Name: Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę regulacji aktywności polimerazy T7 RNA przy użyciu sztucznych czynników transkrypcyjnych kwasów nukleinowych. Technika ta umożliwia programowalną transkrypcję in vitro i obliczenia molekularne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.Y.T.C dziękuje za hojne wsparcie od New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant oraz University of Toronto's Medicine by Design Initiative, która otrzymuje fundusze z Canada First Research Excellence Fund (CFREF).

<ol><li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li>
<li>Chen, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li>
<li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Gene+Networks%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li>
<li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing%3A+advances+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Computing%22%5BJournal%5D)">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li>
<li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li>
<li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Synthetic+Promoters%22%5BJournal%5D)">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li>
<li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing%3A+A+multiobjective+evolutionary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Soft+Computing%22%5BJournal%5D)">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li>
<li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands%3A+enhanced+models%2C+scalability%2C+and+speed%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li>
<li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+costs%3A+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.gov%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li>
<li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li>
<li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981(2020).</li>
<li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+DNA+to+power+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Programming+and+Evolvable+Machines%22%5BJournal%5D)">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li>
<li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li>
<li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324(2014).</li>
<li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handhold-mediated+strand+displacement%3A+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genetic+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li>
<li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li>
<li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li>
<li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607(2008).</li>
<li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li>
<li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2.8+%C3%85+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).</li>
<li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li>
<li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li>
<li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li>
<li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+elongation%2C+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li>
<li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li>
<li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortase-tag+expressed+protein+ligation%3A+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li>
<li>Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów finansowych, które mógłby zadeklarować.

Badanie to demonstruje inspirowane nanotechnologią DNA podejście do kontrolowania aktywności polimerazy RNA T7 poprzez kowalencyjne sprzężenie N-końcowego rekombinowanego RNAP T7 znakowanego SNAP z oligonukleotydem funkcjonalizowanym BG, który następnie wykorzystano do programowania reakcji TMDSD. Zgodnie z projektem, znacznik SNAP został umieszczony na N-końcu polimerazy, ponieważ C-koniec dzikiego T7 RNAP jest zakopany w rdzeniu struktury białkowej i nawiązuje ważne kontakty z matrycą DNA28. Wcz...

