Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ
23 grudnia 2020
Tutaj opisujemy prostą metodę, która łączy fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (RNA-FISH) z immunofluorescencją w celu wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Protokół ten może zwiększyć zrozumienie charakterystyki molekularnej interakcji RNA-gospodarz SARS-CoV-2 na poziomie pojedynczej komórki.
Protokół ten umożliwił wizualizację RNA SARS-CoV-2 w liniach komórkowych oraz w pełni zróżnicowanych, trójwymiarowych kulturach nabłonka ludzkich dróg oddechowych, dostarczając narzędzia do lepszego zrozumienia patogenezy i replikacji wirusa na poziomie pojedynczej komórki. Ze względu na wysoką swoistość, czułość i rozdzielczość, metoda ta jest przydatna nie tylko w podstawowych badaniach naukowych nad SARS-koronawirusem-2, ale także w projektach aplikacyjnych, takich jak diagnostyka. Zabieg zademonstruje Agnieszka Suder, doktorantka z mojego laboratorium.
Po utrwaleniu i przepuszczalności komórek zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, usuń roztwór 1X PBS ze studzienek i dodaj co najmniej 300 mikrolitrów buforu amplifikacyjnego do każdej studzienki. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przygotuj każdą spinkę do włosów HCR, schładzając zatrzaskowo żądaną objętość w oddzielnych probówkach.
Aby przygotować 300 mikrolitrów roztworu amplifikacyjnego, użyj 18 pikomoli z każdej spinki do włosów. Przenieś roztwór spinki do włosów do probówek i inkubuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 90 sekund. Następnie schłodzić do temperatury pokojowej przez 30 minut w ciemności.
Przygotuj mieszankę spinek do włosów, dodając chłodzone zatrzaskowo spinki H1 i H2 do buforu wzmacniającego. Umieść krople od 30 do 50 mikrolitrów mieszanki spinek do włosów na Parafilm. Umieścić szkiełka nakrywkowe z komórkami na kroplach mieszanki spinki do włosów i inkubować próbki przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
Aby zamontować szkiełka, umieść dwie 10-mikrolitrowe krople podłoża montażowego na szkiełku, upewniając się, że krople są wystarczająco oddzielone, aby umożliwić umieszczenie dwóch szkiełek nakrywkowych na jednym szkiełku. Usuń nadmiar płynu, stukając w szkiełka nakrywkowe o czysty ręcznik. Następnie umieść je w podłożu do montażu zapobiegającego blaknięciu komórkami skierowanymi w dół.
Umieść zamontowane próbki na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności i pozwól im utwardzić się. Po utrwaleniu i przepuszczalności komórek HAE zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, należy wstępnie amplifikować próbki, inkubując je z buforem amplifikacyjnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyj 30 pikomoli z każdej spinki do włosów, aby przygotować 500 mikrolitrów roztworu wzmacniającego.
Przenieś roztwór spinki do włosów do probówek i inkubuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 90 sekund. Następnie schładzaj je do temperatury pokojowej przez 30 minut w ciemności. Przygotuj roztwór spinki do włosów, dodając wszystkie schłodzone spinki do włosów do 500 mikrolitrów buforu wzmacniającego w temperaturze pokojowej.
Usuń roztwór do wstępnego amplifikacji i dodaj kompletny roztwór spinki do włosów. Następnie należy inkubować próbki przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Umieść wyciętą membranę z wkładek Transwell na 10 mikrolitrach podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe medium montażowe do membrany.
Następnie przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi. Ten protokół immuno-RNA-FISH został przeprowadzony w dwóch systemach komórkowych, linii komórkowej Vero i hodowli 3D ludzkiego nabłonka dróg oddechowych. Lokalizacja subgenomowego RNA SARS-coronavirus-2 w zakażonych i pozorowanych komórkach Vero pokazano tutaj.
Wirusowe RNA można zobaczyć na czerwono. Pokazano tutaj lokalizację subgenomowego RNA koronawirusa SARS-2 w zakażonych i pozorowanych komórkach nabłonka ludzkich dróg oddechowych. Protokół przenikania został zoptymalizowany w komórkach Vero.
Przepuszczalność z detergentem powoduje wyraźny, specyficzny sygnał dla subgenomowego RNA SARS-koronawirusa-2, podczas gdy użycie etanolu powoduje rozmyty i nieostry obraz. Podczas montażu szkiełek z komórkami Vero ważne jest, aby umieścić szkiełko nakrywkowe tak, aby ogniwa były skierowane w dół. Podczas montażu szkiełek HAE membranę należy umieścić komórkami skierowanymi do góry.
Technikę tę można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić wykrywanie dowolnego RNA, w tym niekodujących RNA i wirusów RNA, które mogą pojawić się w przyszłości. W połączeniu z immunofluorescencją może być stosowany do badania interakcji białko-RNA na poziomie pojedynczej komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę, która integruje fluorescencyjną hybrydyzację in situ RNA (RNA-FISH) z immunofluorescencją w celu wizualizowania RNA SARS-CoV-2. To podejście zwiększa zrozumienie interakcji RNA SARS-CoV-2 z gospodarzem na poziomie pojedynczej komórki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Wirusologia
- Biologia komórki
Tło
- Zrozumienie patogenezy wirusowej jest kluczowe dla opracowania skutecznych diagnostyk i terapii.
- SARS-CoV-2 ma znaczące implikacje dla zdrowia publicznego.
- Wizualizacja RNA na poziomie pojedynczej komórki może dostarczyć wglądu w replikację wirusową.
- Łączenie RNA-FISH z immunofluorescencją oferuje wysoką specyficzność i czułość.
Cel badania
- Wizualizacja RNA SARS-CoV-2 w różnych modelach komórkowych.
- Zwiększenie zrozumienia interakcji wirusowych w komórkach gospodarza.
- Dostarczenie narzędzia zarówno dla badań podstawowych, jak i stosowanych w wirusologii.
Stosowane metody
- Fiksacja i permeabilizacja komórek.
- Zastosowanie bufora amplifikacyjnego do wizualizowania RNA.
- Zastosowanie włosków HCR do wykrywania specyficznego RNA.
- Techniki immunofluorescencji uzupełniające RNA-FISH.
Główne wyniki
- RNA SARS-CoV-2 zostało pomyślnie zwizualizowano w liniach komórkowych i kulturach nabłonka dróg oddechowych człowieka.
- Metoda wykazała wysoką specyficzność i czułość.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia patogenezy wirusowej.
- Ten protokół jest przydatny zarówno do celów badawczych, jak i diagnostycznych.
Wnioski
- Połączona metoda jest skuteczna w badaniu SARS-CoV-2 na poziomie pojedynczej komórki.
- Dostarcza cenny wgląd w interakcje RNA-gospodarz.
- To podejście może pomóc w opracowaniu narzędzi diagnostycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
