Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)
July 1st, 2021
Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.
Robak bawełniany jest jednym z najbardziej destrukcyjnych szkodników na świecie. Edycja genomu za pomocą technologii CRISPR/Cas9 umożliwia dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami w tym organizmie. Dwie główne zalety tej techniki to to, że ma wysoką specyficzność i jest dziedziczna.
Aby wybrać cele sgRNA, przejdź do strony internetowej CRISPR, aby wyszukać możliwe miejsca przewodników i eksony w pobliżu pięciu głównych regionów genu, które nie uległy translacji. Wprowadź sekwencję eksonów w polu tekstowym i wybierz genom docelowy do Helicoverpa armigera. Wybierz opcję PAM dla 20 BPNGG i pozostaw pozostałe ustawienia na parametrach domyślnych, zgodnie z instrukcją obsługi serwisu.
Porównaj przewidywane sekwencje przewodników z oprogramowania i wybierz sekwencję prowadzącą składającą się z 20 par zasad zawierających jedną lub dwie guaniny w pobliżu pięciu pierwszych regionów nieulegających translacji o najwyższej przewidywanej wydajności i najmniejszej liczbie niezgodności, aby poprawić wydajność edycji i zmniejszyć edycję poza celem. Do przygotowania zarodków wybierz 50 zdrowych osobników spośród trzydniowych samców i dwudniowych samic i wymieszaj je w czystej klatce siatkowej. Umieść w klatce kawałek wilgotnej bawełny zawierającej 10% roztwór cukru.
Przykryj klatki siatkowe gazą i przymocuj gazę gumką. Spryskaj gazę wodą, aby była wilgotna. Pokrój czarną szmatkę na odpowiedni rozmiar i zastąp wilgotną gazę tą czarną szmatką, aby umożliwić swobodne ułożenie jaj przez 30 minut.
Wklej taśmę dwustronną na szkiełko mikroskopowe. Za pomocą kleszczy wklej plastry z jajkami w rzędzie na powierzchni taśmy dwustronnej. Naciśnij margines każdej łatki, aby upewnić się, że mocno przylegają do taśmy.
Zbierz od 50 do 100 jaj na szkiełko mikroskopowe. Przed mikroiniekcją należy trzymać szkiełko mikroskopowe na lodzie, aby opóźnić rozwój zarodków. Przygotować igłę, pociągając szklankę kapilarną za pomocą ściągacza do mikropipet, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.
Zmiel końcówkę igły za pomocą mikro młynka do końcówki o ostrych krawędziach. Przygotuj roztwory do wstrzykiwań, dodając dwa mikrolitry skomercjalizowanego białka Cas9 i sgRNA do wody wolnej od RNace w probówce PCR, aby uzyskać mieszaninę o objętości 10 mikrolitrów. Dobrze wymieszaj pipetując i umieść na lodzie.
Ustaw parametry elektronicznego mikrowtryskiwacza. Załaduj dwa mikrolitry mieszaniny do igły za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki, usuwając jak najwięcej powietrza resztkowego z końcówki igły. Podłączyć igłę do wstrzykiwania do mikromanipulatora i zapewnić szczelne połączenie między dwiema częściami.
Umieść szkiełko na szalce Petriego i umieść je na stoliku mikroskopu. Ostrożnie wprowadzić końcówkę igły do górnej półkuli zarodka pod kątem 45 stopni. Naciśnij pedał, aby dostarczyć mieszaninę do zarodka, co prowadzi do niewielkiego rozszerzenia zarodka.
Natychmiast wycofać igłę z zarodka i przesuwać szalkę Petriego jedną ręką, aż następny zarodek znajdzie się w pobliżu igły. Należy wstrzyknąć co najmniej 300 zarodków przy użyciu tej samej procedury, aby zapewnić wystarczającą ilość wylęgu. Po wstrzyknięciu przykryć pokrywę szalek Petriego.
Gdy kolor powierzchni zarodków pociemnieje, umieść sztuczną dietę na szalce Petriego wokół szkiełka mikroskopowego. Przygotuj 24-dołkowe płytki hodowlane i napełnij każdą studzienkę do 1/3 jej objętości sztuczną dietą. Wybierz wykluwające się larwy za pomocą małego pędzla i przenieś je na 24-dołkową płytkę hodowlaną, tak aby w jednej studzience znajdowała się jedna larwa.
Kiedy larwy osiągną trzecie stadium rozwojowe, przenieś je do nowej szklanej ciągliwej etry. Przenieś nowo zamknięte dorosłe samce G-zero i dorosłe samice typu dzikiego do świeżej klatki siatkowej w równych proporcjach. Podaj im 10% roztwór cukru wrzucony do wacików.
Hoduj owady przy użyciu rutynowych metod aż do przepoczwarzenia G-one. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć tylną nogę i włóż każdą nogę do probówki Lysing Matrix. Homogenizuj tylną nogę za pomocą homogenizatora tkankowego.
Wyodrębnij genomowe DNA z homogenizowanej próbki za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji gDNA zgodnie z instrukcjami producenta. Amplifikuj segment genu za pomocą starterów genotypowania i warunków reakcji PCR z rękopisu tekstowego. Potwierdź genotyp za pomocą usługi sekwencjonowania genów.
