Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Proponujemy metodę regulacji aktywności polimerazy z wykorzystaniem sztucznych czynników transkrypcyjnych kwasów nukleinowych. Ta architektura regulacji genów może służyć jako element składowy dla przyszłych urządzeń genetycznych in vitro. Poprzez wiązanie domeny wiążącej DNA z polimerazą RNA T7, technika ta łączy skalowalność obwodów opartych na DNA z funkcjonalnością obwodów transkrypcyjnych.

Rozpocznij od wykonania dziewięciu rozcieńczeń jednoniciowego oligonukleotydu BG do końcowej objętości 50 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody, w proporcjach od pięciu do jednego do jednego do pięciu, jak wskazano w tabeli. Przygotować jedną mieszaninę reakcyjną dla każdego rozcieńczenia, mieszając dwa mikrolitry buforu SNAP z czterema mikrolitrami oligonukleotydu BG i czterema mikrolitrami SNAP T7 RNAP. Przygotować kontrolę RNAP, zastępując oligonukleotyd wodą podwójnie destylowaną, a kontrolę DNA, zastępując RNAP SNAP T7 wodą podwójnie destylowaną.

Ustaw 11 reakcji, dodając dwa mikrolitry każdej próbki do czterech mikrolitrów buforu SNAP i dwóch mikrolitrów barwnika ładującego białko na próbkę. Podgrzewaj reakcje przez 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza, a następnie załaduj dwa mikrolitry każdej próbki na 4 do 12% szklistego żelu białkowego na 35 minut elektroforezy żelowej na lodzie o napięciu 200 woltów. Pod koniec cyklu przemyj żel trzema wymianami wody na shakerze przez co najmniej 10 minut na pranie, a następnie wytnij kwasem nukleinowym barwnikiem cyjaninowym przez 15 minut.

Zobrazuj żel w odpowiednim systemie obrazowania żelu i ponownie zabarwij żel 20 mililitrami niebieskiego Coomassie. Po godzinie odbarwiaj wodą podwójnie destylowaną przez co najmniej godzinę przed ponownym obrazowaniem żelu. W przypadku oczyszczania SNAP T7 na uwięzi oligonukleotydowej, najpierw należy przygotować bufor elucyjny, mieszając 50 mikrolitrów jednego śladu molowego ze 100 mikrolitrami pięciomolowego chlorku sodu z 850 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody.

Następnie umieścić jedną kolumnę jonowymienną na próbkę w pojedynczych dwumililitrowych probówkach wirówkowych i przemyć kolumny buforem oczyszczającym przez odwirowanie, aż cały bufor zostanie wyeluowany z każdej kolumny. Rozcieńczyć każdą próbkę buforem oczyszczającym w stosunku trzy do jednego buforu oczyszczającego do próbki i załadować 400 mikrolitrów próbki do każdej kolumny. Gdy cały bufor zostanie wymyty, jak pokazano, zebrać i oznaczyć przepływ dla każdej próbki.

Przemyć kolumny trzykrotnie 400 mikrolitrami buforu oczyszczającego na przemycie, aż cały bufor zostanie wymyty na płukanie, zbierając i etykietując przepływy, jeśli to konieczne. Po ostatnim płukaniu zebrać wymyte białko, dodając 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do środka kolumny i trzykrotnie odwirowując kolumnę, aż wszystkie 50 mikrolitrów buforu zostanie wymyte. Zebrać i oznaczyć elucję po każdym wirowaniu, zbierając elucję w jednej probówce po ostatnim odwirowaniu, pozostawiając niewielką objętość każdej elucji do analizy żelu.

Zmierzyć absorbancję pozostałych podwielokrotności elucji przy 260 i 280 nanometrach i dodać glicerol do próbek w stosunku jeden do jednego przez przechowywanie w temperaturze minus 20 stopni do czasu ich użycia. Użyj 500 mikrolitrów 30 kilodaltonowych filtrów odśrodkowych do buforowej wymiany całkowitego produktu elucji z 2x buforem magazynującym. I zmierz absorbancję, jak pokazano.

Następnie dodaj glicerol do produktu w stosunku jeden do jednego do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby ocenić elumy za pomocą SDS-PAGE, należy umieścić próbki w odpowiedniej drabince białkowej na żelu szklistym od czterech do 12% przez 35 minut przy napięciu 200 woltów lub do momentu, gdy czoło barwnika przesunie się na koniec żelu. Aby zademonstrować aktywność kontrolną na żądanie RNAP na uwięzi, zmieszaj 2,4 mikrolitra każdej matrycy z pięcioma mikrolitrami 5-krotnego buforu do wyżarzania i 14,2 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody.

Inkubuj powstały jednomikromolowy dwuniciowy DNA CAGE w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez dwie minuty. I wyżarzać szczepy zmysłowe i antysensowne matrycy DNA promotora i malachitu zielonego aptameru w taki sam sposób, jak wskazano w tabeli. Pod koniec inkubacji dodać na uwięzi SNAP T7 RNAP do dwuniciowego DNA CAGE w stosunku od jednego do pięciu molowych do końcowego stężenia 500 nanomolowych RNAP.

