Name: Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj mikroiniekcję zarodków Helicoverpa armigera i identyfikację mutantów nokautujących przy użyciu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów in vivo w celu rozwoju strategii zwalczania szkodników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31725023, 31861133019 do GW, a 31171912 do CY).

1. Projektowanie starterów specyficznych dla genów i przygotowanie sgRNA
<ol>
	<li>Zweryfikuj konserwatywny region genomowy w genie będącym przedmiotem zainteresowania poprzez amplifikację PCR i analizy sekwencjonowania. Amplifikować gen docelowy z DNA genomu H. armigera i rozróżnić eksony i introny. 
	UWAGA: Specyficzność sekwencji miejsca przewodnika jest niezbędna, aby uniknąć edycji genów poza celem. Poszukiwane możliwe miejsca przewodników w eksonach znajdują się w pobliżu 5' UTR genu. Następnie ważne jest, aby upewnić się, że gen jest całkowicie niefunkcjonalny. Podsumowanie ścieżki przepływu do przygotowania sgRNA jest zilustrowane na Rysunek 1.</li>
	<li>Wybierz cele sgRNA. Skorzystaj ze strony internetowej CRISPOR (wersja 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py), aby wyszukać możliwe miejsca przewodników w eksonach w pobliżu 5' UTR genu. Wprowadź sekwencję eksonów w polu tekstowym i wybierz genom docelowy do Helicoverpa armigera (Harm_1.0). Wybrać opcję motywu przyległego protospaceru (PAM) o wartości "20 bp-NGG" i pozostawić pozostałe ustawienia na parametrach domyślnych zgodnie z instrukcjami obsługi stron internetowych.</li>
	<li>Porównaj przewidywane sekwencje przewodników z oprogramowania i wybierz sekwencję prowadzącą o najwyższej przewidywanej wydajności i najmniejszej liczbie niezgodności, aby poprawić wydajność edycji i zmniejszyć edycję poza celem. Zalecana jest sekwencja prowadząca 20 pz zawierająca jedno lub dwa G na 5' UTR, ponieważ może to zwiększyć wydajność cięcia. 
	UWAGA: Para gRNA w regionach egzonów jest również zalecana w celu uzyskania dużej delecji segmentu, co upraszcza wykrywanie mutantów w późniejszych krokach. Upewnij się, że odstęp między dwiema wybranymi sekwencjami prowadzącymi wynosi co najmniej 100 pz. W tym protokole wybieramy powszechnie stosowane białko SpCas9, które rozpoznaje motyw NGG. Zgodnie z instrukcją producenta, sekwencja prowadząca pozbawiona G jest również dopuszczalna przy wyborze promotora T7, ponieważ promotor dodaje G do 5' UTR sekwencji.</li>
	<li>Projektowanie oligonukleotydów do przodu i do tyłu. Ustaw kolejność sekwencji na 5'-20 bp sekwencja prowadząca-NGG-3' i odwrotnie uzupełnij sekwencję prowadzącą. Dodaj sekwencję promotora T7 do sekwencji prowadzącej przedniej i odwrotnej nici, odpowiednio zgodnie z instrukcją obsługi zestawu do syntezy gRNA. 
	UWAGA: Sekwencję PAM NGG należy wykluczyć z sekwencji oligonukleotydowej.</li>
	<li>Wygeneruj sgRNA za pomocą zestawu do syntezy gRNA. Proces ten obejmuje trzy etapy: składanie matrycy DNA, transkrypcję in vitro i oczyszczanie sgRNA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). Wykonaj każdy krok zgodnie z instrukcjami użytkownika.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Oddziel poczwarki samca i samicy zgodnie z opisem Hongtao et al.34 i podziel je na dwie różne klatki sieciowe. Po ekluzji nakarm je ~30 ml 10% (w/v) roztworu białego cukru w chłonnej bawełnie na szalce Petriego. 
	UWAGA: 3 g białego cukru rozpuszczono w 30 ml sterylnej wody w celu przygotowania 10% (w/v) roztworu białego cukru.</li>
	<li>Wybierz 50 zdrowych osobników odpowiednio z 3-dniowych samców i 2-dniowych samic i wymieszaj je w czystej klatce z siatki. Umieść kawałek bawełny zawierającej 10% (w/v) roztworu cukru w klatce i utrzymuj bawełnę wilgotną. Przykryj klatki siatkowe gazą i przymocuj gazę gumką. Spryskaj gazę wodą, aby była wilgotna.</li>
	<li>Pozwól wybranym samcom i samicom w kroku 2 całkowicie się połączyć w pary i obserwuj ilość składanych jaj. 
	UWAGA: Szczyt składania jaj H. armigera przypada na okres po godzinie 21:00. Dlatego należy wziąć pod uwagę czas krycia, aby zapewnić wystarczającą liczbę jaj w kolejnych etapach. W szczycie składania jaj zastąp gazę czarną szmatką i pozwól na swobodne składanie jaj przez 30 minut. Wymieniaj czarną szmatkę co 30 minut do zbierania świeżych jaj (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Pokrój czarną szmatkę w łaty o nieregularnych kształtach o wielkości około 3 mm. Upewnij się, że na każdej plastrze znajduje się więcej jaj. 
	UWAGA: Unikaj wybierania jaj pomarszczonych, ponieważ zwykle są one niezapłodnione.</li>