Obliczenia oparte na DNA wykorzystują zestaw zaprojektowanych oligonukleotydów jako ośrodek obliczeniowy. Oligonukleotydy te są programowane za pomocą sekwencji umożliwiających ich dynamiczne składanie zgodnie z określoną przez użytkownika logiką oraz reagowanie na specyficzne sygnały wejściowe w postaci kwasów nukleinowych. W badaniach typu proof-of-concept wynik obliczeń zazwyczaj składa się z zestawu znakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów, które można wykryć za pomocą elektroforezy żelowej lub fluorometrycznych czytników płytek. W ciągu ostatnich 30 lat zademonstrowano coraz bardziej złożone obwody obliczeniowe DNA, takie jak różnorodne kaskady logiki cyfrowej, sieci reakcji chemicznych oraz sieci neuronowe1,2,3. Aby wspomóc przygotowanie tych obwodów DNA, wykorzystano modele matematyczne do przewidywania funkcjonalności syntetycznych obwodów genowych4,5, a także opracowano narzędzia obliczeniowe do projektowania ortogonalnych sekwencji DNA6,7,8,9,10. W porównaniu z komputerami krzemowymi, zalety komputerów DNA obejmują ich zdolność do bezpośredniego oddziaływania z biomolekułami, pracę w roztworze bez konieczności zasilania oraz ogólną kompaktowość i stabilność. Wraz z pojawieniem się sekwencjonowania następnej generacji, koszt syntezy komputerów DNA w ciągu ostatnich dwóch dekad spadał w tempie szybszym niż przewiduje prawo Moore'a11. Obecnie zaczynają pojawiać się zastosowania takich komputerów opartych na DNA, na przykład w diagnostyce chorób12,13, w biofizyce molekularnej14, a także jako platformy do przechowywania danych15.
<img alt="Schemat rekombinacji DNA z drogami crossing-over, przedstawiający wymianę i reorganizację genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Mechanizm przemieszczania nici DNA zapośredniczonego przez toehold. Toehold, δ, to wolna, niezwiązana sekwencja w częściowym duplexie. Po wprowadzeniu komplementarnej domeny (δ*) na drugiej nici, wolna domena δ służy jako punkt zaczepienia (toehold) do hybrydyzacji, co pozwala pozostałej części nici (ɑ*) powoli wypierać konkurenta poprzez odwracalną reakcję zapinania/rozpinania, znaną jako migracja nici. Wraz ze wzrostem długości δ, ΔG dla reakcji w kierunku prawym maleje, a przemieszczanie zachodzi łatwiej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Do dziś większość komputerów DNA wykorzystuje ugruntowany w dziedzinie dynamicznej nanotechnologii DNA motyw znany jako przemieszczanie nici DNA zapośredniczone przez tzw. toehold (TMDSD, Rysunek 1)16. Motyw ten składa się z częściowo dwuniciowego dupleksu DNA (dsDNA) z krótkimi nawisami typu „toehold” (np. od 7 do 10 nukleotydów (nt)). Nitki „wejściowe” kwasów nukleinowych mogą oddziaływać z częściowymi dupleksami poprzez toehold. Prowadzi to do wyparcia jednej z nici z częściowego dupleksu, a uwolniona w ten sposób nić może następnie służyć jako sygnał wejściowy dla kolejnych częściowych dupleksów. W ten sposób TMDSD umożliwia kaskadowanie sygnałów i przetwarzanie informacji. W teorii ortogonalne motywy TMDSD mogą działać niezależnie w roztworze, co pozwala na równoległe przetwarzanie informacji. Opracowano szereg wariantów reakcji TMDSD, takich jak wymiana nici DNA zapośredniczona przez toehold (TMDSE)17, „szczelne” (leakless) toeholdy z domenami o podwójnej długości18, toeholdy z niedopasowaniami sekwencji19 oraz przemieszczanie nici zapośredniczone przez tzw. „handhold”20. Te innowacyjne zasady projektowania pozwalają na dokładniejsze dostrojenie energetyki i dynamiki TMDSD w celu poprawy wydajności obliczeń DNA.
Syntetyczne obwody genowe, takie jak transkrypcyjne obwody genowe, są również zdolne do przeprowadzania operacji obliczeniowych21,22,23. Obwody te są regulowane przez białkowe czynniki transkrypcyjne, które aktywują lub represują transkrypcję genu poprzez wiązanie się ze specyficznymi regulatorowymi elementami DNA. W porównaniu do obwodów opartych na DNA, obwody transkrypcyjne mają kilka zalet. Po pierwsze, transkrypcja enzymatyczna charakteryzuje się znacznie wyższą liczbą cykli niż istniejące katalityczne obwody DNA, co pozwala na generowanie większej liczby kopii produktu na jedną kopię wejścia i zapewnia bardziej wydajny sposób amplifikacji sygnału. Ponadto obwody transkrypcyjne mogą w ramach wyników obliczeń wytwarzać różne cząsteczki funkcjonalne, takie jak aptamery lub matrycowy RNA (mRNA) kodujący białka terapeutyczne, co można wykorzystać w różnych zastosowaniach. Jednak głównym ograniczeniem obecnych obwodów transkrypcyjnych jest brak ich skalowalności. Wynika to z faktu, że zbiór ortogonalnych białkowych czynników transkrypcyjnych jest bardzo ograniczony, a projektowanie de novo nowych białkowych czynników transkrypcyjnych pozostaje wyzwaniem technicznym i jest czasochłonne.