Umieść osobniki G-one o tym samym genotypie w jednej klatce siatkowej, samodzielnie skrzyżuj potomstwo G-one i kontynuuj badania przesiewowe przy użyciu tych samych metod. Docelowe miejsce interesującego genu znajdowało się w jego drugim eksonie. Miejsce to było wysoce konserwatywne, a docelowy fragment pasma syntetyzowanego sgRNA potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Wykrycie zmutowanego pojedynczego celu sgRNA przeprowadzono poprzez sekwencjonowanie produktów PCR z jednostek rodzicielskich G-one. Wykazano skuteczność stosowania nienakładających się na siebie par sgRNA w różnych eksonach, ponieważ dużą delecję mutantów można było łatwo odróżnić od patelni typu dzikiego. Po uzyskaniu określonej liczby zmutowanych osobników można przeprowadzić eksperymenty elektrofizjologiczne lub behawioralne w celu wyjaśnienia funkcji genów i interakcji między różnymi genami.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół mikroiniekcji zarodków Helicoverpa armigera oraz identyfikacji mutantów knockout za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9. Ta technika umożliwia badania in vivo nad funkcją genów i ich interakcjami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Entomologia
- Edycja genomu
Tło
- Helicoverpa armigera jest istotnym szkodnikiem rolnictwa.
- Technologia CRISPR/Cas9 oferuje wysoką specyficzność i dziedziczalność dla edycji genów.
- Rozumienie interakcji genów jest kluczowe dla zarządzania szkodnikami.
- Techniki mikroiniekcji są niezbędne do tworzenia mutantów knockout.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu mikroiniekcji zarodków.
- Ułatwienie identyfikacji mutantów knockout.
- Poprawa badań nad funkcją genów w Helicoverpa armigera.
Stosowane metody
- Selekcja celów sgRNA za pomocą internetowych narzędzi CRISPR.
- Mikroiniekcja zarodków z komponentami CRISPR/Cas9.
- Selekcja udanych mutantów knockout.
- Analiza funkcji i interakcji genów in vivo.
Główne wyniki
- Udana mikroiniekcja doprowadziła do stworzenia mutantów knockout.
- Zidentyfikowano interakcje genów, które można dalsze badać.
- Wykazano skuteczność CRISPR/Cas9 w Helicoverpa armigera.
- Dostarczono ram dla przyszłych badań genetycznych tego gatunku.
Wnioski
- Protokół umożliwia efektywną edycję genów w Helicoverpa armigera.
- Mutanty knockout są cenne dla zrozumienia funkcji genów.
- To badanie przyczynia się do strategii zarządzania szkodnikami poprzez badania genetyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Helicoverpa armigera enables precise functional interrogation of gene targets in a major agricultural pest, supporting translational research in pest control and resistance mechanisms. The protocol's specificity and heritability facilitate robust target validation and mechanistic de-risking at early discovery stages. This workflow strengthens predictive confidence for gene function studies and informs portfolio decisions in agricultural biotechnology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct knockout of candidate genes to clarify their biological roles in vivo.
- Supports functional target validation by linking genotype to phenotype in a disease-relevant pest model.
- Reduces mechanistic ambiguity by allowing systematic gene disruption and downstream phenotypic analysis.
- Facilitates portfolio triage by providing actionable data on gene essentiality and interaction.
Screening & Assay Development
- Prepares validated mutant lines for downstream behavioral and electrophysiological assays.
- Standardizes knockout generation, improving reproducibility and comparability across experiments.
- Enables quantitative assessment of gene disruption efficiency via PCR and sequencing outputs.
- Supports scalable screening of multiple gene targets using non-overlapping sgRNA pairs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene function studies with translational goals in pest management and resistance research.
- Provides continuity from genetic manipulation to phenotypic validation in a relevant model organism.
- De-risks advancement of gene targets by confirming functional impact prior to field or applied studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification, enabling iterative hypothesis testing and functional validation in H. armigera and related Lepidoptera.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven knockout of target genes and pathway elucidation.
- Screening: Delivers reproducible mutant lines and quantitative genotyping outputs for downstream assays.
- Analytics: Provides PCR and sequencing-based confirmation of gene disruption for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges genetic manipulation with phenotypic and behavioral validation in pest models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genome editing workflow applicable to other Lepidopteran species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing and mutant identification for scalable research.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking genotype to phenotype in a key pest species.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene targets for translational advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo microinjection and molecular genetics workflows.
- Needs access to microinjection equipment, PCR, and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization for mutant screening and genotyping protocols.
- Adaptable to other Lepidopteran models with protocol optimization.
- Efficiency may vary based on sgRNA design and embryo handling, as noted in troubleshooting guidance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:29
Design of Gene-Specific Primers and Preparation of sgRNA and Embryos
2:18
Microinjection of Embryos
3:47
Post-Injection Insect Rearing
4:41
Knock-Out Mutation Detection
5:27
Results: Selection and Synthesis of Target sgRNAs and Detection of Mutants by PCR and Gel Electrophoresis
6:08
Conclusion
