Barwienie immunofluorescencyjne w całości mount, obrazowanie konfokalne i rekonstrukcja 3D węzła zatokowo-przedsionkowego i przedsionkowo-komorowego u myszy
22 grudnia 2020
Udostępniamy krok po kroku protokół barwienia immunofluorescencyjnego całego węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) i węzła przedsionkowo-komorowego (AVN) u mysich serc.
Protokół ten wyjaśnia niezbędne kroki do przeprowadzenia mikropreparacji, barwienia immunofluorescencyjnego i mikroskopii w całości, specjalnie dla węzła zatokowego i węzła przedsionkowo-komorowego u myszy. Metodologia całościowego montażu jest korzystna dla dokładnej lokalizacji i morfologii 3D zatoki i węzła przedsionkowo-komorowego oraz do zbadania relacji z otaczającą tkanką. Morfologia tkanki jest znacznie zachowana przy minimalnym odwodnieniu tkanek i fizycznym pęknięciu.
Na początek nakłuj serce igłą o rozmiarze 27 w obszarze wierzchołka, ostrożnie wpychając igłę do lewej komory i delikatnie wstrzykując od pięciu do 10 mililitrów lodowatego PBS, aby obficie napełnić serce. Ostrożnie podnieś serce za pomocą pęsety i przetnij duże naczynia, aby usunąć serce. Umieść serce w naczyniu separacyjnym wypełnionym lodowatym PBS pod mikroskopem preparacyjnym
.Po określeniu orientacji serca obróć serce tak, aby przód serca znalazł się na dnie naczynia. Unieruchomij serce, wkładając małe szpilki przez wierzchołek i wyrostek przedsionka do agarozy na dnie naczynia rozekcyjnego. Za pomocą cienkiej pęsety i nożyczek ostrożnie usuń tkankę niesercową wokół żyły głównej górnej i dolnej.
Aby odsłonić obszar międzyprzewodny, usuń większość komór, przecinając mikronożyczkami równolegle do rowka między komorami a przedsionkami. W celu utrwalenia i odwodnienia umieść próbkę w 4% paraformaldehydzie na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś serce do 15% roztworu sacharozy i inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji przenieś serce do 30% roztworu sacharozy na kolejne 24 godziny w czterech stopniach Celsjusza. Umyj serce w 1%Triton X-100 rozcieńczonym w PBS. Następnie zablokuj i przepuśćć go w roztworze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Umieść serce w 1,5 mililitrowej probówce i inkubuj je z króliczymi przeciwciałami anty-mysim Connexin 43 i szczurzymi przeciwciałami anty-mysimi HTN4 rozcieńczonymi roztworem blokującym przez siedem dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po siedmiu dniach usunąć roztwór zawierający przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą pipety. Umyj serce 1%Triton X-100 roztworem trzy razy przez godzinę na jedno płukanie na wytrząsarce orbitalnej.
Powtórz etapy mycia po inkubacji z przeciwciałami drugorzędowymi i DAPI. Po przygotowaniu plastikowych krążków i wypełnieniu ich plasteliną, umieść serce w rowku plasteliny tyłem serca do góry. Zidentyfikuj SAN, który znajduje się po grzbietowej stronie serca z obszarem międzyprzewodnym.
Dodaj PBS do serca, aby wyprzeć całe powietrze w jamie, aż serce zostanie całkowicie pokryte PBS. Nałóż silikon na krawędzie plastikowego pierścienia. Delikatnie wciśnij otaczającą część próbki w plastelinę, aby zamocować serce i przykryj serce szkiełkiem nakrywkowym.
Następnie delikatnie dociśnij tylną stronę plasteliny, aby wycisnąć część PBS i przymocuj serce do szkiełka nakrywkowego, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w obszarze obrazowania. Umieścić próbki barwiące w całości do góry nogami na platformie mikroskopu konfokalnego i kontynuować obrazowanie zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Parametry dla każdego kanału mikroskopu konfokalnego są ustawiane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
Protokół ten został wykorzystany do wykonania obrazowania mikroskopowego w mikroskopii konfokalnej zarówno węzła zatokowo-przedsionkowego, jak i węzła przedsionkowo-komorowego w sercach mysich. Specyficzne barwienie układu przewodzącego i pracującego mięśnia sercowego przeciwciałami fluorescencyjnymi, skierowanymi odpowiednio przeciwko HCN4 i Connexin 43, umożliwia identyfikację węzła zatokowo-przedsionkowego i węzła przedsionkowo-komorowego w nienaruszonej anatomii. Ten protokół barwienia całego montażu umożliwia badanie interakcji różnych typów komórek przy użyciu różnych przeciwciał.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje etapy barwienia immunofluorescencyjnego całego preparatu (whole-mount) węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) oraz węzła przedsionkowo-komorowego (AVN) w sercach myszy. Zastosowana metodologia umożliwia precyzyjną lokalizację 3D oraz badanie morfologii tych struktur serca.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia układu sercowo-naczyniowego
- Techniki immunofluorescencji
Wstęp
- Węzeł zatokowo-przedsionkowy (SAN) oraz węzeł przedsionkowo-komorowy (AVN) mają kluczowe znaczenie dla funkcji serca.