<img alt="Schemat edycji genów z T7 RNAP, SNAP-tagiem, oddziaływaniem DNA i procesem transkrypcji RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Abstrakcja i mechanizm kompleksu polimerazy typu „uwięź” (tether) i „klatka” (cage). (A i B) Oligonukleotydowa uwięź zostaje enzymatycznie przyłączona do polimerazy T7 poprzez reakcję SNAP-tag. Klatka składająca się z „pozornego” promotora T7 z nawisową sekwencją komplementarną do uwięzi umożliwia hybrydyzację z uwięzią i blokowanie aktywności transkrypcyjnej. (C) W obecności operatora (a*b*) wiąże się on z punktem dostępu (toehold) na oligonukleotydowej uwięzi (ab) i wypiera region b* klatki, umożliwiając przeprowadzenie transkrypcji. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Chou i Shih27. Skróty: RNAP = polimeraza RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Niniejsza praca przedstawia nowy moduł dla obliczeń molekularnych, który łączy funkcjonalność obwodów transkrypcyjnych ze skalowalnością obwodów opartych na DNA. Moduł ten stanowi polimerazę T7 RNAP kowalencyjnie połączoną z jednoniciową kotwicą DNA (Ryc. 2A). Aby zsyntetyzować T7 RNAP z kotwicą DNA, polimerazę połączono z N-terminalnym SNAP-tagiem24 i wyeksponowano rekombinacyjnie w Escherichia coli. Następnie SNAP-tag poddano reakcji z oligonukleotydem funkcjonalizowanym substratem BG. Kotwica oligonukleotydowa umożliwia pozycjonowanie gości molekularnych w bliskim sąsiedztwie polimerazy poprzez hybrydyzację DNA. Jednym z takich gości był konkurencyjny bloker transkrypcyjny nazwany „klatką”, która składa się z „pozornego” dupleksu DNA promotora T7 bez genów w regionie downstream (Ryc. 2B). Po związaniu z RNAP za pomocą kotwicy oligonukleotydowej, klatka hamuje aktywność polimerazy, konkurując z innymi matrycami DNA o wiązanie z RNAP, co wprowadza RNAP w stan „OFF” (Ryc. 2C).
Aby aktywować polimerazę do stanu „WŁĄCZENIE” (ON), zaprojektowano matryce DNA T7 z jednoniciowymi domenami „operatorowymi” powyżej promotora T7 genu. Domenę operatorową (tj. domenę a*b* Rysunek 2C) można zaprojektować tak, aby wypierała klatkę z RNAP poprzez TMDSD i pozycjonowała RNAP blisko promotora T7 genu, inicjując tym samym transkrypcję. Alternatywnie zaprojektowano również matryce DNA, w których sekwencja operatorowa była komplementarna do pomocniczych nici kwasów nukleinowych, nazywanych „sztucznymi czynnikami transkrypcyjnymi” (tj. nici TFA i TFB na Rysunku 3A). Po wprowadzeniu obu nici do reakcji, zmontują się one w miejscu operatorowym, tworząc nową domenę pseudociągłą a*b*. Domena ta może następnie wypierać klatkę poprzez TMDSD, aby zainicjować transkrypcję (Rysunek 3B). Nicie te mogą być dostarczone egzogennie lub wytworzone.
<img alt="Schemat regulacji genów; czynniki transkrypcyjne TF&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt;, TF&lt;sub&gt;B&lt;/sub&gt;; wiązanie polimerazy RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Selektywne programowanie aktywności polimerazy poprzez trójskładnikowy aktywator przełączający. (A) W obecności czynników transkrypcyjnych (TFA i TFB) wiążą się one z domeną operatorową powyżej promotora, tworząc pseudojednoniciową sekwencję (a*b*) zdolną do przemieszczenia klatki poprzez przesunięcie nici DNA zapośredniczone przez toehold. (B) Ta domena a*b* może przemieścić klatkę za pomocą TMDSD, aby zainicjować transkrypcję. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Chou i Shih27. Skróty: TF = czynnik transkrypcyjny; RNAP = polimeraza RNA; TMDSD = przesunięcie nici DNA zapośredniczone przez toehold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wykorzystanie czynników transkrypcyjnych opartych na kwasach nukleinowych do regulacji transkrypcji in vitro umożliwia skalowalną implementację złożonych zachowań obwodów, takich jak logika cyfrowa, sprzężenie zwrotne i kaskadowanie sygnałów. Na przykład można budować kaskady bramek logicznych, projektując sekwencje kwasów nukleinianych w taki sposób, aby transkrypty z genu nadrzędnego aktywowały gen podrzędny. Jednym z zastosowań wykorzystujących kaskadowanie i multipleksowanie możliwe dzięki proponowanej technologii jest opracowanie bardziej zaawansowanych obwodów obliczeń molekularnych dla diagnostyki przenośnej oraz przetwarzania danych molekularnych. Ponadto integracja obliczeń molekularnych z możliwościami syntezy RNA de novo może umożliwić nowe zastosowania. Na przykład można zaprojektować obwód molekularny wykrywający jeden lub kombinację zdefiniowanych przez użytkownika RNA jako wejścia, a w odpowiedzi generujący terapeutyczne RNA lub mRNA kodujące funkcjonalne peptydy lub białka do zastosowań medycznych w punkcie opieki nad pacjentem (point-of-care).

