomórkowy musi być nieco hipotoniczny w porównaniu do roztworu pipety, ponieważ prowadzi do minimalnego obrzęku komórek i zapobiega zatkaniu pipety przez błonę plemnikową. Uwaga: jeśli roztwór pipety jest zbyt hipertoniczny i różni się od roztworu kąpielowego o więcej niż 10 mOsm, dochodzi do nadmiernego obrzęku komórek i pęknięcia uszczelnienia. W rezultacie komórka będzie krucha, a gigaseal zniknie w ciągu kilku sekund po włamaniu. Z naszego doświadczenia wynika, że niedokładne przygotowanie roztworu jest jednym z najczęstszych błędów, które uniemożliwiają skuteczne patch-clampowanie.
Kolejną potencjalną przeszkodą, której należy uniknąć, są plastiki zawierające plastyczne środki/ftalan, a także strzykawki smarowane olejem mineralnym. Rurki, strzykawki i cały plastikowy sprzęt, który trafia na roztwory, a więc plemniki, nie powinny wypłukiwać plastyfikatorów ani innych toksyn środowiskowych czy olejów, ponieważ takie substancje mogą znacząco zmieniać aktywność kanałów jonowych. Stosujemy rurki teflonowe o małej średnicy jako główną linię perfuzyjną. Teflon (PTFE) ma niewiele związków wymywania się i jest dość sztywny. Elastyczne połączenia wykonane są z rur krzemowych o wysokiej czystości, które pasują na teflonowe rurki. Wszystkie strzykawki używane w systemie perfuzji nie mają żadnego smaru, ponieważ olej mineralny lub inne dodatki smarujące mogą zakłócać rejestrację kanału jonowego.
Nie można przecenić znaczenia używania odpowiedniego szkła i dobrania odpowiedniego kształtu mikropipety. Dlatego optymalna produkcja szklanych mikropipet jest warunkiem koniecznym skutecznego łatania. Używamy szklanych mikropipet wykonanych wyłącznie ze szkła borokrzemowego zawierającego włókno, co zapewnia lepsze wypełnienie roztworu. Końcówka pipetek musi być polerowana ogniowo, aby zapewnić idealne szczelne uszczelnienie. Końcówki pipety o średnicy przekraczającej 2 μm (a tym samym o oporze 10 MΩ lub mniej) zazwyczaj nie nadają się do stosowania patch-clamp plemników.
Kolejnym ważnym krokiem jest upewnienie się, że końcówka mikropipety jest czysta z wszelkich zanieczyszczeń lub pęcherzyków powietrza przed utworzeniem uszczelnienia. Jest to trudne zadanie, ponieważ mikropipeta jest załadowana do roztworu pełnego komórek ruchomych. Jednym z czynników, które pomagają uniknąć przypadkowego "zderzenia" pipety z wolno pływającymi plemnikami, jest ciągłe perfuzje do usuwania wszystkich nienaturalnych komórek. Innym narzędziem jest domowej roboty "U-tube", która pozwala przełączać się między trybem dodatnim a ujemnym ciśnieniowym, aby utrzymać czubek w czystości (Rysunek 11 i Rysunek 12).
Ponieważ plemniki znacznie różnią się kształtem i wielkością kropelek cytoplazmatycznych (CD), ważne jest, aby wybrać kroplę o odpowiedniej morfologii. Jak pokazano na rysunku 2, do patch-clampu nadają się tylko płytki (1-3 μm), gładkie, jednolite i niezbyt spuchnięte. Maleńki, jednostronny; "Spuchnięte", w pełni przezroczyste płyty CD mają słabe lub żadne uszczelnienia. Płyty CD zawierające duże cząstki rozpuszczalne mogą zatkać pipetę rejestrującą. Gdy nasienniki myszy w jądrach wchodzą do najądrza, ich krążki znajdują się w okolicy szyi, blisko głowy. Podczas przemieszczania się przez najądrze ich płyty CD przesuwają się wzdłuż środkowego elementu i ostatecznie dochodzą do połączenia między środkowym a głównym elementem (pierścieńkiem), gdy plemniki docierają do najądrza ogonia. Dlatego, jak wspomniano wyżej w plemnikach wyizolowanych z korpusu najądrza, CD zwykle znajduje się blisko środka śródka. W komórkach ogonowych CD zwykle znajduje się blisko pierścienia (Rysunek 2C). W przypadku ludzkich plemników CD znajduje się w okolicy szyi (Rysunek 2A,B).
Chociaż nie stanowi to problemu dla plemników izolowanych od zwierząt laboratoryjnych, istnieje znaczna zmienność między ludzkimi dawcami. Różnice jakości plemników u tego samego dawcy głównie wpływają na jakość błony plazmatycznej plemnika i czasami utrudniają tworzenie plomb. Zachowanie i farmakologia kanałów jonowych są mniejsze, co prawdopodobnie koreluje z indywidualną genetyką lub fizjologią. Trzeba być wytrwałym i oceniać próbki z różnych dawstw przez kilka dni, a także polegać na wielu ludzkich dawcach. Praca z materiałem ludzkim wymaga dodatkowej cierpliwości, ponieważ jakość nasienia oddanych u tego samego dawcy znacznie różni się w zależności od różnych czynników środowiskowych. Zalecamy ocenę próbek z różnych dni darowizny, aby podjąć ostateczną decyzję o statusie dawcy. Podczas gdy oczyszczone plemniki z wytryskiem są zazwyczaj odpowiednie do elektrofizjologii w ciągu kilku godzin (do 12 godzin po izolacji dla plemników ludzkich), nasienniki mysich w najądrzu są nadawane do łatania tylko w ciągu 2 godzin po izolacji.
I wreszcie, ale nie mniej ważne, formowanie się gigasealów różni się między komórkami plemnikowymi. W przypadku myszy/gryzoni plemników formowanie gigaseal następuje niemal natychmiast, podczas gdy do utworzenia gigaseal z ludzkiego plemnika potrzeba kilku sekund (a czasem nawet minuty). Często początkowe ssanie powoduje opór wejściowy w zakresie od 200 MΩ do 800 MΩ. Przełączanie potencjału utrzymującego napięcie do -60 mV oraz dostarczanie krótkich impulsów "Membrane Test" do 10 mV często pomaga ratować powstawanie megasealu (poprzez ruch membrany w pipecie wywołany polem napięciowym).
Technika patch clamp z plemnikami umożliwia szczegółowe badanie specyficznych kanałów jonowych w ich naturalnym systemie ekspresji. Sukces tej techniki zależy od odpowiedniego sprzętu, wysokiej jakości żywotnych plemników, czystych odczynników, podstawowych umiejętności elektrofizjologicznych, cierpliwości i wytrwałości. Metoda otwiera nowe granice fizjologii plemników, badając ewolucyjną różnorodność kanałów jonowych, mechanizmy ich regulacji oraz zmiany w ich funkcjonowaniu podczas przemieszczania się z męskiego do żeńskiego traktu rozrodczego i zmienianych przez warunki egzogenne, takie jak pH i ligandy.