- Immunofluorescencja całych preparatów pozwala na poznanie morfologii tych węzłów.
- Technika ta zachowuje morfologię tkanek przy minimalnym odwodnieniu.
- Zrozumienie relacji między tymi węzłami a otaczającymi je tkankami jest niezbędne dla badań nad sercem.
Cel badania
- Aby przedstawić szczegółowy protokół barwienia SAN i AVN w sercach myszy.
- Aby ułatwić badanie trójwymiarowej lokalizacji węzłów serca.
- Aby pogłębić zrozumienie oddziaływań w tkance serca.
Zastosowane metody
- Mikrosekcja serc mysich.
- Immunofluorescencyjne barwienie całych preparatów.
- Mikroskopia do wizualizacji zabarwionych tkanek.
- Użycie lodowatego PBS do konserwacji tkanek.
Główne wyniki
- Pomyślne barwienie SAN i AVN w sercach myszy.
- Zaobserwowano zachowanie morfologii tkanki.
- Osiągnięto wyraźną wizualizację lokalizacji 3D.
- Pogłębione zrozumienie relacji węzłów serca z otaczającymi tkankami.
Wnioski
- Protokół jest skuteczny w badaniu SAN i AVN u myszy.
- Immunofluorescencja całego preparatu (whole-mount) jest cenną techniką w badaniach nad sercem.
- Dalsze badania mogą opierać się na tej metodologii w celu uzyskania głębszych spostrzeżeń.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja 3D o wysokiej rozdzielczości węzła zatokowo-przyprzemiennego i węzła przedsionkowo-komorowego w modelach mysich wypełnia krytyczną lukę w badaniach nad elektrofizjologią serca, umożliwiając precyzyjne mapowanie anatomiczne i komórkowe. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w początkowej fazie walidacji celów dla mechanizmów arytmii i wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkryć do przedklinicznych badań kardiologicznych. Zachowanie integralności tkanki oraz umożliwienie multipleksowej analizy typów komórek sprawia, że ten schemat postępowania stanowi wielokrotnie wykorzystywalny zasób dla portfeli badawczo-rozwojowych w obszarze układu sercowo-naczyniowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szczegółową analizę populacji komórek rozrusznika i układu przewodzenia in situ.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie zależności między strukturą a funkcją węzłów.
- Ułatwia pewną identyfikację celów istotnych dla patogenezy arytmii.
- Zapewnia kontekst anatomiczny dla badań funkcjonalnych i weryfikacji hipotez.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje nienaruszone, zwalidowane systemy tkanki serca do dalszych procesów obrazowania i analizy.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki immunofluorescencji dla markerów węzłów i mięśnia sercowego.
- Umożliwia multipleksowe znakowanie przeciwciałami w celu oceny wielu typów komórek w tej samej próbce.
- Wspiera standaryzację i skalowalność testów dla badań porównawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje trójwymiarowe dane anatomiczne z istotnymi dla choroby modelami przedklinicznymi zaburzeń przewodzenia w sercu.
- Zapewnia ciągłość od odkryć na poziomie molekularnym po walidację na poziomie tkankowym.
- Umożliwia dostosowanie ryzyka przy wyborze potencjalnych celów terapeutycznych w oparciu o dowody strukturalne i komórkowe.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów poprzez mapowanie interakcji komórek węzłowych oraz nie-miocytów.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Ten schemat immunofluorescencji całego preparatu i obrazowania konfokalnego łączy wczesną fazę odkryć, walidację celów oraz przedkliniczne badania serca, dostarczając wysokotreściowych, ilościowych danych anatomicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w badaniach nad przewodzeniem serca.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty immunofluorescencyjne w celu identyfikacji węzłów.
- Analityka: Umożliwia rekonstrukcję 3D oraz analizę porównawczą regionów węzłowych i mięśnia sercowego.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość anatomiczną i komórkową dla przedklinicznych modeli arytmii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zestandaryzowaną platformę obrazowania i analizy dla zespołów badawczo-rozwojowych w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechaniczną w walidacji celów kardiologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie tkanek i obrazowanie w celu uzyskania powtarzalnych i skalowalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w programach odkrywania leków kardiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli układu przewodzącego z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w preparowaniu serca, immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej.
- Wymagany jest dostęp do zaawansowanych platform obrazowania i oprogramowania do analizy obrazu.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów postępowania z tkankami i stosowania przeciwciał w ramach zespołów.
- Możliżna może być konieczność dostosowania metody do różnych modeli serca lub gatunków.
- Wielkość próbek oraz penetracja przeciwciał mogą ograniczać wydajność w badaniach na szeroką skalę.
