Name: Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę tworzenia monowarstw nabłonkowych z organoidów jelitowych do badania funkcji bariery jelitowej i odpowiedzi pacjenta. Protokół obejmuje pomiar TEER, testy przepuszczalności oraz analizę różnicowania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) dodatek partnerstwa publiczno-prywatnego (PPP) holenderskiego sektora LSH z numerem projektu LSHM16021 Organoidy jako nowatorskie narzędzie do modelowania toksykologicznego dla Hubrecht Organoid Technology (HUB) oraz wewnętrzne finansowanie HUB dla działu Modelowania Chorób i Toksykologii. Dziękujemy laboratoriom Sabine Middendorp (Oddział Gastroenterologii Dziecięcej, Szpital Dziecięcy Wilhelmina, UMC, Utrecht) oraz Hugo R. de Jonge i Marcelowi J.C. Bijveldsowi (Oddział Gastroenterologii i Hepatologii, Erasmus MC, Rotterdam) za zapewnienie wstępnego wsparcia technicznego w zakresie zakładania monowarstw na wkładkach membranowych.

<ol><li>Haegebarth, A., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling%2C+lgr5%2C+and+stem+cells+in+the+intestine+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).</li>
<li>Schoultz, I., Keita, ÅV. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909(2020).</li>
<li>Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMart%C3%ADnez-Maqueda%2C+D+%22The+Impact+of+Food+Bio-Actives+on+Gut+Health%3A+In+Vitro+and+Ex+Vivo+Models%22">The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%28%2B%29+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 11 (2), 179-194 (2013).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Van De Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li>
<li>d'Aldebert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+colon+organoids+from+inflammatory+bowel+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363(2020).</li>
<li>Dotti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+epithelial+stem+cell+compartment+could+contribute+to+permanent+changes+in+the+mucosa+of+patients+with+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis.</a> Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 45270(2017).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+induces+maturation+of+Paneth+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts.</a> Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).</li>
<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1+marks+early+secretory+progenitors+in+gut+crypts+that+can+revert+to+stem+cells+upon+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+R-spondin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The R-spondin protein family.</a> Genome Biology. 13 (3), 1-10 (2012).</li>
<li>Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+quiescence+of+Lgr5%2B+stem+cells+in+intestinal+organoids+enables+differentiation+of+hormone-producing+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+switch+hormone+expression+along+the+crypt-to-villus+BMP+signalling+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).</li>
<li>Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-independent+high-purity+cultures+of+Lgr5%2B+intestinal+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny.</a> Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids%3A+An+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+surrogate+Wnts+support+organoid+growth+and+deconvolute+Frizzled+pleiotropy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Pharmazie%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).</li>
<li>Lea, T. Caco-2 cell line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLea%2C+T+%22The+Impact+of+Food+Bio-Actives+on+Gut+Health%3A+In+Vitro+and+Ex+Vivo+Models%22">The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten opisuje ogólną manipulację i konserwację organoidów jelitowych, a także przygotowanie i możliwe zastosowania monowarstw nabłonka pochodzących z tych organoidów. Do tej pory z powodzeniem przygotowano monowarstwy z dwunastnicy, jelita krętego i różnych regionów organoidów okrężnicy pochodzących z normalnej, a także wcześniej i aktywnie zapalnej tkanki jelitowej (dane niepublikowane). Zastosowanie monowarstw organoidowych pochodzących od pacjenta ułatwia badanie funkcji bariery w sposób specyficzny dla choroby...

