Name: Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Poznaj metodę hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ do wizualizacji SARS-CoV-2 w liniach komórkowych i trójwymiarowych kulturach nabłonka dróg oddechowych. Technika umożliwia wykrywanie RNA wirusa z rozdzielczością pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego na badania nad SARS-CoV-2 oraz przez granty z Narodowego Centrum Nauki (granty UMO2017/27/B/NZ6/02488 dla K.P. i UMO-2018/30/E/NZ1/00874 dla A.K.-P.).

1. Przygotowanie bufora
<ol>
	<li>Na 500 ml buforu 2x PHEM połącz 18,14 g piperazyno-N,N′-bis(kwasu 2-etanosulfonowego) (PIPES), 6,5 g kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-etanasulfonowego (HEPES), 3,8 g kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA) i 0,99 g siarczanu magnezu (MgSO4). Uzupełnić objętość do ~400 ml wodą destylowaną (dH2O), wymieszać i dostosować pH do 7,0 za pomocą 10 M wodorotlenku potasu (KOH) lub wodorotlenku sodu (NaOH). Uzupełnij końcową objętość do 500 ml, a następnie podziel na porcje po 50 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie to wymagane. 
	UWAGA: Bufor nie będzie przezroczysty, dopóki pH nie osiągnie 7,0.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 37% w/v paraformaldehydu (PFA). Na 50 ml wymieszaj 18,5 g PFA i 35 mldH2Ow szklanej butelce. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym z podgrzewaniem. Dodać 900 μl 1 M KOH lub NaOH i mieszać, aż roztwór stanie się klarowny. Pozostawić do ostygnięcia i przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml; uzupełnić do 50 ml dH2O. Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebny. 
	UWAGA: Z formaldehydem należy obchodzić się pod wyciągiem, nosząc rękawice ochronne i fartuch laboratoryjny.</li>
	<li>Przygotować bufor utrwalający (3,7% PFA buforowany PHEM). W przypadku 50 ml połącz 5 ml 37% roztworu PFA, 25 ml 2x buforu PHEM i 20 ml dH2O w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie to wymagane. 
	UWAGA: Po rozmrożeniu bufor można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować PBST (0,1% Tween-20 w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS]). Na 50 ml dodaj 50 μl 100% Tween-20 do 50 ml 1x PBS i dobrze wymieszaj. 
	UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przygotować do rehydratacji, łącząc MeOH/PBST w proporcjach 3:1, 1:1 i 1:3 (końcowa objętość 100 ml każdego z nich; patrz Tabela 1). 
	UWAGA: MeOH jest bardzo toksyczny i łatwopalny. Ponieważ może uszkodzić nerw wzrokowy, należy obchodzić się z nim pod wyciągiem, unikając otwartego ognia. Ponieważ mieszanie MeOH i PBST powoduje reakcję egzotermiczną, połącz roztwory na lodzie.</li>
	<li>Na 1000 ml 20x SSC połącz 175,3 g chlorku sodu (NaCl) i 88,2 g cytrynianu sodu w zlewce i uzupełnij 800 ml dH2O. Mieszaj aż do rozpuszczenia i dostosuj pH do 7,2 za pomocą NaOH. Dodać dH2O do całkowitej objętości 1000 ml i autoklawować lub przefiltrować przez filtr 0,22 μm do autoklawowanej butelki.</li>
	<li>Aby uzyskać 50 ml 5x SSCT, połącz 12,5 ml buforu 20x SSC z 37,5 ml dH2O i dodaj 50 μl 100% Tween-20. Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>W przypadku 50 ml 50% 5x SSCT/50% PBST, połącz 25 ml 5x SSCT z 25 ml PBST.</li>
	<li>Na 50 ml 2x SSC połącz 5 ml buforu 10x SSC z 45 ml dH2O. Dobrze wymieszaj. 
	UWAGA: Wszystkie SSC powinny być przechowywane w RT w ciemności.</li>
</ol>
2. Definicja celu, sondy i wzmacniacze
<ol>
	<li>Skorzystaj z narzędzi dostępnych na stronie producenta do projektowania wzmacniaczy i sond. Upewnij się, że sondy są komplementarne w stosunku do odwrotnej nici DNA genu N SARS-CoV-2 (rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Określ najlepszy rozmiar zestawu sond (zestaw 20 sond jest wystarczający do wizualizacji).</li>
	<li>Ustaw wzmacniacze używane do wykrywania docelowego RNA.
	<ol>
		<li>Użyj HCR amplifier B1 oznaczony Alexa Fluor 647. 
		UWAGA: Wzmacniacz HCR składa się z metastabilnych spinek do włosów HCR h1 i h2. Przy użyciu tego protokołu można projektować eksperymenty multipleksowe. Jeśli jest to planowane, należy wybrać inny wzmacniacz HCR (B1, B2, ...) dla każdego docelowego RNA, który ma być obrazowany w tej samej próbce (np. wzmacniacz B1 dla celu 1, wzmacniacz B2 dla celu 2, ...).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa i zakażenie SARS-CoV-2
<ol>
	<li>Hodowla komórek Vero (komórki nabłonka nerki małpy) w zmodyfikowanej pożywce Eagle firmy Dulbecco zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej.
	<ol>
		<li>Wysiewaj 50 000 komórek na szkiełkach nakrywkowych (nr 1, 15 × 15 mm) na płytce 12-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj w pełni zróżnicowane kultury HAE zgodnie z opisem18 na przepuszczalnych podporach wkładu Transwell z membraną (średnica = 6,5 mm) i posiew w pożywce do wzrostu nabłonka oskrzeli aż do całkowitego zrostu.</li>
	<li>Infekcja wirusowa
	<ol>
		<li>Zaszczepić komórki wirusem SARS-CoV-2 w dawce 1000-krotności mediany dawki zakaźnej w kulturze tkankowej (TCID50) na ml</li>
		<li>Inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć niezwiązanego wirusa.</li>
		<li>Hodowla komórek przez 48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. SARS-CoV-2 RNA-FISH w komórkach Vero hodowanych na szkiełkach nakrywkowych
DZIEŃ 1
<ol>
	<li>Utrwalanie i przepuszczalnie komórek
	<ol>
		<li>Napraw zainfekowane komórki za pomocą 3,7% w/v roztworu PFA przez 1 godzinę w RT.</li>
		<li>Odessać 3,7% roztwór PFA i dwukrotnie umyć komórki za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Przepuszczać komórki roztworem PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.</li>
		<li>Odessać PBST i dwukrotnie umyć komórki 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wykrywanie
	<ol>
		<li>Odessać 1x roztwór PBS i dwukrotnie przemyć komórki 2x SSC w RT.</li>
		<li>Odessać 2x roztwór SSC i wstępnie zhybrydyzować próbki, dodając co najmniej 300 μl buforu do hybrydyzacji sondy. Przykryć studzienki zawierające komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Przygotować roztwór sondy, dodając 1,2 pmol mieszaniny sondy do buforu hybrydyzacji sondy.
		<ol>
			<li>Użyj 1,2 μl sondy 1 μM, aby przygotować 300 μl materiału roboczego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń roztwór do prehybrydyzacji i przenieś szkiełka nakrywkowe do wilgotnej komory.
		<ol>
			<li>Odpipetować 30-50 μl roztworu sondy na parafilm, aby utworzyć pojedyncze kropelki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Próbki inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 37 °C. 
		 