Podobnie jak tradycyjny patch clamp wynaleziony przez Erwina Nehera i Berta Sakmanna1, patch clamp plemników umożliwia analizę aktywności poszczególnych kanałów jonowych, a także rejestrowanie aktywności całej populacji kanału jonowego w pojedynczej komórce 2,3. Metoda pozwala na identyfikację konkretnego typu kanału jonowego w stopniach odłączenia od enzymatycznych procesów wewnątrzkomórkowych. Ta metoda jest kluczowa do określenia aktywności kanału jonowego na podstawie jego elektrofizjologicznych i farmakologicznych śladów, a zatem stanowi wiarygodną strategię identyfikacji. Minusem tej metody jest jej niezdolność do wykrywania transporterów nieelektrogennych. Dodatkowo podstawowe szkolenie elektrofizjologiczne pomaga zrozumieć niuanse protokołu. Aby opanować technikę patch clamp i zastosować ją do nasień ssaków, zalecamy zapoznanie się z podstawową literaturą patch clamp 4,5. W tym artykule przedstawiamy szczegółową procedurę krok po kroku i podkreślamy unikalne praktyki, które sprawiają, że technika ta jest łatwa do zrozumienia i dostępna dla każdego, kto chce praktykować elektrofizjologię plemników.
Homeostaza jonowa jest niezbędną funkcją fizjologiczną plemników, która w dużym stopniu polega na kanałach jonowych i transporterach jonów do utrzymania fizjologicznie ważnych gradientów jonów, zmiany wewnątrzkomórkowego wapnia oraz zmiany napięcia transbłonowego. Kanały jonowe i transportery jonów regulują kluczowe funkcje plemników, takie jak ruchliwość, nawigacja w kobiecym traktie rozrodczym, dojrzewanie plemników oraz u organizmów morskich chemotaksja w kierunku komórki jajowej 6,7,8,9,10,11,12 . Ruchliwość plemników to proces stopniowo nabywany. Plemniki są głównie spokojne podczas dojrzewania w jądrze oraz podczas przejścia przez najądrze najądrze. Ich ruchliwość jest ograniczana przez kwaśne środowisko najądrza, które prowadzi do wewnętrznej zakwaszenia plemników. To upośledza funkcjonowanie aksonemu, ponieważ nie jest on w stanie funkcjonować poniżej pH 6,013,14. Jednak po ekspozycji na płyny nasienne lub bardziej zasadowe środowisko stężenia jonów wewnątrzkomórkowych plemników i pH cytoplazmatyczne ulegają znacznym zmianom, przez co plemniki stają się ruchome 15,16,17. Ruch wici plemnika jest napędzany hydrolizą ATP, która umożliwia przesuwanie oksonowych mikrotubul18, a proces ten jest wysoce zależny od pH14. Dodatkowo ruch wiciowych jest również kontrolowany przez podwyższenie wapnia wewnątrzwiczowego i cAMP 13,19,20,21,22,23,24. Te czynniki, takie jak stężenie wapnia wewnątrzkomórkowego plemnika [Ca2+], i, pH, ATP i cAMP, są głównymi mechanizmami regulacyjnymi umożliwiającymi zmiany ruchliwości, a ich stężenia są ściśle regulowane przez kanały jonowe plemników i transportery.
Plemniki są wyjątkowe, ponieważ wyrażają szereg białek, których nie da się znaleźć nigdzie indziej w organizmie. Znaczącymi przykładami są kanały jonowe plemników, takie jak kanał potasowy Slo3 25,26,27,28,29 oraz kanał jonowy Cat Sperm, CatSper 2,30,31,32. Ten ostatni jest głównym kanałem wapniowym plemników ssaków31 i jest regulowany przez alkalizację wewnątrzkomórkową 2,30,31,32,33,34. CatSper jest również regulowany przez specyficzne dla gatunku sygnały 7,35 i jest zorganizowany w czterokątne podłużne nanodomeny wzdłuż wici plemnika 36,37,38. U naczelnych CatSper jest aktywowany przez kombinację zasadowości wici, depolaryzacji błonowej i progesteronu 3,39,40,41, natomiast u myszy aktywacji CatSper progesteron nie jest wymagany 2,39. Kolejną specyficzną cechą tego kanału jest jego organizacja wielojednostkowa: CatSper to kompleks co najmniej 10 różnych podjednostek 31,32,34,37,38,42,43,44,45,46,47. Tak zaawansowana struktura i szczegóły regulacji utrudniały rekombinowaną ekspresję CatSper w każdym znanym heterologicznym systemie ekspresji, dlatego charakterystyka fizjologiczna CatSper została ograniczona do jego rodzimego systemu ekspresji – plemników. Natomiast molekularna charakterystyka białka CatSper została osiągnięta w przełomowym artykule z 2000 roku przez D. Rena i in. al.31, ostateczny dowód, że CatSper jest prawdziwym kanałem jonowym, był możliwy dopiero po wprowadzeniu metody zacisków nasiennych w 2006roku. Od tego czasu technika ta umożliwiła precyzyjną charakterystykę wielu szlaków przewodzących jony w plemnikach 9,28,37,39,40,44,46,48-54.
Klasyczna i najprostsza metoda badania cech kanałów jonowych – technika zacisku patch clamp – uważana była za niestosowalną do plemników ze względu na ich ruchliwość i specyficzną morfologię (Rysunek 1A). Konkretnie, minimalna objętość cytoplazmy plemnika oraz ciasne przyleganie błony plazmatycznej plemnika do sztywnych struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak włóknista osłona i jądro plemników, były głównymi wyzwaniami55. Te dwie cechy strukturalne tworzą smukłą, strzałowatą komórkę, zaprojektowaną tak, by przenikać przez silnie lepkie środowiska, takie jak ochronne szaty jaj, bez znaczących deformacji czy uszkodzenia błony plazmatycznej.
Pierwszym krokiem metody zacisku łatkowego jest ustanowienie szczelnego uszczelnienia między pipetą rejestrującą (szklaną mikropipetą) a błoną plazmatyczną komórki. Aby to osiągnąć, należy wciągnąć wystarczającą ilość błony plazmatycznej do pipety rejestrującej, aby między membraną plazmatyczną a szkłem powstała mechanicznie stabilna gigaseal. Błona plazmatyczna musi być elastyczna i nie sztywna (Rysunek 1B). Jak wspomniano powyżej, cała powierzchnia błony plazmatycznej plemnika jest dość mocno przylegająca, z wyjątkiem obszaru znanego jako kropla cytoplazmatyczna (Rysunek 1A i Rysunek 2). Dlatego sztywność błony plazmatycznej plemnika uważano za główną przeszkodę w uzyskaniu szczelnego uszczelnienia lub "gigaseal", nazwanego tak, ponieważ do dobrych nagrań wymagane jest >109 omów. Jednak wprowadzenie techniki zacisku plemnika w 2006 roku 2006usunęło tę barierę i metoda ta mogła być skutecznie zastosowana na plemnikach kilku gatunków ssaków 2,41,51,56. Przełom ten został osiągnięty poprzez skupienie się na kropli cytoplazmatycznej (CD)2,8, maleńkiej strukturze znajdującej się wzdłuż środkowej części plemnika (Rysunek 1A i Rysunek 2), która jest po prostu pozostałością wydłużonego plemnika – prekursora plemników, z którego rozwijają się głowa i ogon. Funkcjonalnie może pomóc komórce przystosować się do zmian w osmolarności zewnątrzkomórkowej podczas ejakulacji. Ważną cechą jest to, że błona plazmatyczna wewnątrz CD jest na tyle elastyczna do pipety, tworząc uszczelnienie gigaomowe. W ten sposób CD plemnika jest najlepszą częścią powierzchni plemnika, przez którą można osiągnąć pomyślne utworzenie gigasealu i przejść do trybu całego komórki, który ostatecznie elektrycznie łączy plemnik z wzmacniaczem patch-clamp 2,8. Warto zauważyć, że wcześniejsze publikacje odnotowały skuteczną formację gigasealu na główce plemnika, co umożliwia rejestrację w konfiguracji przymocowanej do komórki 54,57,58,59. Jednak nagrania w konfiguracji całej komórki zostały jak dotąd odnotowane jedynie poprzez formowanie się gigasealów w regionie CD. Ten tryb całej komórki umożliwia elektryczny dostęp do całej objętości plemników, a tym samym umożliwia wykrywanie aktywności kanału jonowego znajdującego się na wiciach plemnika, a także na główce plemnika. Od czasu opracowania technika zacisku plemnika przyniosła ogromny postęp w zrozumieniu kanałów jonowych plemników i jest jak dotąd jedną z najbardziej zaawansowanych metod bezpośredniego badania funkcjonalności kanałów jonowych plemników 9,28,37,39,40,44,46,48,49,50,51,52,53 (Rysunek 1).