	<li>Wklej taśmę dwustronną na szkiełko mikroskopowe (25 mm x 75 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Za pomocą kleszczy wklej plastry z jajkami w rzędzie na powierzchni taśmy dwustronnej. Naciśnij margines każdej łatki, aby upewnić się, że mocno przylegają do taśmy. Zbierz 50-100 jaj na szkiełko mikroskopowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). 
	UWAGA: Łaty muszą pokrywać całą powierzchnię taśmy dwustronnej, w przeciwnym razie wylęgająca się larwa będzie miała trudności z wyczołganiem się.</li>
	<li>Przed mikroiniekcją należy trzymać szkiełko mikroskopowe na lodzie, aby opóźnić rozwój zarodków.</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja zarodków
<ol>
	<li>Przygotuj igłę, ciągnąc szklankę kapilarną za pomocą ściągacza do mikropipet (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). Ustaw ciepło na 540, pociągnięcie na 80, vel na 75, czas na 170 i ciśnienie na 450. Zeszlifuj końcówkę igły za pomocą mikro młynka. Idealna igła ma ostro zakończony końców (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Przygotowanie roztworów do wstrzykiwań. Dodaj 2 μl skomercjalizowanego białka Cas9 (1 mg / ml) i sgRNA (300-500 ng / μL końcowe stężenie) do wody wolnej od RNaz w probówce PCR, aby uzyskać mieszaninę o objętości 10 μl. Objętość sgRNA zależy od jego stężenia. Dobrze wymieszaj pipetując i umieść na lodzie. 
	UWAGA: Wszystkie końcówki do pipet i probówki do PCR używane na tym etapie są wolne od RNaz.</li>
	<li>Ustaw parametry elektronicznego mikrowtryskiwacza. Ustaw ciśnienie wtrysku (pi) na 1 500 hPa, czas wtrysku (ti) na 0,1 s, a ciśnienie kompensacyjne (pc) na 30 hPa.</li>
	<li>Załadować 2 μl mieszaniny do igły za pomocą końcówki do pipety z mikroładowarką. Powietrze resztkowe w końcówce igły powinno być w jak największym stopniu wydmuchiwane.</li>
	<li>Podłączyć igłę do wstrzykiwania do mikromanipulatora i zapewnić szczelne połączenie między dwiema częściami.</li>
	<li>Umieść szkiełko na szalce Petriego (100 mm) i umieść je na stoliku mikroskopu (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
	<li>Dostosuj położenie końcówki igły pod mikroskopem świetlnym, aż zarówno końcówka igły, jak i zarodki będą widoczne pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B).</li>
	<li>Dostosuj objętość kropli. Naciśnij pedał i obserwuj kroplę płynu na końcówce igły. Dostosować ciśnienie wstrzykiwania mikrowstrzykiwacza do momentu, gdy objętość kropli płynu będzie równa około jednej dziesiątej objętości zarodków. 
	UWAGA: Jakość igły do wstrzykiwań ma kluczowe znaczenie dla przeżywalności zarodków.</li>
	<li>Ostrożnie włóż końcówkę igły do górnej półkuli zarodka pod kątem 45 stopni (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C). Naciśnij pedał, aby dostarczyć mieszaninę do zarodka. Wstrzyknięcie prowadzi do niewielkiego rozszerzenia zarodka. Natychmiast wycofać igłę z zarodka i przesuwać szalkę Petriego jedną ręką, aż następny zarodek znajdzie się w pobliżu igły i wstrzyknąć następny zarodek zgodnie z tą samą procedurą. 
	UWAGA: Odpływ cytoplazmatyczny w otworku jest dopuszczalny. Jeśli przeciek cytoplazmatyczny jest zbyt duży, dostosuj kąt igły do bardziej intensywnego, aż odpływ płynu zostanie opanowany.</li>
	<li>Wstrzyknąć co najmniej 300 zarodków, aby zapewnić wystarczającą ilość wylęgu. Przykryć pokrywę szalki Petriego po wstrzyknięciu. 
	UWAGA: Czas od złożenia jaj do wstrzyknięcia 50-100 zarodków jest ograniczony do 2 godzin. W tym czasie większość zarodków jest nadal w stadium jednokomórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, przydatne jest powtórzenie procedury składania jaj podczas wstrzykiwania zarodka, aby zwiększyć wydajność.</li>
</ol>
4. Hodowla owadów po iniekcji
<ol>
	<li>Rozmnażanie zarodków G0.
	<ol>
		<li>Inkubować zarodki w wilgotności względnej 60% i temperaturze 28°C w pomieszczeniu o sztucznym klimacie z 14 godzinami światła/10 godzinami ciemności.</li>
		<li>Codziennie po wstrzyknięciu należy sprawdzać rozwój zarodków. Gdy kolor powierzchni zarodków pociemnie, umieść sztuczną dietę na szalce Petriego wokół szkiełka mikroskopowego i sprawdzaj rozwój zarodków co 12 godzin 
		UWAGA: Sztuczna dieta jest przygotowywana zgodnie z opisem Wu et al.35 oraz Jha et al.36.</li>
		<li>Przygotuj 24-dołkowe płytki hodowlane i wypełnij każdą studzienkę do jednej trzeciej jej pojemności objętościowej sztuczną dietą.</li>
		<li>Wybierz larwy wylęgające się (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D) za pomocą małego pędzla i przenieś je na 24-dołkową płytkę hodowlaną. Włóż jedną larwę do studzienki, aby upewnić się, że każda larwa ma wystarczającą ilość pożywienia, aby przeżyć. 