		DZIEŃ 2</li>
		<li>Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do płytki 12-dołkowej i usunąć nadmiar roztworu sondy, przemłukując przez 4 x 5 minut 400 μl buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Jako alternatywę dla umieszczania 30-50 μl podwielokrotności na parafilmie i pod szkiełkami nakrywkowymi w celu inkubacji, należy dodać 300 μl roztworu sondy bezpośrednio do szkiełek nakrywkowych na płytce 12-dołkowej. Ta procedura jest prostsza, ale wymaga znacznych ilości odczynników. Przed użyciem podgrzej bufor do płukania sondy do temperatury 37 °C. Oblicz potrzebną ilość buforu i przenieś go do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Myć próbki przez 2 x 5 minut za pomocą 5x SSCT w RT.</li>
		<li>Zastąp 5 x roztwór SSCT 1 x PBS i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu amplifikacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wzmocnienie
	<ol>
		<li>Usunąć 1x roztwór PBS ze studzienek i dodać co najmniej 300 μl buforu amplifikacyjnego do każdego dołka. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotuj każdą spinkę do włosów HCR (h1 i h2), schładzając zatrzaskowo żądaną objętość w oddzielnych probówkach.
		<ol>
			<li>Aby przygotować 300 μl roztworu do amplifikacji, użyj 18 pmol każdej spinki do włosów (np. dla 300 μl użyj 6 μl 3 μM roztworu podstawowego spinki do włosów).</li>
			<li>Przenieś roztwór spinki do włosów do probówek.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 90 s.</li>
			<li>Schłodzić do RT przez 30 minut w ciemności.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj mieszankę spinek do włosów, dodając schłodzone zatrzaskowo spinki do włosów "h1" i "h2" do bufora wzmacniającego.</li>
		<li>Umieść krople 30-50 μl mieszanki spinek do włosów na parafolii.</li>
		<li>Próbki należy inkubować przez noc (12-18 godzin) w ciemności w temperaturze RT. 
		 