Nabłonek jelitowy działa jak fizyczna bariera między zawartością światła w jelitach a leżącą pod nim tkanką. Bariera ta składa się z pojedynczej warstwy nabłonkowej składającej się głównie z absorpcyjnych enterocytów, które są połączone ścisłymi połączeniami, które tworzą silne połączenia międzykomórkowe między sąsiednimi komórkami. Komórki te tworzą spolaryzowaną wyściółkę nabłonkową, która oddziela wierzchołkową (światło) i podstawno-boczną stronę jelita, jednocześnie regulując transport parakomórkowy strawionych składników odżywczych i metabolitów. Oprócz enterocytów inne ważne komórki nabłonkowe, takie jak komórki kubkowe, paneth i enteroendokrynne, również przyczyniają się do homeostazy jelit poprzez wytwarzanie odpowiednio śluzu, peptydów przeciwdrobnoustrojowych i hormonów. Nabłonek jelitowy jest stale uzupełniany przez dzielenie bogatych w leucynę, zawierających powtórzenia, zawierających powtórzenia komórek macierzystych 5-dodatnich receptorów (LGR5+) sprzężonych z białkiem G na dnie krypt jelitowych, wytwarzając komórki amplifikujące tranzyt (TA), które migrują w górę i różnicują się w inne typy komórek1. Zaburzenie homeostazy nabłonka jelitowego przez czynniki genetyczne i środowiskowe, takie jak narażenie na alergeny pokarmowe, związki lecznicze i patogeny drobnoustrojowe, prowadzi do zaburzenia funkcji bariery jelitowej. Stany te powodują kilka chorób jelit, w tym nieswoiste zapalenie jelit (IBD), celiakię i toksyczność przewodu pokarmowego wywołaną lekami2.
Badania nad nabłonkiem jelitowym są wykonywane przy użyciu kilku systemów platform in vitro, takich jak wkładki membranowe, systemy narządów na chipie, komory Ussinga i pierścienie jelitowe. Platformy te nadają się do tworzenia spolaryzowanych monowarstw nabłonka z dostępem zarówno do wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej strony błony, wykorzystując jako modele przekształcone linie komórkowe lub tkankę pierwotną. Chociaż przekształcone linie komórkowe, takie jak linie komórkowe raka jelita grubego (adeno)rak Caco-2, T84 i HT-29, są w stanie do pewnego stopnia różnicować się w spolaryzowane enterocyty jelitowe lub komórki wytwarzające śluz, nie są one reprezentatywne dla nabłonka in vivo, ponieważ brakuje kilku typów komórek, a różne receptory i transportery są nieprawidłowo wyrażane3. Ponadto, ponieważ linie komórkowe pochodzą od jednego dawcy, nie reprezentują one heterogeniczności między pacjentami i cierpią z powodu zmniejszonej złożoności i znaczenia fizjologicznego. Chociaż tkanki pierwotne stosowane w komorach Ussinga i jako pierścienie jelitowe są bardziej reprezentatywne dla sytuacji in vivo, ich ograniczona dostępność, krótkoterminowa żywotność i brak możliwości rozszerzania sprawiają, że nie nadają się jako pożywka do badań wysokoprzepustowych (HT).
Organoidy to kultury nabłonkowe in vitro powstałe z różnych organów, takich jak jelita, nerki, wątroba, trzustka i płuca. Udowodniono, że mają długoterminową, stabilną zdolność do rozszerzalności, a także stabilność genetyczną i fenotypową, a zatem są reprezentatywnymi biologicznymi miniaturami nabłonka pierwotnego narządu z wiernymi reakcjami na bodźce zewnętrzne4,5,6,7,8,9. Organoidy są skutecznie tworzone z wyciętej lub biopsji tkanki normalnej, chorej, zapalnej lub nowotworowej, reprezentując heterogeniczne odpowiedzi specyficzne dla pacjenta10,11,12,13,14,15,16. W artykule pokazano, w jaki sposób ustalić monowarstwy nabłonka jelitowego pochodzące z kultur organoidów. Z powodzeniem stworzono monowarstwy z kultur organoidów w jelicie cienkim, okrężnicy i odbycie. Model ten stwarza możliwość badania transportu i przepuszczalności komórek nabłonka do leków, a także ich toksykologicznego wpływu na nabłonek. Co więcej, model umożliwia współhodowlę z komórkami odpornościowymi i bakteriami w celu zbadania ich interakcji z nabłonkiem jelitowym17,18,19. Co więcej, model ten może być wykorzystany do badania odpowiedzi na terapie w sposób specyficzny dla pacjenta i inicjowania badań przesiewowych w celu poszukiwania kolejnej fali terapii skoncentrowanych na barierze nabłonkowej. Takie podejście można rozszerzyć na klinikę i utorować drogę do spersonalizowanych zabiegów.