		UWAGA: Larwy H. armigera były hodowane indywidualnie w każdej studni, ponieważ zwykle kanibalizowały się nawzajem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla larw G0
	<ol>
		<li>Larwy należy hodować w takich samych warunkach jak zarodki.</li>
		<li>Codziennie sprawdzaj wyklute larwy. Kiedy larwy osiągną trzecie stadium rozwojowe, przenieś każdą larwę do nowego szklanego dactylethrae, wypełniając jedną piątą objętości sztuczną dietą.</li>
		<li>Około 12 dni po inkubacji dojrzałe larwy powinny zacząć się przepoczwarzać.</li>
		<li>Dojrzałe poczwarki G0 rozróżnia się na podstawie płci i umieszcza w oddzielnych klatkach przed ekluzją. Przygotowywane są również poczwarki w tym samym wieku typu dzikiego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>G0 odchów dorosłych
	<ol>
		<li>Codziennie sprawdzaj eklozję zarówno poczwarek typu dzikiego, jak i zmutowanego.</li>
		<li>Przenieść nowo zamknięte dorosłe samce G0 i dorosłe samice typu dzikiego do świeżej klatki sieciowej i uzyskać stosunek między G0 a typem dzikim w stosunku około 1:1. Podaj im 10% (w/v) roztwór cukru wrzucony do wacików.</li>
		<li>Hodować owady, stosując powyższą rutynową metodę, aż do przepoczwarzenia pierwszego pokolenia (G1).</li>
		<li>Za pomocą dactylethrae przenieś nowo zamkniętą pojedynczą parę dorosłych G1 do plastikowego słoika (13 cm x 12 cm x 12 cm) zaopatrzonego w 10% (w/v) roztwór cukru. Przykryj każdy słoik gazą. Weź w sumie około 50 par dorosłych G1. 
		UWAGA: Ekulzja samic poprzedza elokację męskich ciem. Ogólnie rzecz biorąc, 3-dniowy samiec i 2-dniowa samica są dojrzałe płciowo i gotowe do kopulacji. Nowo zamknięte dorosłe osobniki nie będą kojarzyć się w pierwszym okresie świetlnym bez karmienia.</li>
		<li>Zbierz dorosłe osobniki G1 do plastikowego słoika po złożeniu jaj. Umieść każdą dorosłą w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wykrywanie mutantów nokautujących
<ol>
	<li>Zaprojektuj parę starterów obejmujących przewidywaną obciętą witrynę. Startery powinny być ustawione w odległości co najmniej 50 pz z każdej strony (przed i za miejscem) od miejsca docelowego. 
	UWAGA: Startery do identyfikacji sekwencji docelowej często obejmują duże rozpiętości, aby skutecznie wzmocnić.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu starterów genotypowania z genomem DNA wyekstrahowanym w sekcji 1. Wykonuj cykl PCR w temperaturze 95 °C przez 20 s; 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 20 s, 55 °C przez 20 s, w temperaturze 72 °C przez 1 min; 72 °C przez 5 minut i 4 °C w stanie wstrzymania. Sprawdzić produkt reakcji za pomocą 1% (w/v) żelu agarozowego. Wybrana para starterów detekcyjnych została potwierdzona jakością produktu PCR. Jeśli prążki są wyraźne i specyficzne, startery można wykorzystać do dalszego wykrywania mutantów w oparciu o rozmiar amplikonu.</li>
	<li>Ekran dla potencjalnych edytowanych osób. Ostrożnie usuń tylną nogę za pomocą kleszczy i umieść każdą nogę odpowiednio w probówce z matrycą lizatorową. Oznacz probówkę z matrycą lizy zgodnie z numerem na szklanej liście.</li>
	<li>Homogenizuj tylną nogę za pomocą homogenizatora tkankowego. Ustaw prędkość na 6,0 m/s, a czas na 60 s. Wyodrębnij genomowe DNA z homogenizowanej próbki za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji gDNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Amplifikuj segment genu za pomocą starterów genotypowania z takimi samymi warunkami reakcji PCR, jak opisano w kroku 2. Potwierdź genotyp za pomocą usługi sekwencjonowania genów. Po wykryciu zmutowanych genotypów G1 (docelowych w tym samym miejscu) zawartych w tym samym słoiku, zachowaj potomstwo G1 i zmień jego nazwę na pokolenie drugie (G2).</li>
	<li>Umieść osobniki G1 o tym samym genotypie w jednej klatce siatkowej. Samodzielnie przekrocz progenies G1 i kontynuuj badanie przesiewowe przy użyciu tych samych metod.</li>
	<li>Amplifikuj segment genu i potwierdź genotyp za pomocą tej samej procedury, która została opisana w kroku 2. Uzyskaj linie homozygotyczne G2 i utrzymuj linię mutanta do nokautu.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edited+course+of+biomedical+research%3A+leaping+forward+with+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li>
<li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li>
<li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy%3A+pre-clinical+progress+in+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li>
<li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+genome+editing+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li>