Patch clamp na plemniki różni się w niektórych szczegółach od klasycznej techniki patch clamp, jak opisano poniżej. Po pierwsze, większość błony plazmatycznej plemnika jest ściśle przymocowana do sztywnej struktury wewnątrzkomórkowej, przez co plemniki praktycznie nie mają "zapasowej" błony plazmatycznej, którą można by wciągnąć do pipety. Jedynym elastycznym obszarem jest błona CD, która przypomina błonę plazmatyczną wielu komórek somatycznych, dzięki czemu łatwo ją wciągają do pipety. Aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe z CD, ujemne ciśnienie powstaje poprzez lekkie ssanie na górze pipety, aby wciągnąć niewielką część błony plazmatycznej plemnika do końcówki mikropipety (Rysunek 1B). Ta część błony tworzy Ω-kształtne wniknięcie w czubek pipety i zapewnia szczelne uszczelnienie ze swoimi wewnętrznymi ścianami.
Po drugie, kropla cytoplazmatyczna w nasiennikach ludzkich i myszy wynosi od 1 do 2 μm (Rysunek 1 i Rysunek 2). Dlatego zastosowanie techniki patch-clamp do tak małego obiektu wymaga wysokiej rozdzielczości optyki. Większość zestawów patch-clamp z plemnikami wyposażona jest w mikroskop odwrócony z różnicowym kontrastem interferencyjnym (DIC) lub komponenty optyczne Nomarskiego (Rysunek 2 i Rysunek 3). Zaleca się stosowanie mikroskopu wyposażonego w optykę DIC do zaciskania plemników na plemnikach zamiast bardziej konwencjonalnej optyki fazowo-kontrastowej, ponieważ informacje przestrzenne widoczne w DIC pomagają osiągnąć wyższą precyzję przy ustawianiu pipety patch na maleńkim CD. Zalecamy także użycie obiektywu zanurzającego w wodzie 60x lub podobnego, z aperturą numeryczną 1,2. Ten obiektyw ma dużą odległość roboczą (0,28 mm), co pozwala na obserwację swobodnie pływających plemników w roztworze (Rysunek 2). Obiektyw posiada także kołnierz regulacyjny do grubości powłoki pokrywowej (zmiennej od 0,13 do 0,21 mm). Połączenie długiego zasięgu roboczego i kołnierza regulacyjnego umożliwia obserwację przez dwa pokrywy 0,13 mm; Jedna pokrywa służy jako szklane dno komory nagrywającej, a na górze umieszcza się 5 mm pokrywkę z osadzonymi plemnikami. Jak omówiono poniżej, składanie plemników na łatwo wymiennych okrągłych pokrywkach o grubości 5 mm, zamiast bezpośrednio na dnie komory rejestracyjnej, jest wygodnym sposobem na załadowanie świeżych plemników do komory rejestrującej.
Po trzecie, zestaw patch clamp na plemniki musi być wyposażony w wzmacniacz patch-clamp o niskim poziomie szumów oraz cyfrowy mechanizm rejestrujący minimalne prądy elektryczne (w zakresie pikoamperów) oraz minimalne zmiany potencjału błonowego. To urządzenie musi zapewnić najniższy poziom szumu wzmacniacza. Brak drgań jest kluczowym elementem udanego nagrania patch clamp. Zaciskanie plemników wymaga precyzyjnego mikromanipulatora wolnego od dryfu, który można przymocować do mikroskopu odwróconego za pomocą platformy mikromanipulatora, aby zapewnić lepszą stabilność niż niezależny podstawek mikromanipulatora (Rysunek 3A). Aby przetestować ustawienie, nie powinno się widzieć żadnego ruchu końcówki pipety (przy 60-krotnym powiększeniu), nawet gdy ktoś skacze po podłodze w pobliżu stołu izolującego drgania.