<table><tbody><tr><td>0,5% polisorbat 20 (TWEEN 20)</td><td>BioShop</td><td>TWN510.5</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Bio Basic</td><td>SD8135</td><td></td></tr><tr><td>10 mM bufor fosforanowo-sodowy (pH 7)</td><td>Bio Basic</td><td>PD0435</td><td>Tabletki używane do produkcji 10 mM buforu</td></tr><tr><td>10% nadsiarczanu amonu (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Amicon Ultra-15 Odśrodkowy Jednostka filtrująca</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>100% aceton</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18P4</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol (EtOH)</td><td>Marka własna</td><td>39752-P016-EAAN</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor do transkrypcji in vitro (IVT) New</td><td>England Biolabs</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor Tris-Boran-EDTA (TBE)</td><td>Bio Basic</td><td>A0026</td><td></td></tr><tr><td>1M Izopropyl &beta;- d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5502-1G</td><td></td></tr><tr><td>1M bufor wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><tr><td>1X Bufor Tris-EDTA (TE)</td><td>ThermoFisher</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>2M imidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56750-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>3M octan sodu</td><td>Bio Basic</td><td>SRB1611</td><td></td></tr><tr><td>40% akryloamid (19:1)</td><td>Bio Basic</td><td>A00062</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS bufor do ładowania próbki białka</td><td>Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>5M chlorek sodu (NaCl)</td><td>Bio Basic</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>5mM ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>6x barwnik ładujący żel</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>agaroza B w proszku</td><td>Bio Basic</td><td>AB0014</td><td></td></tr><tr><td>BG-GLA-NHS</td><td>New England Biolabs</td><td>S9151S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 kompetentny E. coli</td><td>Addgene</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>BLUeye wstępnie barwiona drabinka białkowa</td><td>FroggaBio</td><td>PM007-0500</td><td></td></tr><tr><td>błękit bromofenolowy</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td><td>ThermoFisher</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>barwnik cyjaninowy (barwnik żelowy kwasu nukleinowego SYBR Gold)</td>Barwnik cyjaninowy <td>Fisher</td><td>Scientific S11494</td><td></td></tr><tr><td>(SYBR Safe Barwnik żelowy kwasu nukleinowego)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>suchy dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>formamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Bio Basic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>siarczan kanamycyny</td><td>BioShop</td><td>KAN201.5</td><td></td></tr><tr><td>bulion lizogeniczny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2542-500ML</td><td></td></tr><tr><td>zielony szczawian malachitu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2437-29-8</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N'N'-Tetrametyloetano-1,2-diamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS bufor do biegania (20x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>LSNP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1,0 mm 12-dołkowy</td><td></td> oligonukleotyd Life <td>NP0322BOX</td><td></td>Technologies</tr><tr><td>(antysens klatkowy)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td></tr><tr><td>oligonukleotyd ( sens klatki)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA</td></tr><tr><td>oligonukleotyd (malachitowo-zielony antysens aptamerowy)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td></tr><tr><td>oligonukleotyd (malachit green aptamer sense)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT Oligonukleotyd AACGAATGGATCC</td></tr><tr><td>(czynnik transkrypcyjny A)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td></tr><tr><td>oligonukleotyd (czynnik transkrypcyjny B)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA </td></tr><tr><td>Oligonukleotyd TGGAACTG z 3' Modyfikacja amin (tether)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/</td></tr><tr><td>Pierce silne kolumny spinowe wymiany jonowej</td><td>Fisher Scientific</td><td>90008</td><td></td></tr><tr><td>kodowanie plazmidu SNAP T7 Geny oporności na RNAP i kanamycynę</td><td>Genscript</td><td>N/A</td><td>niestandardowa kolumna oczyszczająca białko z wkładką genową</td></tr><tr><td>(kolumna spinowa HisPur Ni-NTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>88226</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka rNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roche mini szybka kolumna wirująca DNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA Ultra Low Range</td><td>Fisher Scientific</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>mocznik</td><td>BioShop</td><td>URE001.1</td><td></td></tr></tbody></table>