<li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+of+CRISPR+technology+development+and+deployment+into+Agricultural+Production-Consumption+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22World+Patent+Information%22%5BJournal%5D)">Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems.</a> World Patent Information. 60, 101944(2020).</li>
<li>Es, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+the+CRISPR-Cas9+genome+editing+machinery+in+food+and+agricultural+science%3A+Current+status%2C+future+perspectives%2C+and+associated+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges.</a> Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).</li>
<li>Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586(2018).</li>
<li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+platforms+for+genome+editing+in+plants%3A+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li>
<li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+multifaceted+CRISPR%2FCas+gene+editing+tool+for+plant+research%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li>
<li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li>
<li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology%3A+from+prokaryotes+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li>
<li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+insects%3A+Applications%2C+best+practices+and+biosafety+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li>
<li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+genome+editing+with+CRISPR%2FCas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620(2016).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li>
<li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+%28H%C3%BCbner%29%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%3A+implications+for+management%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li>
<li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+cloning%2C+prokaryotic+expression%2C+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H%C3%BCbner+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22(2018).</li>
<li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li>
<li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li>
<li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+a+bitter+taste+receptor+family+in+a+polyphagous+insect+herbivore%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore.</a> Science Reports. 6, 23666(2016).</li>
<li>Gouin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+genomes+of+highly+polyphagous+lepidopteran+pests+%28Spodoptera+frugiperda%2C+Noctuidae%29+with+different+host-plant+ranges%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+validation+of+cadherin+as+a+receptor+of+Bt+toxin+Cry1Ac+in+Helicoverpa+armigera+utilizing+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).</li>
<li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147(2017).</li>
<li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427(2020).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li>
<li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Tobacco+Sciene+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li>
<li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li>
<li>Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+%28H%C3%BCbner%29+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+Based+on+Life+Table+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30(2012).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Zheng, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae%2C+or+puparia%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Applied+Entomology%22%5BJournal%5D)">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21(2018).</li>
<li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+The+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li>
<li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth%2C+Helicoverpa+assulta%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li>
<li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators%3A+ii.+Halisidota+argentata+pack.+%28arctiidae%29%2C+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+%28GEOMETRIDAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Zastosowanie systemu CRISPR/Cas9 zapewniło potężne wsparcie techniczne w zakresie analizy funkcji genów i interakcji między różnymi genami. Szczegółowy protokół, który tutaj prezentujemy, pokazuje wytworzenie mutanta homozygoty u H. armigera poprzez edycję genomu CRISPR/Cas9. Ta niezawodna procedura zapewnia prosty sposób na ukierunkowaną mutagenezę genów u H. armigera.
Wybór miejsc docelowych CRISPR może mieć wpływ na skuteczność mutagenezy37. W tym p...