		DZIEŃ 3</li>
		<li>Przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytkę 12-dołkową i usuń nadmiar spinek do włosów, myjąc przez 5 x 5 minut 5x SSCT w temperaturze pokojowej z mieszaniem.</li>
		<li>Zassać 5x bufor SSCT i zastąpić go 1x PBS. 
		UWAGA: W razie potrzeby należy użyć próbek RNA-FISH w standardowym teście immunofluorescencyjnym, a następnie wybarwieć jądra (patrz punkt 5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie jądrowe i montaż ślizgowy
	<ol>
		<li>Odessać 1x roztwór PBS i zastąpić go 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 0,2 μg / ml) w 1x roztworze PBS.</li>
		<li>Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.</li>
		<li>Umieścić dwie krople po 10 μl podłoża montażowego każda; upewnić się, że krople są wystarczająco oddzielone, aby umożliwić umieszczenie dwóch szkiełek nakrywkowych na jednym szkiełku.</li>
		<li>Usuń nadmiar płynu, stukając w szkiełka nakrywkowe czystym ręcznikiem, a następnie umieść je w podłożu montażowym zapobiegającym blaknięciu komórkami skierowanymi w dół.</li>
		<li>Umieść zamontowane próbki na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności i pozwól im się utwardzić.</li>
		<li>Po utwardzeniu uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelniaczem VALAP lub lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu próbek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. SARS-CoV-2 RNA-FISH w kulturach HAE
DZIEŃ 1
<ol start="1">
	<li>Utrwalanie i przepuszczalność kultury HAE
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę i utrwalić zainfekowane komórki za pomocą 3,7% roztworu PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać 3,7% roztwór PFA i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
		<ol>
			<li>Zastąp 3,7% roztwór PFA 1x PBS pod wkładką Transwell.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odrzucić PBS i odwodnić próbki, przemywając je 2 x 5 minut 100% MeOH schłodzonym do temperatury -20 °C.</li>
		<li>Po drugim płukaniu należy wymienić bufor na świeży, schłodzony MeOH w celu przepuszczalności pod wkładem Transwell. Przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
DZIEŃ 2
<ol start="2">
	<li>Nawadnianie 
	Ponownie uwodnić próbki za pomocą stopniowanej serii roztworów MeOH/PBST (każda przez 5 minut) na lodzie: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS i 100% PBST (dwukrotnie).
	<ol>
		<li>Myj komórki przez 5 minut na lodzie z 50% 5x SSCT/50% PBST.</li>
		<li>Myć komórki przez 5 minut na lodzie za pomocą 5x SSCT.</li>
		<li>Zastąp bufor 5x SSCT na 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wykrywanie
	<ol>
		<li>Inkubować komórki (wewnątrz wkładki Transwell) przez 5 minut na lodzie ze 100 μl buforu do hybrydyzacji sondy. Następnie przenieść płytkę do inkubatora na 30 minut w temperaturze 37 °C (prehybrydyzacja). 
		UWAGA: Bufor do hybrydyzacji sondy musi być wstępnie podgrzany do 37 °C przed użyciem. Oblicz wymaganą objętość: 100 μl jest potrzebne na pojedynczą wkładkę Transwell.</li>
		<li>Przygotuj roztwór sondy. Ponieważ 1 ml roztworu sondy wymaga 4 pmol sondy, dodaj 4 μl 1 μM roztworu podstawowego sondy do 1 ml buforu hybrydyzacyjnego sondy i dobrze wymieszaj. 
		UWAGA: Do wykrywania RNA użyj 100 μl roztworu sondy na wkładkę Transwell. Pozostaw roztwór sondy na lodzie do końca etapu prehybrydyzacji.</li>
		<li>Usuń roztwór prehybrydyzacyjny i dodaj roztwór sondy.</li>
		<li>Inkubować komórki przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 37 °C. 
		 