polimeraza rna na uwięzi dna do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

Nanotechnologia DNA umożliwia programowalne samoorganizowanie kwasów nukleinowych w określone przez użytkownika kształty i dynamikę dla różnych zastosowań. Prace te pokazują, że koncepcje nanotechnologii DNA można wykorzystać do programowania aktywności enzymatycznej polimerazy T7 RNA (RNAP) pochodzącej z fagów i budowania skalowalnych sieci regulacyjnych genów syntetycznych. Po pierwsze, RNAP T7 na uwięzi oligonukleotydowej jest modyfikowany poprzez ekspresję N-końcowego RNAP znakowanego SNAP, a następnie chemiczne sprzężenie znacznika SNAP z oligonukleotydem modyfikowanym benzylguaniną (BG). Następnie przemieszczenie nici kwasu nukleinowego służy do programowania transkrypcji polimerazy na żądanie. Ponadto pomocnicze zespoły kwasów nukleinowych mogą być wykorzystywane jako "sztuczne czynniki transkrypcyjne" do regulowania interakcji między zaprogramowanym przez DNA T7 RNAP a jego matrycami DNA. Ten mechanizm regulacyjny transkrypcji in vitro może implementować różne zachowania obwodów, takie jak logika cyfrowa, sprzężenie zwrotne, kaskadowanie i multipleksowanie. Komponowalność tej architektury regulacyjnej genów ułatwia abstrakcję projektową, standaryzację i skalowanie. Cechy te umożliwią szybkie prototypowanie urządzeń genetycznych in vitro do zastosowań takich jak biodetekcja, wykrywanie chorób i przechowywanie danych.

<img alt="Analiza białek na żelu elektroforetycznym i wykres badania fluorescencyjnego przedstawiający wynik ekspresji SNAP T7 RNAP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Analiza SDS-PAGE ekspresji SNAP T7 RNAP i badanie transkrypcji in vitro. (A) Analiza oczyszczania białka SNAP T7 RNAP, masa cząsteczkowa SNAP T7 RNAP: 119,4 kDa. F...