Chociaż monowarstwy nabłonkowe w tym protokole są przygotowane z normalnych organoidów jelitowych człowieka, protokół może być zastosowany i zoptymalizowany dla innych modeli organoidów. Monowarstwy organoidów nabłonkowych są hodowane w pożywce do ekspandowania organoidów jelitowych zawierającej Wnt w celu wspierania proliferacji komórek macierzystych i reprezentowania składu komórkowego krypty jelitowej. Organoidy jelitowe można wzbogacić, aby miały różne losy nabłonka jelitowego, takie jak enterocyty, Paneth, kielichy i komórki enteroendokrynne, poprzez modulację szlaków Wnt, Notch i naskórkowego czynnika wzrostu (EGF). Tutaj, po ustanowieniu monowarstw w podłożu ekspandacyjnym, są one kierowane w kierunku bardziej zróżnicowanych komórek nabłonka jelitowego, jak opisano wcześniej20,21,22,23,24,25. Do celów przesiewowych, w zależności od sposobu działania związku będącego przedmiotem zainteresowania, jego komórek docelowych i warunków eksperymentalnych, monowarstwy można skierować w kierunku wybranego składu komórkowego, aby zmierzyć wpływ związku z odpowiednimi odczytami funkcjonalnymi.

<table><tbody><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Emergo</td><td>10644795</td><td></td></tr><tr><td>1250, 300 i 20 &mikro; Końcówki filtrujące L o niskiej retencji</td><td>Greiner bio-one</td><td>732-1432 / 732-1434 / 732-2383</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka HTS Fluoroblok Transwell (światłoszczelna)</td><td>Corning</td><td>351156</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki HTS Transwell (Tabela 1)</td><td>Corning</td><td>3378</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa z wkładkami Transwell</td><td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Sitko do komórek</td><td>PluriSelect</td><td>43-50040-01</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka przezroczyste dno</td><td>Greiner bio-one</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe szybkie termiczne płytki cykliczne</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka HTS Fluoroblok Transwell</td><td>Corning</td><td>351162</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka HTS Transwell (Tabela 1)</td><td>Corning</td><td>7369</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa przezroczysta płytka hodowlana</td><td>Greiner bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Bio-Techne Ltd</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek Accutase</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>A11105-01</td><td>Komórka odczynnik dysocjacyjny 2</td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12</td><td>Life Technologies Europe BV 12634028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do hodowli komórkowych (mikroskop świetlny / optyczny)</td><td>Wirówka Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>PHCBI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DEPC z powłoką H2O</td><td>Life Technologies Europe BV 750024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco z Ca2+ i Mg2+</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Life Technologies Europe BV 21600069</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania lizozymu EnzChek Life</td><td>Technologies Europe BV</td><td>E22013</td><td></td></tr><tr><td>Miernik EVOM2 z elektrodą STX</td><td>WTI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Bio-Techne Ltd</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>Volac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Human Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>Human Rspo3</td><td>Bio-Techne Ltd</td><td>3500-RS/CF</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-335</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne Ki67</td><td>Sanbio</td><td>BSH-7302-100</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 przeciwciało wtórne</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>Kova International Szkiełko szklane z kratkami zliczającymi</td><td>Fisher Emergo</td><td>10298483</td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH sól dilithium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Zredukowany czynnik wzrostu ( GFR)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 8-rurkowy pasek, 0,1 ml</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4358293</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczne paski z 8 nasadkami</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety (1000, 200 i 20 &mikro; L)</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MUC2 przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15334</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe MUC2</td><td>VWR</td><td>VWRKS/DPVR-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (200 &mikro; L)</td> <td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NGS Wnt</td><td>U-Protein Express</td><td>N001-0,5 