<table><tbody><tr><td>IX71 z optyczną DIC</td><td>Olympus Inc</td><td>IX71</td><td>Nikon TiU mikroskop również może być użyty </td></tr><tr><td>UplanSApo 60x</td><td>Olympus Inc</td><td></td><td>cel immersji w wodzie</td></tr><tr><td>Stół powietrza tłumiący drgania</td><td>Newport Inc</td><td></td><td>TMC airtables lub podobne tabele mogą być użyte</td></tr><tr><td>Axopatch&trade; Wzmacniacz 200B</td><td>Axon&trade; &nbsp; /Urządzenia molekularne</td><td></td><td>Sutter IPA&reg;/Double IPA&reg; Zintegrowany system patch clamp to również doskonały wzmacniacz </td></tr><tr><td>Konwerter analogowo-cyfrowy Axon Digidata</td><td>Axon&trade; &nbsp; /Urządzenia molekularne</td><td>1440 lub 1550</td><td> można też używać</td></tr><tr><td>Osmometr pary</td><td>Wescor</td><td>Model 5600</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator MPC 385</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>MPC 385</td><td> Seria mikromanipulatorów Eppendorf TransferMan może być również używana</td></tr><tr><td>Mikropipeta wyciągacz</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>P1000</td><td>P97 można użyć</td></tr><tr><td>MicroForge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td> powinien być wyposażony w obiektyw Nikon MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 obiektyw</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Domowe</td><td></td><td>aby osłonić setup przed zakłóceniami elektrycznymi </td></tr><tr><td>&nbsp; Szkło 5 mm Cover Slips</td><td>WPI</td><td>&nbsp;#502040</td><td></td></tr><tr><td>Komora perfuzyjne</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>&nbsp; RC-24E</td><td></td></tr><tr><td>Kapilarnia ze szkła borosilikatowego</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>BF 150-85-7.5</td><td>średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm oraz wewnętrzny filament</td></tr><tr><td>Rozmaitość teflonowa MP-8</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>64-0211</td><td>Teflonowy 8-pozycyjny rozmaitość perfuzyjna</td></tr><tr><td>Płytka Nunc 4-well</td><td>Nunc</td><td>#179820</td><td></td></tr><tr><td>1 X bufor HTF</td><td>EmbryoMax</td><td>MR-070-D</td><td>rozwiązanie pojemnościowe</td></tr><tr><td>Adapter SA-Oly/2 stopni</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>Dla peronów serii 20</td><td>tylko do mikroskopu Olympus</td></tr><tr><td>Magnetyczna platforma podgrzewana</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>PM-1 lub podobna seria</td><td> do przechowywania komory RC-24E</td></tr><tr><td>Magnetyczna zacisk MAG-1</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>#64-0358</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt mikroelektrody z pelletem 2mm Ag/AgCl</td><td>WPI</td><td>MEH3F4515</td><td></td></tr><tr><td>Zaworek z połączeniami Luera; 4-kierunkowy; Zamek męski</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-30600&ndash; 09</td><td></td></tr><tr><td>Adapter do żołdów żołdowych samicy, 1/16"</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-45508 00</td><td></td></tr><tr><td>Rurka perfuzyjna z politetrafluoroetylenu (PTFE)</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-06417 &ndash; 21</td><td> (Rurka PTFE mikrocylindrowa, 0,022" ID i czasy; 0,042" OD)</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa (silikonowa rurka utwardzona platyną, 1/32" ID i czasy; 3/32" OD)</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-95802 i dodatek; 01</td><td></td></tr><tr><td>Rurka złącza kolektora (rurka PTFE, 1/32" ID i czasy; 1/16" OD)</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-06407 i dash; 41</td><td></td></tr><tr><td>Męski adapter do kolczyków serii Luer, 1/16"</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>45518 &ndash; 00</td><td></td></tr><tr><td>Męski adapter zamka Luer 1/8"</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>45-503-04</td><td></td></tr><tr><td>Rurka złączowa silikonowa</td><td>Dow Silicone Corporation; &nbsp; MI</td><td>#508-008</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>Fisher Scientific lub VWR</td><td>Air-Tite, Norm-Ject Luer</td><td>1 mL, 3 mL i 20 mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60216</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 x 7.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 x 2.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21097</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523-250G</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Mleczan sodu (60% w/w)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7900</td><td></td></tr><tr><td>Pirorotroczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BCBG2421V</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td>Cezowy metanonisulfonat </td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BCBF5871V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Jakość biologiczna</td><td>315-006-721</td><td>1 M rozwiązanie podobnego</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Embryomax Human Tubal Fluid Medium:</td><td>Millipore</td><td>MR-070-D</td><td>ośrodek kapacitacyjny dla myszich plemników</td></tr><tr><td>(Embryomax-HTF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Zwierzęta</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Samce szczurów Wistar</td><td>Wistar</td><td>Harlan Laboratories (Livermore, CA)</td><td>dorosłych szczurów</td></tr><tr><td>Męskie myszy C57BL/6</td><td>Myszy C57BL/6</td><td>Harlan Laboratories (Livermore, CA)</td><td>< > 3-6 miesięcy </td></tr></tbody></table>

rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Recording Electrical Currents across the Plasma Membrane of Mammalian Sperm Cells

Rejestracja aktywności elektrycznej jednej z najmniejszych komórek organizmu ssaka – plemnika – od wielu dekad jest trudnym zadaniem dla elektrofizjologów. Metoda znana jako "patch clamp spermatozoan" została wprowadzona w 2006 roku. Umożliwił bezpośrednie rejestrowanie aktywności kanałów jonowych w konfiguracjach całokomórkowych i połączonych z komórkami oraz odegrał kluczową rolę w opisie fizjologii plemników oraz molekularnej tożsamości różnych kanałów jonowych wapnia, potasu, sodu, chlorków i protonów. Jednak rejestracja pojedynczych plemników wymaga zaawansowanych umiejętności i szkolenia z zakresu elektrofizjologii. Ten szczegółowy protokół podsumowuje krok po kroku procedurę i podkreśla kilka "sztuczek", aby udostępnić go każdemu, kto chce poznać fascynującą fizjologię plemników. Konkretnie, protokół opisuje rejestrację z ludzkich i myszych plemników, ale może być dostosowany praktycznie do każdej komórki plemnika ssaków dowolnego gatunku. Protokół obejmuje ważne szczegóły dotyczące zastosowania tej techniki, takie jak izolacja plemników, wybór odczynników i sprzętu, unieruchomienie wysoce ruchomych komórek, utworzenie szczelnego (Gigaohmowego) uszczelnienia między elektrodą rejestrującą a błoną plazmatyczną plemników, przejście do trybu pełnego plemnika (znanego również jako przebicie) oraz przykładowe zapisy kanału jonowego wapnia plemników, CatSper, pochodzący z sześciu gatunków ssaków. Omawiane są zalety i ograniczenia metody zaciskania plemników oraz najważniejsze kroki.