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Proponujemy metodę regulacji aktywności polimerazy z wykorzystaniem sztucznych czynników transkrypcyjnych kwasów nukleinowych. Ta architektura regulacji genów może służyć jako element składowy dla przyszłych urządzeń genetycznych in vitro. Poprzez wiązanie domeny wiążącej DNA z polimerazą RNA T7, technika ta łączy skalowalność obwodów opartych na DNA z funkcjonalnością obwodów transkrypcyjnych.Rozpocznij od wykonania dziewięciu rozcieńczeń jednoniciowego oligonukleotydu BG do końcowej objętości 50 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody, w proporcjach od pięciu do jednego do jednego do pięciu, jak wskazano w tabeli. Przygotować jedną mieszaninę reakcyjną dla każdego rozcieńczenia, mieszając dwa mikrolitry buforu SNAP z czterema mikrolitrami oligonukleotydu BG i czterema mikrolitrami SNAP T7 RNAP. Przygotować kontrolę RNAP, zastępując oligonukleotyd wodą podwójnie destylowaną, a kontrolę DNA, zastępując RNAP SNAP T7 wodą podwójnie destylowaną.Ustaw 11 reakcji, dodając dwa mikrolitry każdej próbki do czterech mikrolitrów buforu SNAP i dwóch mikrolitrów barwnika ładującego białko na próbkę. Podgrzewaj reakcje przez 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza, a następnie załaduj dwa mikrolitry każdej próbki na 4 do 12% szklistego żelu białkowego na 35 minut elektroforezy żelowej na lodzie o napięciu 200 woltów. Pod koniec cyklu przemyj żel trzema wymianami wody na shakerze przez co najmniej 10 minut na pranie, a następnie wytnij kwasem nukleinowym barwnikiem cyjaninowym przez 15 minut.Zobrazuj żel w odpowiednim systemie obrazowania żelu i ponownie zabarwij żel 20 mililitrami niebieskiego Coomassie. Po godzinie odbarwiaj wodą podwójnie destylowaną przez co najmniej godzinę przed ponownym obrazowaniem żelu. W przypadku oczyszczania SNAP T7 na uwięzi oligonukleotydowej, najpierw należy przygotować bufor elucyjny, mieszając 50 mikrolitrów jednego śladu molowego ze 100 mikrolitrami pięciomolowego chlorku sodu z 850 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody.Następnie umieścić jedną kolumnę jonowymienną na próbkę w pojedynczych dwumililitrowych probówkach wirówkowych i przemyć kolumny buforem oczyszczającym przez odwirowanie, aż cały bufor zostanie wyeluowany z każdej kolumny. Rozcieńczyć każdą próbkę buforem oczyszczającym w stosunku trzy do jednego buforu oczyszczającego do próbki i załadować 400 mikrolitrów próbki do każdej kolumny. Gdy cały bufor zostanie wymyty, jak pokazano, zebrać i oznaczyć przepływ dla każdej próbki.Przemyć kolumny trzykrotnie 400 mikrolitrami buforu oczyszczającego na przemycie, aż cały bufor zostanie wymyty na płukanie, zbierając i etykietując przepływy, jeśli to konieczne. Po ostatnim płukaniu zebrać wymyte białko, dodając 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do środka kolumny i trzykrotnie odwirowując kolumnę, aż wszystkie 50 mikrolitrów buforu zostanie wymyte. Zebrać i oznaczyć elucję po każdym wirowaniu, zbierając elucję w jednej probówce po ostatnim odwirowaniu, pozostawiając niewielką objętość każdej elucji do analizy żelu.Zmierzyć absorbancję pozostałych podwielokrotności elucji przy 260 i 280 nanometrach i dodać glicerol do próbek w stosunku jeden do jednego przez przechowywanie w temperaturze minus 20 stopni do czasu ich użycia. Użyj 500 mikrolitrów 30 kilodaltonowych filtrów odśrodkowych do buforowej wymiany całkowitego produktu elucji z 2x buforem magazynującym. I zmierz absorbancję, jak pokazano.Następnie dodaj glicerol do produktu w stosunku jeden do jednego do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby ocenić elumy za pomocą SDS-PAGE, należy umieścić próbki w odpowiedniej drabince białkowej na żelu szklistym od czterech do 12% przez 35 minut przy napięciu 200 woltów lub do momentu, gdy czoło barwnika przesunie się na koniec żelu. Aby zademonstrować aktywność kontrolną na żądanie RNAP na uwięzi, zmieszaj 2,4 mikrolitra każdej matrycy z pięcioma mikrolitrami 5-krotnego buforu do wyżarzania i 14,2 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody.Inkubuj powstały jednomikromolowy dwuniciowy DNA CAGE w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez dwie minuty. I wyżarzać szczepy zmysłowe i antysensowne