Po 15 minutach w temperaturze pokojowej umieścić próbkę na lodzie i zmieszać 2,5 mikrolitra 10x buforu transkrypcyjnego in vitro z jednym mikrolitrem 25-milimolowego trifosforanu rybonukleozydu, jednym mikrolitrem jednego milimolowego zielonego malachitu, 2,5 mikrolitra mieszaniny RNAP CAGE, 2,5 mikrolitra każdy z nici oligonukleotydów mikromolowych czynników transkrypcyjnych A i B, i trzy mikrolitry jednej milimolowej matrycy zielonego aptameru malachitowego w 10 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. W 15 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody należy przeprowadzić drugą reakcję zawierającą 2,5 mikrolitra 10-krotnego buforu transkrypcyjnego in vitro, jeden mikrolitr 25-milimolowej mieszaniny trifosforanu rybonukleozydu, jeden mikrolitr jednej milimolowej zieleni malachitowej, 2,5 mikrolitra mieszaniny RNAP CAGE i trzy mikrolitry jednej milimolowej matrycy zielonego aptameru malachitowego. Aby przygotować reakcję zawierającą tylko bufor, wymieszaj 2,5 mikrolitra 10-krotnego buforu transkrypcyjnego in vitro, jeden mikrolitr 25-milimolowej mieszanki trifosforanu rybonukleozydu, jeden mikrolitr jednej milimolowej zieleni malachitowej i trzy mikrolitry jednej milimolowej matrycy zielonego aptameru malachitowego w 17,5 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody.

Po przygotowaniu wszystkich reakcji przenieś każdą reakcję na płytkę 384-dołkową i monitoruj transkrypcję zielonego aptameru malachitowego na czytniku płytek fluorescencyjnych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wzbudzeniu 610 nanometrów i emisji 655 nanometrów. Pod koniec odczytu umieść płytkę na lodzie i uruchom produkt RNA z każdej studzienki w denaturującym 12% żelu poliakrylowym TBE-mocznik w buforze TBE o temperaturze 70 stopni Celsjusza przy napięciu 280 woltów przez 20 minut lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do końca żelu. Następnie wybarwić żel barwnikiem cyjaninowym i barwnikiem nukleinowym przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, przed obrazowaniem, jak pokazano.

Pomyślna ekspresja i oczyszczanie rekombinowanego białka SNAP T7 RNAP może być potwierdzone za pomocą SDS-PAGE. Po SDS-PAGE aktywność enzymatyczna może być potwierdzona za pomocą reakcji transkrypcji in vitro. Pomyślne sprzężenie oligonukleotydów funkcjonalizowanych BG można zweryfikować za pomocą 18% denaturacji TBE-mocznika PAGE.

W porównaniu z niemodyfikowanym oligonukleotydem, dodanie ugrupowania BG do oligonukleotydu zwiększa jego masę cząsteczkową. Jak zaobserwowano w tym reprezentatywnym żelu do barwienia barwnikiem cyjaninowym w celu potwierdzenia oczyszczania T7 RNAP na uwięzi DNA z nadmiaru oligonukleotydów BG, początkowy przepływ przez frakcję zawierał głównie nadmiar oligonukleotydu BG, a także niewielką część polimerazy na uwięzi DNA, która nie wiązała się z żywicą kationowymienną. Frakcje rozcieńczające pulę zawierały tylko pojedyncze pasmo oligo RNAP spowodowane wiązaniem barwnika cyjaninowego z wiązaniem oligonukleotydowym, przy czym pasmo produktu skoncentrowane w górę wykazywało to samo, ale ciemniejsze pasmo oznaczające udane stężenie w górę.

Te same wzorce obserwuje się w przypadku barwienia Coomassie na niebiesko, z niewielkim przesunięciem ruchliwości żelu obserwowanym w niesprzężonej kontroli RNAP. Tutaj pokazany jest sygnał fluorescencyjny wytwarzany pod koniec transkrypcji in vitro w kinetyce w czasie rzeczywistym. W tej analizie zaobserwowano 336-krotną aktywację sygnału fluorescencji, co świadczy o solidnej kontroli aktywności polimerazy.

Próbując tego protokołu, pamiętaj, aby dokładnie zmyć SDS z żelu przed barwieniem kwasami nukleinowymi. Dzieje się tak, ponieważ STS uwięzi barwnik w żelu, co spowoduje wysoki sygnał tła. Zastosowanie naszej metody do dużego obwodu genowego z wieloma kaskadami wykaże skalowalność i komponowalność systemu transkrypcji na uwięzi.

Technika ta jest obecnie wykorzystywana do opracowywania obwodów genowych zdolnych do obliczeń w stylu sieci neuronowych.