Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)
1 lipca 2021
Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.
Robak bawełniany jest jednym z najbardziej destrukcyjnych szkodników na świecie. Edycja genomu za pomocą technologii CRISPR/Cas9 umożliwia dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami w tym organizmie. Dwie główne zalety tej techniki to to, że ma wysoką specyficzność i jest dziedziczna.
Aby wybrać cele sgRNA, przejdź do strony internetowej CRISPR, aby wyszukać możliwe miejsca przewodników i eksony w pobliżu pięciu głównych regionów genu, które nie uległy translacji. Wprowadź sekwencję eksonów w polu tekstowym i wybierz genom docelowy do Helicoverpa armigera. Wybierz opcję PAM dla 20 BPNGG i pozostaw pozostałe ustawienia na parametrach domyślnych, zgodnie z instrukcją obsługi serwisu.
Porównaj przewidywane sekwencje przewodników z oprogramowania i wybierz sekwencję prowadzącą składającą się z 20 par zasad zawierających jedną lub dwie guaniny w pobliżu pięciu pierwszych regionów nieulegających translacji o najwyższej przewidywanej wydajności i najmniejszej liczbie niezgodności, aby poprawić wydajność edycji i zmniejszyć edycję poza celem. Do przygotowania zarodków wybierz 50 zdrowych osobników spośród trzydniowych samców i dwudniowych samic i wymieszaj je w czystej klatce siatkowej. Umieść w klatce kawałek wilgotnej bawełny zawierającej 10% roztwór cukru.
Przykryj klatki siatkowe gazą i przymocuj gazę gumką. Spryskaj gazę wodą, aby była wilgotna. Pokrój czarną szmatkę na odpowiedni rozmiar i zastąp wilgotną gazę tą czarną szmatką, aby umożliwić swobodne ułożenie jaj przez 30 minut.
Wklej taśmę dwustronną na szkiełko mikroskopowe. Za pomocą kleszczy wklej plastry z jajkami w rzędzie na powierzchni taśmy dwustronnej. Naciśnij margines każdej łatki, aby upewnić się, że mocno przylegają do taśmy.
Zbierz od 50 do 100 jaj na szkiełko mikroskopowe. Przed mikroiniekcją należy trzymać szkiełko mikroskopowe na lodzie, aby opóźnić rozwój zarodków. Przygotować igłę, pociągając szklankę kapilarną za pomocą ściągacza do mikropipet, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.
Zmiel końcówkę igły za pomocą mikro młynka do końcówki o ostrych krawędziach. Przygotuj roztwory do wstrzykiwań, dodając dwa mikrolitry skomercjalizowanego białka Cas9 i sgRNA do wody wolnej od RNace w probówce PCR, aby uzyskać mieszaninę o objętości 10 mikrolitrów. Dobrze wymieszaj pipetując i umieść na lodzie.
Ustaw parametry elektronicznego mikrowtryskiwacza. Załaduj dwa mikrolitry mieszaniny do igły za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki, usuwając jak najwięcej powietrza resztkowego z końcówki igły. Podłączyć igłę do wstrzykiwania do mikromanipulatora i zapewnić szczelne połączenie między dwiema częściami.
Umieść szkiełko na szalce Petriego i umieść je na stoliku mikroskopu. Ostrożnie wprowadzić końcówkę igły do górnej półkuli zarodka pod kątem 45 stopni. Naciśnij pedał, aby dostarczyć mieszaninę do zarodka, co prowadzi do niewielkiego rozszerzenia zarodka.
Natychmiast wycofać igłę z zarodka i przesuwać szalkę Petriego jedną ręką, aż następny zarodek znajdzie się w pobliżu igły. Należy wstrzyknąć co najmniej 300 zarodków przy użyciu tej samej procedury, aby zapewnić wystarczającą ilość wylęgu. Po wstrzyknięciu przykryć pokrywę szalek Petriego.