matrycy DNA promotora i malachitu zielonego aptameru w taki sam sposób, jak wskazano w tabeli. Pod koniec inkubacji dodać na uwięzi SNAP T7 RNAP do dwuniciowego DNA CAGE w stosunku od jednego do pięciu molowych do końcowego stężenia 500 nanomolowych RNAP.Po 15 minutach w temperaturze pokojowej umieścić próbkę na lodzie i zmieszać 2,5 mikrolitra 10x buforu transkrypcyjnego in vitro z jednym mikrolitrem 25-milimolowego trifosforanu rybonukleozydu, jednym mikrolitrem jednego milimolowego zielonego malachitu, 2,5 mikrolitra mieszaniny RNAP CAGE, 2,5 mikrolitra każdy z nici oligonukleotydów mikromolowych czynników transkrypcyjnych A i B, i trzy mikrolitry jednej milimolowej matrycy zielonego aptameru malachitowego w 10 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. W 15 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody należy przeprowadzić drugą reakcję zawierającą 2,5 mikrolitra 10-krotnego buforu transkrypcyjnego in vitro, jeden mikrolitr 25-milimolowej mieszaniny trifosforanu rybonukleozydu, jeden mikrolitr jednej milimolowej zieleni malachitowej, 2,5 mikrolitra mieszaniny RNAP CAGE i trzy mikrolitry jednej milimolowej matrycy zielonego aptameru malachitowego. Aby przygotować reakcję zawierającą tylko bufor, wymieszaj 2,5 mikrolitra 10-krotnego buforu transkrypcyjnego in vitro, jeden mikrolitr 25-milimolowej mieszanki trifosforanu rybonukleozydu, jeden mikrolitr jednej milimolowej zieleni malachitowej i trzy mikrolitry jednej milimolowej matrycy zielonego aptameru malachitowego w 17,5 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody.Po przygotowaniu wszystkich reakcji przenieś każdą reakcję na płytkę 384-dołkową i monitoruj transkrypcję zielonego aptameru malachitowego na czytniku płytek fluorescencyjnych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wzbudzeniu 610 nanometrów i emisji 655 nanometrów. Pod koniec odczytu umieść płytkę na lodzie i uruchom produkt RNA z każdej studzienki w denaturującym 12% żelu poliakrylowym TBE-mocznik w buforze TBE o temperaturze 70 stopni Celsjusza przy napięciu 280 woltów przez 20 minut lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do końca żelu. Następnie wybarwić żel barwnikiem cyjaninowym i barwnikiem nukleinowym przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, przed obrazowaniem, jak pokazano.Pomyślna ekspresja i oczyszczanie rekombinowanego białka SNAP T7 RNAP może być potwierdzone za pomocą SDS-PAGE. Po SDS-PAGE aktywność enzymatyczna może być potwierdzona za pomocą reakcji transkrypcji in vitro. Pomyślne sprzężenie oligonukleotydów funkcjonalizowanych BG można zweryfikować za pomocą 18% denaturacji TBE-mocznika PAGE.W porównaniu z niemodyfikowanym oligonukleotydem, dodanie ugrupowania BG do oligonukleotydu zwiększa jego masę cząsteczkową. Jak zaobserwowano w tym reprezentatywnym żelu do barwienia barwnikiem cyjaninowym w celu potwierdzenia oczyszczania T7 RNAP na uwięzi DNA z nadmiaru oligonukleotydów BG, początkowy przepływ przez frakcję zawierał głównie nadmiar oligonukleotydu BG, a także niewielką część polimerazy na uwięzi DNA, która nie wiązała się z żywicą kationowymienną. Frakcje rozcieńczające pulę zawierały tylko pojedyncze pasmo oligo RNAP spowodowane wiązaniem barwnika cyjaninowego z wiązaniem oligonukleotydowym, przy czym pasmo produktu skoncentrowane w górę wykazywało to samo, ale ciemniejsze pasmo oznaczające udane stężenie w górę.Te same wzorce obserwuje się w przypadku barwienia Coomassie na niebiesko, z niewielkim przesunięciem ruchliwości żelu obserwowanym w niesprzężonej kontroli RNAP. Tutaj pokazany jest sygnał fluorescencyjny wytwarzany pod koniec transkrypcji in vitro w kinetyce w czasie rzeczywistym. W tej analizie zaobserwowano 336-krotną aktywację sygnału fluorescencji, co świadczy o solidnej kontroli aktywności polimerazy.Próbując tego protokołu, pamiętaj, aby dokładnie zmyć SDS z żelu przed barwieniem kwasami nukleinowymi. Dzieje się tak, ponieważ STS uwięzi barwnik w żelu, co spowoduje wysoki sygnał tła. Zastosowanie naszej metody do dużego obwodu genowego z wieloma kaskadami wykaże skalowalność i komponowalność systemu transkrypcji na uwięzi.Technika ta jest obecnie wykorzystywana do opracowywania obwodów genowych zdolnych do obliczeń w stylu sieci neuronowych.