		DZIEŃ 3</li>
		<li>Nadmiar sondy usunąć przez mycie przez 4 x 15 minut 100 μl buforu do płukania sondy w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Myć próbki przez 2 x 5 minut za pomocą 5x SSCT w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp 5x SSCT 1x PBS i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C do czasu amplifikacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wzmocnienie
	<ol>
		<li>Próbki należy wstępnie amplifikować, inkubując je z buforem amplifikacyjnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotuj każdą spinkę do włosów, schładzając zatrzaskowo żądane objętości w osobnych tubkach.
		<ol>
			<li>Aby przygotować 500 μl roztworu do amplifikacji, użyj 30 pmol każdej spinki do włosów (np. dla 500 μl użyj 10 μl 3 μM roztworu podstawowego spinki do włosów).</li>
			<li>Przenieś roztwór spinki do włosów do rurek.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 90 s.</li>
			<li>Schłodzić do RT przez 30 minut w ciemności.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór spinki do włosów, dodając wszystkie schłodzone spinki do włosów schłodzone zatrzaskowo do 500 μl buforu wzmacniającego w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń roztwór do wstępnego amplifikacji i dodaj kompletny roztwór spinki do włosów.</li>
		<li>Próbki należy inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Usunąć nadmiar spinek do włosów, myjąc 5x SSCT w RT w następujący sposób: 2 x 5 min, 2 x 15 min i 1 x 5 min.</li>
		<li>Zastąp 5x roztwór SSCT 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2-3 dni lub przejdź bezpośrednio do barwienia jądrowego. 
		UWAGA: W razie potrzeby należy użyć próbek RNA-FISH w standardowym teście immunofluorescencyjnym, a następnie barwieniu jądrowym (patrz punkt 6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie jądrowe i montaż ślizgowy
	<ol>
		<li>Odessać 1x PBS roztwór i zastąpić go roztworem DAPI (0,2 μg/ml) w 1x PBS.</li>
		<li>Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.</li>
		<li>Umieść membranę wyciętą z wkładek Transwell na 10 μl podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe medium montażowe (5 μl) do membrany.</li>
		<li>Przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi.</li>
		<li>Zamontowane próbki należy utwardzać na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności.</li>
		<li>Po utwardzeniu uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelniaczem VALAP lub lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu próbek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza immunofluorescencyjna komórek Vero i kultur HAE
UWAGA: Wykonaj test immunofluorescencyjny w dniu 3 dla linii komórkowych lub w dniu 4 dla hodowli HAE. Dla każdego modelu należy zastosować inne podejście. Wszystkie różnice są wyraźnie wskazane.
<ol>
	<li>Odessać 1x roztwór PBS ze studzienek.</li>
	<li>Blokować próbki przez inkubację z 1% w/v albuminy surowicy bydlęcej w roztworze PBST przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe, przygotowując odpowiednie rozcieńczenia w roztworze blokującym, a następnie inkubować.
	<ol>
		<li>Dla komórek Vero na szkiełkach nakrywkowych:
		<ol>
			<li>Umieścić krople (30-50 μl) roztworu przeciwciał na parafilmie w komorze wilgotnościowej.</li>
			<li>Umieść szkiełka nakrywkowe na kroplach przeciwciał komórkami skierowanymi w dół.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku HAE zastąpić środek blokujący w wkładkach roztworem przeciwciał (100 μl) i inkubować próbki w wilgotnej komorze. 
		UWAGA: Dostosuj czas i temperaturę dla każdej inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Typowe parametry to 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemywać próbki PBST przez 3 x 5 minut.
	<ol>
		<li>W przypadku komórek na szkiełkach nakrywkowych przenieść na płytkę 12-dołkową i dodać roztwór PBST.</li>
		<li>W przypadku posiewów HAE roztwór przeciwciała należy zastąpić roztworem PBST.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź źródła światła i filtry dostępne dla mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Wybierz przeciwciała drugorzędowe w zależności od gatunku gospodarza. Wybierz parametry fluoroforu (długości fal wzbudzenia i emisji, szerokość widma i wydajność wzbudzenia w zależności od dostępnego źródła światła). 
	UWAGA: Parametry spektralne można modelować za pomocą narzędzi online (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotuj odpowiednie roztwory przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając je roztworem blokującym.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (jak w ppkt 6.3), ale inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyć próbki jak w kroku 6.4.</li>
	<li>Barwienie jądrowe i montaż ślizgowy
	<ol>
		<li>Do komórek na szkiełkach nakrywkowych
		<ol>
			<li>Odessać PBST i zastąpić go DAPI (0,2 μg/ml) w roztworze 1x PBS.</li>
			<li>Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
			<li>Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.</li>
			<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe na kroplach 10 μl podłoża montażowego komórkami skierowanymi w dół.</li>
			<li>Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Do kultur HAE
		<ol>
			<li>Zassać 1x PBST i zastąpić go DAPI (0,2 μg/mL) w roztworze 1x PBS.</li>
			<li>Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
			<li>Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.</li>
			<li>Umieść wycięte membrany na kroplach 10 μl pożywki montażowej komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe (5 μl) podłoża montażowego do membrany.</li>
			<li>Przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi.</li>
			<li>Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Zdefiniuj ścieżki, określając używane fluorofory.</li>
	<li>Wybierz tryb i szybkość skanowania.</li>
	<li>Dostosuj wartości mocy, wzmocnienia i przesunięcia lasera dla każdego fluoroforu, porównując je z odpowiednimi kontrolami negatywnymi: dla wirusa, pozorowane komórki; dla białek komórkowych, próbki barwione przeciwciałami kontrolnymi izotypu od odpowiedniego gospodarza.</li>
	<li>Aby uzyskać obraz 3D, aktywuj tryb z-stack i ustaw górny i dolny limit. Ustaw rozmiar/liczbę kroku. 
	UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat obrazowania koronawirusa, zobacz19.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+multiplexed%2C+quantitative%2C+sensitive%2C+versatile%2C+robust%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145, (2018).</li>
<li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+in+human+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium.</a> Journal of Virology. 94, (2020).</li>
<li>Banach, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+epithelial+cell+culture+to+identify+new+respiratory+viruses%3A+coronavirus+NL63+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).</li>
<li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+human+coronavirus+NL63+into+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Entry of human coronavirus NL63 into the cell.</a> Journal of Virology. 92, (2018).</li>
<li>El Baba, R., Herbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+epigenomic+networks+entailed+in+coronavirus+infections+and+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19.</a> Clinical Epigenetics. 12, 118(2020).</li>
<li>Pinto, B. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACE2+expression+is+increased+in+the+lungs+of+patients+with+comorbidities+associated+with+severe+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19.</a> Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).</li>
<li>Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+link+between+ACE2+deficiency+and+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection.</a> European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).</li>
<li>Gordon, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SARS-CoV-2+protein+interaction+map+reveals+targets+for+drug+repurposing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing.</a> Nature. 583, 459-468 (2020).</li>
<li>Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viral+RNA+capping+machinery+as+a+target+for+antiviral+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs.</a> Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).</li>
<li>Mehta, S., Jeffrey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+receptors+and+signaling%3A+epigenetic+factors+in+the+regulation+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity.</a> Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).</li>
<li>Poppe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF-kappaB-dependent+and+-independent+transcriptome+and+chromatin+landscapes+of+human+coronavirus+229E-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells.</a> PLoS Pathogens. 13, 1006286(2017).</li>
<li>Schafer, A., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+landscape+during+coronavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Epigenetic landscape during coronavirus infection.</a> Pathogens. 6 (1), 8(2017).</li>
<li>Carletti, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+priming+of+cell+intrinsic+innate+antiviral+signaling+by+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response.</a> Nature Communications. 10, 3889(2019).</li>
<li>Heil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+recognition+of+single-stranded+RNA+via+toll-like+receptor+7+and+8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8.</a> Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).</li>
<li>Sze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+restriction+factor+SAMHD1+limits+human+T+cell+leukemia+virus+type+1+infection+of+monocytes+via+STING-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis.</a> Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).</li>
<li>Kikkert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+evasion+by+human+respiratory+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses.</a> Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).</li>
<li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+m%286%29A+editing+of+HIV-1+mRNAs+enhances+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 830(2017).</li>
<li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Cell+Culture+Protocols+in+Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).</li>
<li>Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+coronavirus+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing coronavirus entry into cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Immuno-RNA-FISH to niezawodna metoda podwójnego barwienia RNA i białek komórkowych. W tym miejscu opisano zmodyfikowany protokół immuno-RNA-FISH, który umożliwia wykrywanie RNA SARS-CoV-2 i białek komórkowych w liniach komórkowych i kulturach HAE. Protokół ten można dostosować do stosowania w różnych modelach komórek, w tym monowarstwach komórkowych lub określonych tkankach. Metoda opiera się na koncepcji HCR inicjowanego przez odpowiednią lokalizację sondy. Następnie, użycie sond z dzielonym inicjatorem w celu rozpoczęc...