Zastosowanie technologii edycji genomu dostarcza skutecznego narzędzia do uzyskania mutacji genów docelowych u różnych gatunków. Pojawienie się systemu CRISPR/związanego z białkiem 9 (Cas9) w klastrach, regularnie rozmieszczonych, krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/związanego z nim białka 9 (Cas9) zapewnia nową metodę manipulowania genomami1. System CRISPR/Cas9 składa się z przewodnika RNA (gRNA) i endonukleazy Cas9 2,3, podczas gdy gRNA można dalej podzielić na dwie części, docelową komplementarną CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującą crRNA (tracrRNA). gRNA integruje się z endonukleazą Cas9 i tworzy rybonukleoproteinę (RNP). Dzięki gRNA endonukleaza Cas9 może być kierowana do określonego miejsca genomu poprzez komplementację zasad. Domeny RuvC i HNH Cas9 rozszczepiają docelowe miejsce genomu na trzy zasady przed sekwencją motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) i tworzą pęknięcie dwuniciowe (DSB). Rozszczepienie DNA może być następnie naprawione za pomocą dwóch mechanizmów, niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR)4. Naprawa DSB wprowadza insercje lub delecje jako sposób na dezaktywację docelowego genu, potencjalnie powodując całkowitą utratę funkcji genu. W związku z tym dziedziczność i specyficzność systemu CRISPR/Cas9 sprawiają, że jest to solidna metoda charakteryzowania funkcji genów in vivo i analizy interakcji genów5.
Dzięki licznym zaletom, system CRISPR/Cas9 został zastosowany w różnych dziedzinach, w tym w biomedycynie6,7, terapii genowej8,9, oraz agriculture10,11,12, i był używany w różnych systemach biologicznych, w tym mikroorganizmach13, plants14,15, nicienie16 oraz ssaki17. U bezkręgowców wiele gatunków owadów zostało poddanych edycji genomu CRISPR/Cas9, takich jak muszka owocowa Drosophila melanogaster i nie tylko18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera jest jednym z najbardziej niszczycielskich szkodników na świecie23, i niszczy liczne uprawy, w tym bawełnę, soję i sorgo24,25. Wraz z rozwojem technologii sekwencjonowania, genom H. armigera, jak również genom szeregu gatunków owadów Lepidoptera, został całkowicie zsekwencjonowany26,27,28,29. W ostatnich latach zidentyfikowano i scharakteryzowano dużą liczbę genów oporności i receptorów węchowych u tych owadów19,27,28,29. Niektóre geny związane z opornością zostały zidentyfikowane u H. armigera, takie jak geny kodujące kadherynę30, transporter kasetowy wiążący ATP31,32, a także HaTSPAN133. Nokaut tych genów za pomocą technologii CRISPR/Cas9 skutkuje wysokim poziomem odporności na toksynę Bacillus thuringiensis (BT) u wrażliwych szczepów. Ponadto Chang i in. (2017) znokautowali receptor feromonowy, co potwierdziło jego znaczącą funkcję w regulacji czasu godowego19. Doniesienia te sugerują, że CRISPR/Cas9 może działać jako skuteczne narzędzie do badania funkcji genów in vivo w systemach owadzich. Jednak szczegółowa procedura modyfikacji CRISPR/Cas9 w systemach owadów pozostaje niekompletna, co ogranicza zakres jej zastosowania w genomice funkcjonalnej owadów.
Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania funkcjonalnego genu u H. armigera za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Dostarczony jest szczegółowy protokół krok po kroku, w tym projektowanie i przygotowanie specyficznych dla genów starterów do produkcji gRNA, pobierania zarodków, mikroiniekcji, hodowli owadów i identyfikacji mutantów. Protokół ten służy jako cenne odniesienie do manipulowania dowolnymi funkcjonalnymi genami u H. armigera i może być rozszerzony na inne gatunki Lepidoptera.