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać rejestracje elektryczne z komórek plemników ssaków w konfiguracji całej komórki, z celem bezpośredniego rejestrowania aktywności kanałów jonowych. Metoda ta odegrała kluczową rolę w opisie elektrofizjologicznych profili kilku kanałów jonowych plemników i pomogła ujawnić ich tożsamość molekularną oraz regulację.

Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Recording of the electrical activity from one of the smallest cells of a mammalian organism- a sperm cell- has been a challenging task for ...

Rejestrowanie aktywności elektrycznej plemników za pomocą techniki patch-clamp było kluczowe w identyfikacji różnych kanałów jonowych plemników oraz zrozumieniu elektrofizjologii plemników na poziomie molekularnym. Metoda ta doskonale sprawdza się w pomiarze elektrofizjologicznych i farmakologicznych śladów kanałów jonowych i jest najbardziej wiarygodnym narzędziem do identyfikacji kanałów jonowych. Biorąc pod uwagę fizjologiczne znaczenie kanałów jonowych i elektrogenicznych transporterów dla płodności mężczyzn, ta technika jest potężnym narzędziem do zrozumienia niektórych wad plemników prowadzących do niepłodności.Do produkcji mikropipet zacznij od naczyń włosowatych szkła borokrzemowego o średnicy zewnętrznej 1,5 milimetra, średnicy wewnętrznej 0,86 milimetra oraz wewnętrznej włókni. Upewnij się, że wewnętrzna średnica końcówki pipety wynosi około dwóch mikrometrów przed polerowaniem ogniowym i jest zmniejszona do 0,5 mikrometra po odpowiednim polerowaniu. Złóż mostek agarowy, aby utrzymać stabilność środowiska wokół elektrody referencyjnej.Zrób szklaną kapilarę w kształcie litery L, wyginając ją pod małym ogniem palnika Bunsena i pozwól ostygnąć. Zrób roztwór o stężeniu 1% agarozy w jednym molowym chlorku potasu i podgrzej go w mikrofalówce, aż agaroza się stopi i roztwór stanie się przezroczysty. Ostrożnie wypełnij szklaną kapilarę w kształcie litery L agarozą, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej.Alternatywnie, zanurz szklaną kapilarę w kształcie litery L w stopionej agarozie. Mieszaj pojemnik kilka razy i podgrzej ponownie w mikrofalówce, aż agaroza zawrze, co wypchnie pęcherzyki powietrza z mostu agaru. Otworzyć dolną część brzucha myszy nożyczkami i usunąć oba najądrza.Umieść je w naczyniu do hodowli komórek o średnicy 35 milimetrów, wypełnionym roztworem wysoko zasolonym lub HS, który został podgrzany do temperatury pokojowej. Przełóż najjedrza do nowej misy hodowli komórkowej zawierającej roztwór HS i dokładnie usuń cały pozostały tłuszcz. Rozdziel najądrze na caput, corpus i cauda za pomocą ostrza skalpela numer 15.Przenieś ciało każdego najądrza do nowej misy hodowli komórkowej zawierającej roztwór HS. Wykonaj wiele nacięć w odizolowanej części najądrza za pomocą ostrza skalpela z numerem 11. Przenieś części najądrza z wieloma nacięciami do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 1,5 mililitra roztworu HS.Krótko wstrząśnij plemnikami z najądrza do roztworu za pomocą kleszczy Superfine Dumont Type 5A. Następnie wyrzuć najądrze i pozostawić tubkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Poczekaj, aż materia stała osadzi się na dnie rurki.Następnie przelej supernatant do kolejnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Znajdź odpowiednią komórkę plemnika za pomocą kropli cytoplazmatycznej z użyciem powiększenia 600x. Upewnij się, że kropla cytoplazmatyczna jest owalna i ma lekko wydłużony, wrzecionowy kształt.Wybierz plemnik, który jest ruchomy, z głową przymocowaną do pokrywy tak, aby plemnik był częściowo unieruchomiony, ale kropla cytoplazmatyczna i reszta wici nadal się poruszały pod wpływem wici. Upewnij się, że główka plemnika jest luźno przymocowana do pokrywy ochronnej. Po wizualnym wybraniu plemnika o odpowiedniej morfologii, napełnij mikropipetę roztworem pipety i zabezpiecz ją w uchwytie na pipetę.Aby utrzymać końcówkę pipety czystą od zanieczyszczeń, należy wywierać dodatnie ciśnienie na pipetę za pomocą zespołu w kształcie litery U. Opuść pipetę i zanurz jej końcówkę w roztworze kąpielowym. Aby wyraźnie zobrazować komórkę, ustaw końcówkę pipety nad kroplą cytoplazmatyczną tak, aby otwór końcówki był ustawiony ukośnie w kierunku kropelki.Szybko opuść końcówkę pipety w kierunku kropli tak, aby były w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Gdy tylko końcówka pipety dotknie kropelki, należy zastosować ujemne ciśnienie na pipecie, aby przenieść część kropli do końcówki i utworzyć uszczelnienie giga-omowe. Następnie podnieś plemniki z pokrywy.Kompensuj przejściowość pojemności nieobecnej za pomocą trybu kompensacyjnego wzmacniacza przed przejściem do trybu całego ogniwa. Wykonaj przejście i przejście w tryb całego ogniwa, stosując jedną milisekundę, stopniowo zwiększając impulsy napięcia w połączeniu z bardzo lekkim ssaniem. Po zastosowaniu każdego impulsu napięcia przebicia uruchom narzędzie do testu membranowego, aby sprawdzić, czy pojawia się przejściowa pojemność o większej mocy.Dopasuj przejściowość o większej pojemności, aby określić pojemność całej komórki oraz jej rezystancję dostępu. Po udanym włamaniu należy przystąpić do planowanych eksperymentów z patch-clampem całej komórki, takich jak stosowanie różnych roztworów kąpielowych zawierających różne związki lub pomiar aktywności kanału za pomocą protokołów krokowych lub ramp napięciowych. Rejestracje CatSper przeprowadzono poprzez ustanowienie wysokiej odporności na uszczelnienie między pipetą plastrową a plemnikami ssaków na jej kropli cytoplazmatycznej.Gęstość prądów całkowitych komórek CatSper z komórek ogonowych typu dzikich oraz plemników neuronów ogonowych z niedoborem CatSper. Plemniki różnych gatunków są zróżnicowane pod względem morfologii i wewnętrznych szlaków regulacyjnych. Nasienie naczelnych i ludzkich wykazywały podobne właściwości i regulację kanału CatSper.Co ciekawe, aktywacja progesteronu CatSper wydaje się być unikalna dla plemników naczelnych. Plemniki dzików, byków i gryzoni nie wykazywały żadnych zmian prądów CatSper wywołanych progesteronem. U nasienników byków i dzików nawet aktywność kanałów CatSper w bazie była poniżej wykrywalnych granic, co sugeruje, że napływ wapnia i wynikająca z tego hiperaktywacja są napędzane przez inne kanały lub transportery lub że do aktywacji kanałów CatSper potrzebny jest inny naturalny stymulator.Małe, gładkie, jednolite i niezbyt spuchnięte kropelki cytoplazmatyczne najlepiej nadają się do patch-clampu. Powinieneś unikać używania tych maleńkich, jednostronnych, spuchniętych i całkowicie przezroczystych kropelek cytoplazmatycznych, ponieważ spowodują one słabe lub żadne uszczelnienie. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie konkretnych kanałów powietrznych w ich naturalnym układzie ekspresyjnym, a sukces zależy od wysokiej jakości zmiennych plemników, czystych obszarów, podstawowych umiejętności fizjologii intelektualnej, cierpliwości i co najważniejsze – wytrwałości.