SARS-CoV-2 to nowy ludzki betakoronawirus, który pojawił się pod koniec 2019 roku, wywołując bezprecedensową pandemię kilka miesięcy później. Ponieważ wirus jest nowy dla nauki, większość jego biologii i wpływu na komórki gospodarza pozostaje nieznana. Dlatego mapowanie tropizmu wirusa-komórki i tkanki podczas infekcji jest ważne, jeśli chcemy zrozumieć jego podstawowe cechy biologiczne i wpływ na gospodarza. Do badania interakcji wirus-gospodarz stosuje się kilka technik, w tym testy biochemiczne, biologiczne i fizyczne. Hybrydyzacja in situ jest powszechną metodą, która wykorzystuje znakowane komplementarne DNA, RNA lub zmodyfikowane sondy kwasów nukleinowych, które lokalizują się w określonych sekwencjach DNA lub RNA w komórce lub tkance.
Nowa metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji RNA in situ (RNA-FISH) została opracowana, która zawiera modyfikacje w celu zwiększenia czułości poprzez wzmocnienie stosunku sygnału do szumu za pomocą HCR1. HCR pozwala na badanie lokalizacji RNA na poziomie pojedynczej komórki. Ze względu na wysoką specyficzność, czułość i rozdzielczość, metoda ta jest przydatna nie tylko w badaniach z zakresu nauk podstawowych, ale także w projektach aplikacyjnych, np. diagnostyce. Niedawno wykazano wykonalność tej metody do wykrywania RNA SARS-CoV-2 zlokalizowanego w komórkach rzęskowych w całkowicie zróżnicowanych kulturach 3D ludzkiego nabłonka dróg oddechowych (HAE)2. Hodowle HAE stanowią jedno z najbardziej zaawansowanych narzędzi wykorzystywanych do badania infekcji wirusowych w kontekście mikrośrodowiska "naturalnej infekcji"3,4.
Kilka doniesień na temat ludzkich koronawirusów (HCoV), w tym SARS-CoV-2, podkreśla znaczenie modyfikacji epigenetycznych w odniesieniu do infekcji i patofizjologii HCoV [przejrzane w 5], np. wzór metylacji genu kodującego receptor enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE-2)6,7. Co ciekawe, badania przesiewowe metodą spektrometrii mas zidentyfikowały kilka czynników epigenetycznych, które wchodzą w interakcje z proteomem SARS-CoV-2 klasy <sup="xref">8. Dokładniej, niestrukturalne białko 5 (NSP5) wiąże się z regulatorem epigenetycznym, deacetylazą histonową 2, a katalitycznie nieaktywny NSP5 (C145A) oddziałuje z metylotransferazą tRNA 1 (24). Dodatkowo, aktywność metylotransferazy NSP16 jest blokowana przez inhibitor metylotransferazy, sinefungin9. Jednak dokładna rola tych czynników epigenetycznych w COVID-19 pozostaje niejasna. Replikacja HCoV odbywa się w cytoplazmie zakażonej komórki i wyzwala reakcje zapalne, które są regulowane przez modyfikacje epigenetyczne10.
Na przykład, HCoV-229E precyzyjnie dostraja sygnalizację czynnika jądrowego kappa B i głęboko przeprogramowuje krajobraz chromatyny komórkowej gospodarza poprzez zwiększenie acetylacji H3K36 i H4K5 w niektórych regionach11. Zakażenie koronawirusem związanym z bliskowschodnim zespołem oddechowym zwiększa poziom H3K27me3 i wyczerpuje H3K4me3 w regionach promotorowych podzbiorów specyficznych genów wrażliwych na interferon12. Ponadto wirusowe RNA wyzwala odpowiedź immunologiczną komórek, jak wykazano w przypadku flawiwirusów13, retroviruses14,15 i coronaviruses16. Markery epigenetyczne na wirusowym RNA mogą odgrywać rolę w rozpoznawaniu przez czujniki komórkowe, jak pokazano w przypadku metylacji m7A ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1 RNA17. Pozostają jednak pytania: Jaki jest wpływ RNA SARS-CoV-2 na odpowiedź immunologiczną i czy w grę wchodzą znaki epigenetyczne?
Tutaj opisano zoptymalizowaną metodę RNA-FISH połączoną z analizą immunofluorescencyjną linii komórkowych i tkanek 3D (w pełni zróżnicowane HAE). Chociaż metody cytologiczne, takie jak FISH i immunofluorescencja, są szeroko stosowane, ta metoda hybrydyzacji in situ nowej generacji oparta na HCR nigdy nie była używana do wykrywania wirusów (z wyjątkiem niedawnej publikacji)2. Ogólnie rzecz biorąc, barwienie immunologiczne i FISH wymagają następujących etapów: przepuszczalność, aby umożliwić penetrację sond lub przeciwciał; utrwalenie, w którym materiał komórkowy jest utrwalony i zachowany; wykrywanie, w którym stosowane są przeciwciała lub sondy kwasów nukleinowych; i wreszcie montaż próbek do wizualizacji.
Chociaż istniejące protokoły mają te ogólne cechy, różnią się one znacznie pod względem parametrów. W tym miejscu opisano zoptymalizowany, prosty protokół immuno-RNA-FISH do wykrywania RNA SARS-CoV-2 w kulturach HAE i komórkach Vero. Technika składa się z następujących etapów: (1) utrwalanie komórek za pomocą paraformaldehydu; (2) przepuszczalność z detergentem lub metanolem (MeOH); (3) rehydratacja za pomocą stopniowanej serii roztworów MeOH (tylko kultury HAE); (4) wykrywanie; (5) amplifikacja z wykorzystaniem technologii HCR do wykrywania RNA SARS-CoV-2; (6) barwienie immunologiczne; oraz (7) obrazowanie pod mikroskopem konfokalnym.