<table><tbody><tr><td>2kb drabinka DNA</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM101</td><td></td></tr><tr><td>Szkło kapilarne</td><td>Świat Precision Instrucments</td><td>504949</td><td>określany jako "szkło kapilarne" w protokole</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz Eppendorf FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator Eppendorf InjectMan 4</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>5192000051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader Końcówki do pipet</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>G2835241</td><td></td></tr><tr><td>GeneArt Precyzyjny zestaw do syntezy gRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A29377</td><td></td></tr><tr><td>Żagiel</td><td>do mikroskopu</td> marki <td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus</td><td>Corporation</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS (Premix)</td><td>Takara Biomedical Technology</td><td>R040</td><td>używany do wykrywania mutantów</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw genomicznego DNA TIANamp</td><td>TIANGEN Corporate</td><td>DP304-03</td><td></td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36499</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego helicoverpa armigera z edytowanym genomem crispr/cas9 (hübner)

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

Robak bawełniany, Helicoverpa armigera, jest jednym z najbardziej niszczycielskich szkodników na świecie. Połączenie genetyki molekularnej, fizjologii, genomiki funkcjonalnej i badań behawioralnych sprawiło, że H. armigera stał się gatunkiem modelowym w Lepidoptera Noctuidae. Aby badać funkcje in vivo i interakcje między różnymi genami, technologia edycji genomu z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) / powiązanym białkiem 9 (Cas9) jest wygodną i skuteczną metodą stosowaną do wykonywania funkcjonalnych badań genomicznych. W tym badaniu przedstawiamy systematyczną metodę krok po kroku w celu zakończenia nokautu genu u H. armigera przy użyciu systemu CRISPR/Cas9. Szczegółowo opisano budowę i syntezę przewodnikowego RNA (gRNA). Następnie podsumowano kolejne etapy składające się z projektowania specyficznego dla genu startera do tworzenia przewodnika RNA (gRNA), pobierania zarodków, mikroiniekcji, hodowli owadów i wykrywania mutantów. Na koniec przedstawiono porady i uwagi dotyczące rozwiązywania problemów, aby poprawić wydajność edycji genów. Nasza metoda posłuży jako odniesienie do zastosowania edycji genomu CRISPR/Cas9 u H. armigera, a także innych ciem z rzędu Lepidoptera.