Gdy kolor powierzchni zarodków pociemnieje, umieść sztuczną dietę na szalce Petriego wokół szkiełka mikroskopowego. Przygotuj 24-dołkowe płytki hodowlane i napełnij każdą studzienkę do 1/3 jej objętości sztuczną dietą. Wybierz wykluwające się larwy za pomocą małego pędzla i przenieś je na 24-dołkową płytkę hodowlaną, tak aby w jednej studzience znajdowała się jedna larwa.
Kiedy larwy osiągną trzecie stadium rozwojowe, przenieś je do nowej szklanej ciągliwej etry. Przenieś nowo zamknięte dorosłe samce G-zero i dorosłe samice typu dzikiego do świeżej klatki siatkowej w równych proporcjach. Podaj im 10% roztwór cukru wrzucony do wacików.
Hoduj owady przy użyciu rutynowych metod aż do przepoczwarzenia G-one. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć tylną nogę i włóż każdą nogę do probówki Lysing Matrix. Homogenizuj tylną nogę za pomocą homogenizatora tkankowego.
Wyodrębnij genomowe DNA z homogenizowanej próbki za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji gDNA zgodnie z instrukcjami producenta. Amplifikuj segment genu za pomocą starterów genotypowania i warunków reakcji PCR z rękopisu tekstowego. Potwierdź genotyp za pomocą usługi sekwencjonowania genów.
Umieść osobniki G-one o tym samym genotypie w jednej klatce siatkowej, samodzielnie skrzyżuj potomstwo G-one i kontynuuj badania przesiewowe przy użyciu tych samych metod. Docelowe miejsce interesującego genu znajdowało się w jego drugim eksonie. Miejsce to było wysoce konserwatywne, a docelowy fragment pasma syntetyzowanego sgRNA potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Wykrycie zmutowanego pojedynczego celu sgRNA przeprowadzono poprzez sekwencjonowanie produktów PCR z jednostek rodzicielskich G-one. Wykazano skuteczność stosowania nienakładających się na siebie par sgRNA w różnych eksonach, ponieważ dużą delecję mutantów można było łatwo odróżnić od patelni typu dzikiego. Po uzyskaniu określonej liczby zmutowanych osobników można przeprowadzić eksperymenty elektrofizjologiczne lub behawioralne w celu wyjaśnienia funkcji genów i interakcji między różnymi genami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół mikroiniekcji embrionów Helicoverpa armigera oraz identyfikacji mutantów z knockoutem przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9. Technika ta umożliwia prowadzenie badań in vivo nad funkcją i interakcjami genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Entomologia
- Edycja genomu
Wstęp
- Helicoverpa armigera jest znaczącym szkodnikiem rolniczym.
- Technologia CRISPR/Cas9 oferuje wysoką specyficzność i dziedziczność w edycji genów.
- Zrozumienie interakcji genowych ma kluczowe znaczenie dla zwalczania szkodników.
- Techniki mikroiniekcji są niezbędne do tworzenia mutantów z nokautem genów.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu mikrowstrzykiwania do embrionów.
- Ułatwienie identyfikacji mutantów z nokautem genowym.
- Wzmocnienie badań nad funkcją genów u Helicoverpa armigera.
Zastosowane metody
- Wybór celów sgRNA przy użyciu internetowych narzędzi CRISPR.
- Mikroiniekcja komponentów CRISPR/Cas9 do embrionów.
- Przesiewanie w celu wyłonienia mutantów z udanym knockoutem.
- Analiza funkcji genów i ich oddziaływań in vivo.
Główne wyniki
- Pomyślna mikroiniekcja doprowadziła do stworzenia mutantów typu knockout.
- Zidentyfikowano interakcje genowe, które mogą zostać poddane dalszym badaniom.
- Wykazano skuteczność CRISPR/Cas9 u Helicoverpa armigera.
- Stworzono podstawy dla przyszłych badań genetycznych nad tym gatunkiem.
Wnioski
- Protokół umożliwia efektywną edycję genów u Helicoverpa armigera.