<table><tbody><tr><td>Sprzęt Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>konfokalny LSM 880</td><td>ZEISS </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grant Bio, Mini Rocker- Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>12965501</td> Inkubator Galaxy170R <td></td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick</td><td>CO170R-230-1000</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000 011</td><td></td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 15 mm x 15 mm nr 1</td><td>LabSolute</td><td>7695022</td><td></td></tr><tr><td>probówki 1,5 ml</td><td>FL-MEDICAL</td><td>5.350.023.053</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>TTP</td><td>92412</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Sarstedt</td><td>5.332.547.254</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Pipety</td> serologiczne Sigma <td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kolekcja VWR</td><td>612-5523P, 612-5827P</td><td></td></tr><tr><td>szkło ślizgowe</td><td>PTH CHEMLAND</td><td>04-296.202.03</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki Transwell ThinCerts</td><td>Grainer bio-one</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluorofor 488-sprzężone przeciwciała drugorzędowe </td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta; 5-tubulina </td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td> sc-134234</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan disodowy</td><td>Sigma</td><td>S51136-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>BioShop</td><td>EGT101.25</td><td></td></tr><tr><td>HCR Amplification</td><td>Buffer Molecular Instruments, Inc.</td><td></td><td>Można również przygotować BAM01522 Bufor doi:10.1242/dev.165753: Informacje uzupełniające</td></tr><tr><td>Wzmacniacz HCR B1-h1 Alexa Fluor 647</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>S013922</tr><tr><td>Wzmacniacz HCR B1-h2 Alexa Fluor 647</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td></td><td>Bufor</td></tr><tr><td>hybrydyzacyjny sondy S012522 HCR</td><td>Instrumenty molekularne, Inc.</td><td>Można</td><td>również przygotować BPH03821 Bufor doi:10.1242/dev.165753: Zestaw sondy HCR z informacjami uzupełniającymi</td></tr><tr><td>dla SARS-CoV-2 Ncapsid</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td>PRE134</td><td></td></tr><tr><td>HCR Probe Wash Buffer</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td>Można</td><td>również przygotować BPW01522 Bufor doi:10.1242/dev.165753: Informacje uzupełniające</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.100</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan monopotasowy</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>BioShop</td><td>PIP666.100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P5405-250G</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Diamentowe medium montażowe zapobiegające blaknięciu</td><td>Invitrogen</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>BioShop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy 2-hydrat</td><td>POCH</td><td> 6132-04-3</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN580.500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeglądarka</td><td></td><td></td> spektrawizora fluorescencji <td>Modelowanie parametrów spektralnych</td></tr><tr><td>ImageJ Fidżi</td><td></td><td></td><td>Akwizycja i przetwarzanie obrazów z-stack</td></tr></tbody></table>