mg</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd ALPI1 / Naprzód</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>GGAGTTATCCTGCTCCCCAC</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd ALPI1 / Reverse</td><td>Custom-made</td><td>CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd LGR5 / Naprzód</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>ACACGTCACAGAAGCTC</td> Oligonukleotyd <td></td></tr><tr><td>LGR5 / Odwrotny</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>GGAATGCAGGCCACTGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd MUC2 / Naprzód</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>AGGATCTGAAGAAGTGTCACTG</td> Oligonukleotyd <td></td></tr><tr><td>MUC2 / Odwrotny</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd TBP/Naprzód</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>ACGCCGAATATAATCCCAAGCG</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd TBP/Odwrotny</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>AAATCAGTGCCGTGGGGTTCGTG</td><td></td></tr><tr><td>Optyczne powłoki samoprzylepne Life</td><td>Technologies Europe BV</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72184</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Technologie życia Europe BV 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka płytkowa</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Fisher Emergo</td><td>A25776</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-2</td><td>preparat przeciwdrobnoustrojowy do komórek pierwotnych</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit RNA HS Life</td><td>Technologies Europe BV</td><td>Q32852</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na odczynnik do pipety wielokanałowej</td>Automatyczny podajnik próbek <td>CLS4870</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>z 24-sondową lub sondą 96C</td><td>WTI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Specjalny zestaw do barwienia</td><td>Thermo scientific</td><td>87023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNaz bez RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180 / 607180 / 760180</td><td></td></tr><tr><td>Pipetor serologiczny (Pipet-Aid)</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletka jednoostrzowa</td><td>GEM Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny 1. nitka system do RT-PCR</td><td>Life Technologies Europe BV 11904018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecan Czytnik płytek Spark 10M</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Enzym ekspresowy TrypLE (1x)</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>12605-010</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek 1</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y27632 (inhibitor ROCK)</td><td>AbMole</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

W przeszłości modele nabłonków jelitowych były ograniczone do przekształconych linii komórkowych i tkanek pierwotnych. Te systemy modelowe mają nieodłączne ograniczenia, ponieważ te pierwsze nie reprezentują wiernie oryginalnej fizjologii tkanek, a dostępność tych drugich jest ograniczona. W związku z tym ich stosowanie utrudnia badania podstawowe i badania nad rozwojem leków. Organoidy oparte na dorosłych komórkach macierzystych (zwane dalej organoidami) są miniaturami normalnej lub chorej tkanki nabłonkowej, z której pochodzą. Można je bardzo skutecznie ustalać z różnych regionów przewodu pokarmowego (GI), mają długoterminową zdolność do rozbudowy i symulują specyficzne dla tkanek i pacjentów reakcje na leczenie in vitro. W tym miejscu wykazano tworzenie monowarstw nabłonka pochodzących z organoidów jelitowych wraz z metodami pomiaru integralności bariery nabłonkowej, przepuszczalności i transportu, wydzielania białek przeciwdrobnoustrojowych, a także histologii. Co więcej, monowarstwy pochodzące z organoidów jelitowych mogą być wzbogacone o proliferujące komórki macierzyste i wzmacniające tranzyt, a także o kluczowe zróżnicowane komórki nabłonkowe. W związku z tym stanowią one system modelowy, który można dostosować do badania wpływu związków na komórki docelowe i ich sposób działania. Chociaż hodowle organoidów są technicznie bardziej wymagające niż linie komórkowe, po ustaleniu mogą zmniejszyć liczbę niepowodzeń na późniejszych etapach opracowywania leku, ponieważ naprawdę reprezentują złożoność nabłonka in vivo i niejednorodność między pacjentami.

Rysunek 1A przedstawia reprezentatywny obraz w polu jasnym organoidów jelitowych po rozmrożeniu z krioprobówki. Ważne jest, aby rozmrażać organoidy przy wysokiej gęstości w celu zapewnienia optymalnego odzysku. Organoidy wysiewa się na płytki 24- lub 6-dołkowe w kopułkach ECM o objętości około 10 µL (Rysunek 1B). Większość prawidłowych organoidów jelitowych ma morfologię torbielowatą. Po regeneracji z procesu rozmrażania organoidy zwiększają swoją wielkość i są ...