dna-tethered-rna-polymerase-for-programmable-vitro-transcription

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejsza praca pokazuje, jak tworzyć hybrydy RNA/DNA na poziomie chromosomowym oraz wykazać transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży.

Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Systemy CRISPR/Cas pośredniczą w odporności adaptacyjnej u bakterii i archeonów. Przypuszcza się, że wiele białek Cas pełni funkcję endorybonukleaz działających na prekursory crRNA o różnej długości. W niniejszej pracy przedstawiamy trzy różne podejścia do generowania substratów pre-crRNA na potrzeby analizy biochemicznej aktywności endonukleazy Cas.

Generowanie substratów dla endonukleaz systemów CRISPR/Cas

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

Ten protokół opisuje metodę wyprowadzania bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów i testowania ich za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Bramki można modułowo komponować w systemy wieloskładnikowe w celu przybliżenia zachowania formalnych sieci reakcji chemicznych (CRN), demonstrując nowe zastosowanie CRN jako molekularnego języka programowania.

Bramki przemieszczenia nici DNA pochodzące z plazmidu do realizacji sieci reakcji chemicznych

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Ten protokół dostarcza badaczom nowego narzędzia do monitorowania wierności transkrypcji w wielu organizmach modelowych.

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych kondensatów biomolekularnych składających się z amfifilowych nanogwiazd DNA, zaczynając od ich składowych oligonukleotydów DNA. Kondensaty są wytwarzane z pojedynczego składnika nanogwiazdy lub dwóch składników i są modyfikowane w celu podtrzymania transkrypcji RNA in vitro z osadzonej matrycy DNA.

Syntetyczne kondensaty i architektury podobne do komórek z amfifilowych nanostruktur DNA

Poznaj metodę regulacji aktywności polimerazy T7 RNA przy użyciu sztucznych czynników transkrypcyjnych kwasów nukleinowych. Technika ta umożliwia programowalną transkrypcję in vitro i obliczenia molekularne.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Przeglądaj więcej filmów