wizualizacja sars-cov-2 za pomocą hybrydyzacji immuno rna-fluorescencji in situ

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Ten manuskrypt zawiera protokół reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ (HCR) połączonej z immunofluorescencją do wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) w linii komórkowej i trójwymiarowych (3D) kulturach ludzkiego nabłonka dróg oddechowych. Metoda ta pozwala na wysoce specyficzną i czułą wizualizację wirusowego RNA poprzez oparcie się na HCR zainicjowanym przez lokalizację sondy. Sondy z dzielonym inicjatorem pomagają wzmocnić sygnał przez wzmacniacze znakowane fluorescencyjnie, co skutkuje znikomą fluorescencją tła w mikroskopii konfokalnej. Znakowanie wzmacniaczy różnymi barwnikami fluorescencyjnymi ułatwia jednoczesne rozpoznawanie różnych celów. To z kolei pozwala na mapowanie infekcji w tkankach, aby lepiej zrozumieć patogenezę i replikację wirusa na poziomie pojedynczej komórki. Sprzężenie tej metody z immunofluorescencją może ułatwić lepsze zrozumienie interakcji gospodarz-wirus, w tym przemiany epigenomu gospodarza i szlaków odpowiedzi immunologicznej. Dzięki czułej i specyficznej technologii HCR, protokół ten może być również używany jako narzędzie diagnostyczne. Należy również pamiętać, że technikę tę można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić wykrywanie dowolnego RNA, w tym niekodujących RNA i wirusów RNA, które mogą pojawić się w przyszłości.

Protokół immuno-RNA-FISH opisany w niniejszym manuskrypcie został przeprowadzony z wykorzystaniem dwóch systemów komórkowych: linii komórkowej Vero oraz hodowli 3D HAE. Główne etapy dla obu modeli komórkowych przedstawiono w Tabeli 2. Protokół RNA-FISH służący do wizualizacji SARS-CoV-2 w hodowlach HAE obejmuje kroki typowe dla próbek tkankowych, t.j. permeabilizację 100% MeOH oraz rehydratację poprzez stopniowane serie roztworów MeOH-PBS i 0,1% Tween. Immunofluorescencję...

Tutaj opisujemy prostą metodę, która łączy fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (RNA-FISH) z immunofluorescencją w celu wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Protokół ten może zwiększyć zrozumienie charakterystyki molekularnej interakcji RNA-gospodarz SARS-CoV-2 na poziomie pojedynczej komórki.

Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Protokół ten umożliwił wizualizację RNA SARS-CoV-2 w liniach komórkowych oraz w pełni zróżnicowanych, trójwymiarowych kulturach nabłonka ludzkich dróg oddechowych, dostarczając narzędzia do lepszego zrozumienia patogenezy i replikacji wirusa na poziomie pojedynczej komórki. Ze względu na wysoką swoistość, czułość i rozdzielczość, metoda ta jest przydatna nie tylko w podstawowych badaniach naukowych nad SARS-koronawirusem-2, ale także w projektach aplikacyjnych, takich jak diagnostyka. Zabieg zademonstruje Agnieszka Suder, doktorantka z mojego laboratorium.Po utrwaleniu i przepuszczalności komórek zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, usuń roztwór 1X PBS ze studzienek i dodaj co najmniej 300 mikrolitrów buforu amplifikacyjnego do każdej studzienki. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przygotuj każdą spinkę do włosów HCR, schładzając zatrzaskowo żądaną objętość w oddzielnych probówkach.Aby przygotować 300 mikrolitrów roztworu amplifikacyjnego, użyj 18 pikomoli z każdej spinki do włosów. Przenieś roztwór spinki do włosów do probówek i inkubuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 90 sekund. Następnie schłodzić do temperatury pokojowej przez 30 minut w ciemności.Przygotuj mieszankę spinek do włosów, dodając chłodzone zatrzaskowo spinki H1 i H2 do buforu wzmacniającego. Umieść krople od 30 do 50 mikrolitrów mieszanki spinek do włosów na Parafilm. Umieścić szkiełka nakrywkowe z komórkami na kroplach mieszanki spinki do włosów i inkubować próbki przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.Aby zamontować szkiełka, umieść dwie 10-mikrolitrowe krople podłoża montażowego na szkiełku, upewniając się, że krople są wystarczająco oddzielone, aby umożliwić umieszczenie dwóch szkiełek nakrywkowych na jednym szkiełku. Usuń nadmiar płynu, stukając w szkiełka nakrywkowe o czysty ręcznik. Następnie umieść je w podłożu do montażu zapobiegającego blaknięciu komórkami skierowanymi w dół.Umieść zamontowane próbki na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności i pozwól im utwardzić się. Po utrwaleniu i przepuszczalności komórek HAE zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, należy wstępnie amplifikować próbki, inkubując je z buforem amplifikacyjnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyj 30 pikomoli z każdej spinki do włosów, aby przygotować 500 mikrolitrów roztworu wzmacniającego.Przenieś roztwór spinki do włosów do probówek i inkubuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 90 sekund. Następnie schładzaj je do temperatury pokojowej przez 30 minut w ciemności. Przygotuj roztwór spinki do włosów, dodając wszystkie schłodzone spinki do włosów do 500 mikrolitrów buforu wzmacniającego w temperaturze pokojowej.Usuń roztwór do wstępnego amplifikacji i dodaj kompletny roztwór spinki do włosów. Następnie należy inkubować próbki przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Umieść wyciętą membranę z wkładek Transwell na 10 mikrolitrach podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe medium montażowe do membrany.Następnie przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi. Ten protokół immuno-RNA-FISH został przeprowadzony w dwóch systemach komórkowych, linii komórkowej Vero i hodowli 3D ludzkiego nabłonka dróg oddechowych. Lokalizacja subgenomowego RNA SARS-coronavirus-2 w zakażonych i pozorowanych komórkach Vero pokazano tutaj.Wirusowe RNA można zobaczyć na czerwono. Pokazano tutaj lokalizację subgenomowego RNA koronawirusa SARS-2 w zakażonych i pozorowanych komórkach nabłonka ludzkich dróg oddechowych. Protokół przenikania został zoptymalizowany w komórkach Vero.Przepuszczalność z detergentem powoduje wyraźny, specyficzny sygnał dla subgenomowego RNA SARS-koronawirusa-2, podczas gdy użycie etanolu powoduje rozmyty i nieostry obraz. Podczas montażu szkiełek z komórkami Vero ważne jest, aby umieścić szkiełko nakrywkowe tak, aby ogniwa były skierowane w dół. Podczas montażu szkiełek HAE membranę należy umieścić komórkami skierowanymi do góry.Technikę tę można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić wykrywanie dowolnego RNA, w tym niekodujących RNA i wirusów RNA, które mogą pojawić się w przyszłości. W połączeniu z immunofluorescencją może być stosowany do badania interakcji białko-RNA na poziomie pojedynczej komórki.

visualization-sars-cov-2-using-immuno-rna-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji reakcji łańcuchowej (HCR)-fluorescencji in situ (FISH) do wizualizacji przestrzennego rozkładu subgenomowego RNA SARS-CoV-2. Połączenie HCR z technikami immunofluorescencji może dostarczyć informacji na temat interakcji gospodarz-wirus na poziomie pojedynczej komórki.

Wykorzystanie fluorescencji immuno-RNA Hybrydyzacja in Situ do wizualizacji SARS-CoV-2

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Dwuniciowe RNA wytwarzane podczas replikacji wirusa RNA mogą być rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzorce, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wirusów RNA o ujemnym znaczeniu interakcja między niskim poziomem dsRNA a PRR pozostaje niejasna. Opracowaliśmy metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dsRNA i PRR arenawirusa w poszczególnych komórkach.

Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Poznaj metodę hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ do wizualizacji SARS-CoV-2 w liniach komórkowych i trójwymiarowych kulturach nabłonka dróg oddechowych. Technika umożliwia wykrywanie RNA wirusa z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ

Przeglądaj więcej filmów