- Mutanty z nokautem genów są cenne dla zrozumienia funkcji genów.
- Niniejsze badanie przyczynia się do opracowania strategii zwalczania szkodników poprzez badania genetyczne.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Edycja genomu za pomocą systemu CRISPR/Cas9 u Helicoverpa armigera umożliwia precyzyjną analizę funkcjonalną genów docelowych u głównego szkodnika rolniczego, co wspiera badania translacyjne w zakresie zwalczania szkodników i mechanizmów odporności. Specyficzność i dziedziczność tej procedury ułatwiają rzetelną walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego na wczesnych etapach odkrywania. Ten schemat pracy zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad funkcją genów i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych w badaniach i rozwoju biotechnologii rolniczej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośredni knockout genów kandydackich w celu wyjaśnienia ich roli biologicznej in vivo.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie genotypu z fenotypem w modelu szkodnika istotnym dla danej choroby.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną, umożliwiając systematyczną dysrupcję genów oraz analizę fenotypową produktów końcowych.
- Ułatwia selekcję portfolio dzięki dostarczeniu praktycznych danych na temat niezbędności genów i ich oddziaływań.
Przesiewy i opracowanie testów
- Służy do przygotowania zwalidowanych linii mutantów do późniejszych analiz behawioralnych i elektrofizjologicznych.
- Standaryzuje proces generowania nokautów, co poprawia powtarzalność i porównywalność wyników między eksperymentami.
- Umożliwia ilościową ocenę efektywności przerwania genu na podstawie wyników PCR i sekwencjonowania.
- Wspiera skalowalny screening wielu celów genowych z wykorzystaniem niezakładających się par sgRNA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie badań nad funkcją genów z celami translacyjnymi w zakresie zwalczania szkodników i badań nad odpornością.
- Zapewnia ciągłość procesu od manipulacji genetycznej do walidacji fenotypowej w odpowiednim organizmie modelowym.
- Minimalizuje ryzyko związane z opracowywaniem celów genowych poprzez potwierdzenie ich wpływu funkcjonalnego przed rozpoczęciem badań polowych lub aplikacyjnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół integruje etapy od wczesnych odkryć po identyfikację wiodących kandydatów, umożliwiając iteracyjne testowanie hipotez i walidację funkcjonalną u H. armigera oraz pokrewnych Lepidoptera.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ukierunkowane na hipotezę wyciszanie genów docelowych oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne linie mutantów oraz ilościowe wyniki genotypowania do dalszych analiz.
- Analityka: Zapewnia potwierdzenie przerwania genu za pomocą PCR i sekwencjonowania w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy manipulacje genetyczne z walidacją fenotypową i behawioralną w modelach szkodników.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny proces edycji genomu, który można zastosować u innych gatunków Lepidoptera.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie funkcji genów i walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje edycję genomu i identyfikację mutantów w celu skalowania badań.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji go/no-go poprzez powiązanie genotypu z fenotypem u kluczowego gatunku szkodnika.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów genowych z uwzględnieniem ryzyka w celu postępów w badaniach translacyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikroiniekcjach zarodków oraz w procedurach genetyki molekularnej.
- Wymaga dostępu do sprzętu do mikroiniekcji, PCR oraz infrastruktury sekwencyjnej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie protokołów przesiewania mutantów i genotypowania.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do innych modeli z rzędu Lepidoptera po optymalizacji protokołu.
- Wydajność może się różnić w zależności od projektu sgRNA oraz sposobu obchodzenia się z zarodkami, zgodnie z uwagami w przewodniku rozwiązywania problemów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:29
Design of Gene-Specific Primers and Preparation of sgRNA and Embryos
2:18
Microinjection of Embryos
3:47
Post-Injection Insect Rearing
4:41
Knock-Out Mutation Detection
5:27
Results: Selection and Synthesis of Target sgRNAs and Detection of Mutants by PCR and Gel Electrophoresis
6:08
Conclusion
