Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Rejestrowanie aktywności elektrycznej plemników za pomocą techniki patch-clamp było kluczowe w identyfikacji różnych kanałów jonowych plemników oraz zrozumieniu elektrofizjologii plemników na poziomie molekularnym. Metoda ta doskonale sprawdza się w pomiarze elektrofizjologicznych i farmakologicznych śladów kanałów jonowych i jest najbardziej wiarygodnym narzędziem do identyfikacji kanałów jonowych. Biorąc pod uwagę fizjologiczne znaczenie kanałów jonowych i elektrogenicznych transporterów dla płodności mężczyzn, ta technika jest potężnym narzędziem do zrozumienia niektórych wad plemników prowadzących do niepłodności.

Do produkcji mikropipet zacznij od naczyń włosowatych szkła borokrzemowego o średnicy zewnętrznej 1,5 milimetra, średnicy wewnętrznej 0,86 milimetra oraz wewnętrznej włókni. Upewnij się, że wewnętrzna średnica końcówki pipety wynosi około dwóch mikrometrów przed polerowaniem ogniowym i jest zmniejszona do 0,5 mikrometra po odpowiednim polerowaniu. Złóż mostek agarowy, aby utrzymać stabilność środowiska wokół elektrody referencyjnej.

Zrób szklaną kapilarę w kształcie litery L, wyginając ją pod małym ogniem palnika Bunsena i pozwól ostygnąć. Zrób roztwór o stężeniu 1% agarozy w jednym molowym chlorku potasu i podgrzej go w mikrofalówce, aż agaroza się stopi i roztwór stanie się przezroczysty. Ostrożnie wypełnij szklaną kapilarę w kształcie litery L agarozą, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej.

Alternatywnie, zanurz szklaną kapilarę w kształcie litery L w stopionej agarozie. Mieszaj pojemnik kilka razy i podgrzej ponownie w mikrofalówce, aż agaroza zawrze, co wypchnie pęcherzyki powietrza z mostu agaru. Otworzyć dolną część brzucha myszy nożyczkami i usunąć oba najądrza.

Umieść je w naczyniu do hodowli komórek o średnicy 35 milimetrów, wypełnionym roztworem wysoko zasolonym lub HS, który został podgrzany do temperatury pokojowej. Przełóż najjedrza do nowej misy hodowli komórkowej zawierającej roztwór HS i dokładnie usuń cały pozostały tłuszcz. Rozdziel najądrze na caput, corpus i cauda za pomocą ostrza skalpela numer 15.

Przenieś ciało każdego najądrza do nowej misy hodowli komórkowej zawierającej roztwór HS. Wykonaj wiele nacięć w odizolowanej części najądrza za pomocą ostrza skalpela z numerem 11. Przenieś części najądrza z wieloma nacięciami do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 1,5 mililitra roztworu HS.

Krótko wstrząśnij plemnikami z najądrza do roztworu za pomocą kleszczy Superfine Dumont Type 5A. Następnie wyrzuć najądrze i pozostawić tubkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Poczekaj, aż materia stała osadzi się na dnie rurki.

Następnie przelej supernatant do kolejnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Znajdź odpowiednią komórkę plemnika za pomocą kropli cytoplazmatycznej z użyciem powiększenia 600x. Upewnij się, że kropla cytoplazmatyczna jest owalna i ma lekko wydłużony, wrzecionowy kształt.

Wybierz plemnik, który jest ruchomy, z głową przymocowaną do pokrywy tak, aby plemnik był częściowo unieruchomiony, ale kropla cytoplazmatyczna i reszta wici nadal się poruszały pod wpływem wici. Upewnij się, że główka plemnika jest luźno przymocowana do pokrywy ochronnej. Po wizualnym wybraniu plemnika o odpowiedniej morfologii, napełnij mikropipetę roztworem pipety i zabezpiecz ją w uchwytie na pipetę.

Aby utrzymać końcówkę pipety czystą od zanieczyszczeń, należy wywierać dodatnie ciśnienie na pipetę za pomocą zespołu w kształcie litery U. Opuść pipetę i zanurz jej końcówkę w roztworze kąpielowym. Aby wyraźnie zobrazować komórkę, ustaw końcówkę pipety nad kroplą cytoplazmatyczną tak, aby otwór końcówki był ustawiony ukośnie w kierunku kropelki.

Szybko opuść końcówkę pipety w kierunku kropli tak, aby były w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Gdy tylko końcówka pipety dotknie kropelki, należy zastosować ujemne ciśnienie na pipecie, aby przenieść część kropli do końcówki i utworzyć uszczelnienie giga-omowe. Następnie podnieś plemniki z pokrywy.

Kompensuj przejściowość pojemności nieobecnej za pomocą trybu kompensacyjnego wzmacniacza przed przejściem do trybu całego ogniwa. Wykonaj przejście i przejście w tryb całego ogniwa, stosując jedną milisekundę, stopniowo zwiększając impulsy napięcia w połączeniu z bardzo lekkim ssaniem. Po zastosowaniu każdego impulsu napięcia przebicia uruchom narzędzie do testu membranowego, aby sprawdzić, czy pojawia się przejściowa pojemność o większej mocy.

Dopasuj przejściowość o większej pojemności, aby określić pojemność całej komórki oraz jej rezystancję dostępu. Po udanym włamaniu należy przystąpić do planowanych eksperymentów z patch-clampem całej komórki, takich jak stosowanie różnych roztworów kąpielowych zawierających różne związki lub pomiar aktywności kanału za pomocą protokołów krokowych lub ramp napięciowych. Rejestracje CatSper przeprowadzono poprzez ustanowienie wysokiej odporności na uszczelnienie między pipetą plastrową a plemnikami ssaków na jej kropli cytoplazmatycznej.

Gęstość prądów całkowitych komórek CatSper z komórek ogonowych typu dzikich oraz plemników neuronów ogonowych z niedoborem CatSper. Plemniki różnych gatunków są zróżnicowane pod względem morfologii i wewnętrznych szlaków regulacyjnych. Nasienie naczelnych i ludzkich wykazywały podobne właściwości i regulację kanału CatSper.

Co ciekawe, aktywacja progesteronu CatSper wydaje się być unikalna dla plemników naczelnych. Plemniki dzików, byków i gryzoni nie wykazywały żadnych zmian prądów CatSper wywołanych progesteronem. U nasienników byków i dzików nawet aktywność kanałów CatSper w bazie była poniżej wykrywalnych granic, co sugeruje, że napływ wapnia i wynikająca z tego hiperaktywacja są napędzane przez inne kanały lub transportery lub że do aktywacji kanałów CatSper potrzebny jest inny naturalny stymulator.

Małe, gładkie, jednolite i niezbyt spuchnięte kropelki cytoplazmatyczne najlepiej nadają się do patch-clampu. Powinieneś unikać używania tych maleńkich, jednostronnych, spuchniętych i całkowicie przezroczystych kropelek cytoplazmatycznych, ponieważ spowodują one słabe lub żadne uszczelnienie. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie konkretnych kanałów powietrznych w ich naturalnym układzie ekspresyjnym, a sukces zależy od wysokiej jakości zmiennych plemników, czystych obszarów, podstawowych umiejętności fizjologii intelektualnej, cierpliwości i co najważniejsze – wytrwałości.