Niniejszy protokół przedstawia szczegółowe etapy otrzymywania linii z nokautem genów u H. armigera z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9. Reprezentatywne wyniki uzyskane zgodnie z tym protokołem zostały podsumowane w zakresie selekcji gDNA, zbierania i mikroiniekcji zarodków, hodowli owadów oraz detekcji mutantów.
W niniejszym badaniu miejsce docelowe badanego genu znajdowało się w jego drugim eksonie (<strong class=...

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Robak bawełniany jest jednym z najbardziej destrukcyjnych szkodników na świecie. Edycja genomu za pomocą technologii CRISPR/Cas9 umożliwia dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami w tym organizmie. Dwie główne zalety tej techniki to to, że ma wysoką specyficzność i jest dziedziczna.Aby wybrać cele sgRNA, przejdź do strony internetowej CRISPR, aby wyszukać możliwe miejsca przewodników i eksony w pobliżu pięciu głównych regionów genu, które nie uległy translacji. Wprowadź sekwencję eksonów w polu tekstowym i wybierz genom docelowy do Helicoverpa armigera. Wybierz opcję PAM dla 20 BPNGG i pozostaw pozostałe ustawienia na parametrach domyślnych, zgodnie z instrukcją obsługi serwisu.Porównaj przewidywane sekwencje przewodników z oprogramowania i wybierz sekwencję prowadzącą składającą się z 20 par zasad zawierających jedną lub dwie guaniny w pobliżu pięciu pierwszych regionów nieulegających translacji o najwyższej przewidywanej wydajności i najmniejszej liczbie niezgodności, aby poprawić wydajność edycji i zmniejszyć edycję poza celem. Do przygotowania zarodków wybierz 50 zdrowych osobników spośród trzydniowych samców i dwudniowych samic i wymieszaj je w czystej klatce siatkowej. Umieść w klatce kawałek wilgotnej bawełny zawierającej 10% roztwór cukru.Przykryj klatki siatkowe gazą i przymocuj gazę gumką. Spryskaj gazę wodą, aby była wilgotna. Pokrój czarną szmatkę na odpowiedni rozmiar i zastąp wilgotną gazę tą czarną szmatką, aby umożliwić swobodne ułożenie jaj przez 30 minut.Wklej taśmę dwustronną na szkiełko mikroskopowe. Za pomocą kleszczy wklej plastry z jajkami w rzędzie na powierzchni taśmy dwustronnej. Naciśnij margines każdej łatki, aby upewnić się, że mocno przylegają do taśmy.Zbierz od 50 do 100 jaj na szkiełko mikroskopowe. Przed mikroiniekcją należy trzymać szkiełko mikroskopowe na lodzie, aby opóźnić rozwój zarodków. Przygotować igłę, pociągając szklankę kapilarną za pomocą ściągacza do mikropipet, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.Zmiel końcówkę igły za pomocą mikro młynka do końcówki o ostrych krawędziach. Przygotuj roztwory do wstrzykiwań, dodając dwa mikrolitry skomercjalizowanego białka Cas9 i sgRNA do wody wolnej od RNace w probówce PCR, aby uzyskać mieszaninę o objętości 10 mikrolitrów. Dobrze wymieszaj pipetując i umieść na lodzie.Ustaw parametry elektronicznego mikrowtryskiwacza. Załaduj dwa mikrolitry mieszaniny do igły za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki, usuwając jak najwięcej powietrza resztkowego z końcówki igły. Podłączyć igłę do wstrzykiwania do mikromanipulatora i zapewnić szczelne połączenie między dwiema częściami.Umieść szkiełko na szalce Petriego i umieść je na stoliku mikroskopu. Ostrożnie wprowadzić końcówkę igły do górnej półkuli zarodka pod kątem 45 stopni. Naciśnij pedał, aby dostarczyć mieszaninę do zarodka, co prowadzi do niewielkiego rozszerzenia zarodka.Natychmiast wycofać igłę z zarodka i przesuwać szalkę Petriego jedną ręką, aż następny zarodek znajdzie się w pobliżu igły. Należy wstrzyknąć co najmniej 300 zarodków przy użyciu tej samej procedury, aby zapewnić wystarczającą ilość wylęgu. Po wstrzyknięciu przykryć pokrywę szalek Petriego.Gdy kolor powierzchni zarodków