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Monowarstwy pochodzące z organoidów podsumowują funkcję bariery nabłonkowej jelit pacjenta i pozwalają przetestować efekt terapii mających na celu nasilenie dysfunkcji u każdego pacjenta w celu zidentyfikowania spersonalizowanych strategii leczenia. Monowarstwy organoidów zapewniają dostęp do wierzchołkowej strony nabłonka, czyli strony, po której dochodzi do uszkodzenia, i jest to normalne i dostępne w organoidach rosnących jako struktury 3D. Każdy organoid jest inny, stąd walka.Aby utworzyć ciasne monowarstwy, użyj organoidów w fazie proliferacji i szybko trawi, aby utworzyć klastry od dwóch do czterech komórek. Miareczkowanie wysiewu komórek dla każdego modelu. Demonstracja procedury zostanie przeprowadzona przez Wiesa Van Dooremalen, starszego pracownika naukowego HUB.Zacznij od pokrycia wkładek błonowych macierzą zewnątrzkomórkową lub ECM. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieść wkładki membranowe w płycie nośnej. Rozcieńczyć ECM 40X w lodowatym DPBS z wapniem i magnezem, a następnie odpipetować 150 mikrolitrów rozcieńczonego ECM do komory wierzchołkowej każdej wkładki.Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Aby przygotować komórki do wysiewu, należy podgrzać porcję odczynnika do dysocjacji komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj dwóch mililitrów odczynnika na każdą studzienkę płytki sześciodołkowej.Przenieść płytkę hodowlaną zawierającą organoidy z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. Przetwarzaj organoidy zgodnie z opisem w manuskrypcie, ale nie łącz wielu probówek w jedną probówkę. Po zebraniu organoidów dodać podłoże podstawowe lub BM do 12 mililitrów i odwirować przy 85 razy G, a następnie odessać supernatant.Napełnij probówkę zawierającą organoidy maksymalnie 12 mililitrami DPBS, a następnie pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów. Wirować w temperaturze 85 razy G przez pięć minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza i zasysać supernatant bez naruszania osadu organoidowego. Dodać wstępnie podgrzany odczynnik do dysocjacji komórek do organoidów i ponownie je zawiesić, a następnie inkubować probówki po przekątnej lub poziomo przez pięć minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą sterylnej plastikowej pipety o pojemności pięciu mililitrów lub pipety P1000. Sprawdź zawiesinę organoidu pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy utworzyła się mieszanina pojedynczych komórek i niektórych grudek komórek składających się z dwóch do czterech komórek. Zatrzymaj dysocjację komórek, dodając do zawiesiny komórki do 12 mililitrów BM z inhibitorem ROCK.Odwirować komórki, a następnie odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Podczas pracy z tą samą kulturą organoidów w kilku probówkach, połącz granulki komórek przed ponownym ich zawieszeniem w 12 mililitrach BM. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów wstępnie zwilżone BM i zbierz przepływ do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, a następnie umyj sitko 10 mililitrami BM i zbierz przepływ do tej samej probówki. Przenieś odkształconą zawiesinę komórkową do dwóch nowych 15-mililitrowych stożkowych probówek i powtórz wirowanie.Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w czterech mililitrach IEM uzupełnionym 10 mikromolowym inhibitorem ROCK na pełną płytkę hodowlaną używaną jako materiał wyjściowy. Wymieszaj niewielką ilość zawiesiny komórkowej w stosunku jeden do jednego z błękitem trypanowym do liczenia, a następnie policz komórki i oblicz całkowitą liczbę żywych komórek, licząc każdą pojedynczą komórkę w małych grudkach. Przygotować zawiesinę komórkową zawierającą od 3 X 10 do szóstych żywych komórek na mililitr IEM uzupełnioną 10 mikromolowym inhibitorem ROCK.Aby wysiać komórki, ostrożnie zassaj DPBS z wkładek pokrytych ECM, trzymając płytkę poziomo. Odpipetować 800 mikrolitrów IEM uzupełnionego inhibitorem ROCK do każdego przedziału podstawno-bocznego i 150 mikrolitrów zawiesiny komórek przygotowanych na membranę pokrytą ECM w komorze wierzchołkowej kroplami. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Gdy komórki osiądą osadzanie się na błonie, należy codziennie mierzyć przeznabłonkowy opór elektryczny lub TEER i obrazować wkładki membranowe za pomocą mikroskopu. Aby odświeżyć monowarstwy, należy usunąć pożywkę z podstawno-bocznych przedziałów płytki zawierającej wkładki membranowe, a następnie ostrożnie zassać pożywkę z komór wierzchołkowych. Dodaj kroplami 150 mikrolitrów świeżego IEM do każdej komory wierzchołkowej i dodaj 800 mikrolitrów świeżego IEM do każdej komory podstawno-bocznej.Jeśli używasz ręcznego miernika TEER, wyczyść elektrodę 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie umieść elektrodę w probówce zawierającej BM. Podłącz elektrodę do ręcznego miernika TEER i przekręć przełącznik funkcji, aby zmierzyć w omach i włączyć zasilanie. Umieść krótką elektrodę w komorze wierzchołkowej wkładu, a długą elektrodę w komorze podstawno-bocznej, nie dotykając monowarstwy. Zmierzyć rezystancję w studzience ślepej próby, a następnie w pozostałych próbkach.Przemyć elektrodę BM między próbkami o różnych warunkach. Po zakończeniu wyczyść elektrodę wodą demi i 70% etanolem, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Protokół ten został wykorzystany do pobrania organoidów jelitowych i przygotowania monowarstw komórek nabłonkowych.Monowarstwa, która była hodowana przez osiem dni w IEM, jest pokazana tutaj. Strukturę można zaobserwować podczas wystawiania monowarstw na pożywkę do różnicowania enterocytów lub EDM, podczas gdy monowarstwy wystawione na działanie pożywki kombinowanej lub CDM wykazują gładszą strukturę. Po tworzeniu monowarstw przeprowadzono ilościowo pomiar TEER.Całkowicie zlewająca się monowarstwa miała wartość TEER około 100 omów centymetrów kwadratowych, która wzrastała pod wpływem dowolnego ośrodka różnicującego. Monowarstwy we wszystkich warunkach pośrednich wykazywały niższą pozorną przepuszczalność dla żółcieni Lucyfera. Wydzielanie lizozymu przez monowarstwy jelita krętego hodowane w IEM było wyższe niż w przypadku monowarstw hodowanych w IEM do momentu zlewania się i przez kolejne cztery dni w EDM lub CDM.Monowarstwy hodowane w IEM, IEM i późniejszym EDM lub IEM i późniejszym CDM wykazują różnice w morfologii, które zaobserwowano w przypadku barwień H&E, Ki67, MUC2 i Alcian Blue. Po różnicowaniu komórki proliferacyjne zmniejszyły się, podczas gdy ekspresja genów markerów komórek kubkowych i enterocytów wzrosła w porównaniu z obserwowaną w warunkach IEM, jak wykazano w LGR5, MUC2 i ekspresji genów fosfatazy alkalicznej. Podczas przygotowywania monowarstw ważne jest, aby zapobiec anoikis w organoidach po ich strawieniu.Dodatkowo ECM w komórkach powinien być równomiernie rozłożony na membranach Transwell. Monowarstwy pochodzące z organoidów umożliwiają ocenę transportu cząsteczek przy użyciu różnych substratów fluorescencyjnych w sposób dostosowany do pacjenta.

organoid-derived-epithelial-monolayer-clinically-relevant-vitro-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: In, J. G. i in. Monowarstwy ludzkich koloniów do badania interakcji między patogenami, komensalami a nabłonkiem jelitowym gospodarza. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje procedurę hodowania komórek nabłonkowych pochodzących z jelita grubego na systemie Transwell pokrytym kolagenem, aby uzyskać monowarstwę produkującą śluz, która modeluje barierę jelitową i umożliwia badania interakcji gospodarz–patogen.

Generowanie monowarstwy ludzkiej kolonoidu z funkcją bariery do badania interakcji gospodarz–patogen

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Poznaj metodę tworzenia monowarstw nabłonkowych z organoidów jelitowych do badania funkcji bariery jelitowej i odpowiedzi pacjenta. Protokół obejmuje pomiar TEER, testy przepuszczalności oraz analizę różnicowania komórek.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Przeglądaj więcej filmów