recording-electrical-currents-across-plasma-membrane-mammalian-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Prezentujemy protokół, który łączy izolację komórek i zapis z użyciem całego patch-clampu komórkowego w celu zmierzenia właściwości elektrycznych pierwotnych zdysocjowanych komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura. Protokół ten pozwala na badanie właściwości funkcjonalnych pierwotnych komórek nabłonka najądrza w celu dalszego wyjaśnienia fizjologicznej roli najądrza.

Nagrania całokomórkowe patch-clamp izolowanych pierwotnych komórek nabłonka z najądrza

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Opisujemy zastosowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do monitorowania zmian w czasie rzeczywistym w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji nasienia myszy.

Używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy

Opisany tutaj model myszy AcroSensE i metody obrazowania żywych komórek dostarczają nowego podejścia do badania dynamiki wapnia w subkomórkowym przedziale akrosomu plemnika i jak regulują one etapy pośrednie prowadzące do fuzji błony i egzocytozy akrosomów.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy

Zewnętrzne pole elektryczne indukuje napięcie na błonie komórkowej, określane jako indukowane napięcie błonowe (ΔΦ). Dzięki zastosowaniu barwnika potencjometrycznego di-8-ANEPPS możliwe jest nieinwazyjny pomiar ΔΦ. Niniejsze wideo przedstawia protokół pomiaru ΔΦ przy użyciu di-8-ANEPPS.

Pomiar indukowanego napięcia błonowego z użyciem Di-8-ANEPPS

Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Poznaj technikę patch-clamp do rejestrowania prądów jonowych w plemnikach ssaków. Metoda umożliwia badanie kanałów CatSper i ich roli w płodności męskiej.

Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Przeglądaj więcej filmów