pociemnieje, umieść sztuczną dietę na szalce Petriego wokół szkiełka mikroskopowego. Przygotuj 24-dołkowe płytki hodowlane i napełnij każdą studzienkę do 1/3 jej objętości sztuczną dietą. Wybierz wykluwające się larwy za pomocą małego pędzla i przenieś je na 24-dołkową płytkę hodowlaną, tak aby w jednej studzience znajdowała się jedna larwa.Kiedy larwy osiągną trzecie stadium rozwojowe, przenieś je do nowej szklanej ciągliwej etry. Przenieś nowo zamknięte dorosłe samce G-zero i dorosłe samice typu dzikiego do świeżej klatki siatkowej w równych proporcjach. Podaj im 10% roztwór cukru wrzucony do wacików.Hoduj owady przy użyciu rutynowych metod aż do przepoczwarzenia G-one. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć tylną nogę i włóż każdą nogę do probówki Lysing Matrix. Homogenizuj tylną nogę za pomocą homogenizatora tkankowego.Wyodrębnij genomowe DNA z homogenizowanej próbki za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji gDNA zgodnie z instrukcjami producenta. Amplifikuj segment genu za pomocą starterów genotypowania i warunków reakcji PCR z rękopisu tekstowego. Potwierdź genotyp za pomocą usługi sekwencjonowania genów.Umieść osobniki G-one o tym samym genotypie w jednej klatce siatkowej, samodzielnie skrzyżuj potomstwo G-one i kontynuuj badania przesiewowe przy użyciu tych samych metod. Docelowe miejsce interesującego genu znajdowało się w jego drugim eksonie. Miejsce to było wysoce konserwatywne, a docelowy fragment pasma syntetyzowanego sgRNA potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.Wykrycie zmutowanego pojedynczego celu sgRNA przeprowadzono poprzez sekwencjonowanie produktów PCR z jednostek rodzicielskich G-one. Wykazano skuteczność stosowania nienakładających się na siebie par sgRNA w różnych eksonach, ponieważ dużą delecję mutantów można było łatwo odróżnić od patelni typu dzikiego. Po uzyskaniu określonej liczby zmutowanych osobników można przeprowadzić eksperymenty elektrofizjologiczne lub behawioralne w celu wyjaśnienia funkcji genów i interakcji między różnymi genami.

embryo-microinjection-knockout-mutant-identification-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ten film opisuje mikroiniekcję, powszechną metodę tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans. W przykładzie zobaczymy mikroiniekcję użytą do wprowadzenia kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) do edycji genów zasad CRISPR.

Mikroiniekcja gonad: metoda dostarczania związków bezpośrednio do linii rozrodczej C. elegans

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.

Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

To badanie dostarcza systematycznie optymalizowanej procedury budowy homozygotycznych mutantów szarańczy opartej na rybonukleazie CRISPR/Cas9, jak również szczegółowej metody kriokonserwacji i resuscytacji jaj szarańczy.

Budowa homozygotycznych mutantów szarańczy wędrownej z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9

Ten artykuł przedstawia krok po kroku protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 orientalnej muszki owocowej Bactrocera dorsalis. Szczegółowe kroki przewidziane w tym ustandaryzowanym protokole posłużą jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much do funkcjonalnych badań genów u B. dorsalis.

Protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 muszki owocowej Bactrocera dorsalis

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Poznaj mikroiniekcję zarodków Helicoverpa armigera i identyfikację mutantów nokautujących przy użyciu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów in vivo w celu rozwoju strategii zwalczania szkodników.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Przeglądaj więcej filmów