Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Monowarstwy pochodzące z organoidów podsumowują funkcję bariery nabłonkowej jelit pacjenta i pozwalają przetestować efekt terapii mających na celu nasilenie dysfunkcji u każdego pacjenta w celu zidentyfikowania spersonalizowanych strategii leczenia. Monowarstwy organoidów zapewniają dostęp do wierzchołkowej strony nabłonka, czyli strony, po której dochodzi do uszkodzenia, i jest to normalne i dostępne w organoidach rosnących jako struktury 3D. Każdy organoid jest inny, stąd walka.

Aby utworzyć ciasne monowarstwy, użyj organoidów w fazie proliferacji i szybko trawi, aby utworzyć klastry od dwóch do czterech komórek. Miareczkowanie wysiewu komórek dla każdego modelu. Demonstracja procedury zostanie przeprowadzona przez Wiesa Van Dooremalen, starszego pracownika naukowego HUB.

Zacznij od pokrycia wkładek błonowych macierzą zewnątrzkomórkową lub ECM. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieść wkładki membranowe w płycie nośnej. Rozcieńczyć ECM 40X w lodowatym DPBS z wapniem i magnezem, a następnie odpipetować 150 mikrolitrów rozcieńczonego ECM do komory wierzchołkowej każdej wkładki.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Aby przygotować komórki do wysiewu, należy podgrzać porcję odczynnika do dysocjacji komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj dwóch mililitrów odczynnika na każdą studzienkę płytki sześciodołkowej.

Przenieść płytkę hodowlaną zawierającą organoidy z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. Przetwarzaj organoidy zgodnie z opisem w manuskrypcie, ale nie łącz wielu probówek w jedną probówkę. Po zebraniu organoidów dodać podłoże podstawowe lub BM do 12 mililitrów i odwirować przy 85 razy G, a następnie odessać supernatant.

Napełnij probówkę zawierającą organoidy maksymalnie 12 mililitrami DPBS, a następnie pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów. Wirować w temperaturze 85 razy G przez pięć minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza i zasysać supernatant bez naruszania osadu organoidowego. Dodać wstępnie podgrzany odczynnik do dysocjacji komórek do organoidów i ponownie je zawiesić, a następnie inkubować probówki po przekątnej lub poziomo przez pięć minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą sterylnej plastikowej pipety o pojemności pięciu mililitrów lub pipety P1000. Sprawdź zawiesinę organoidu pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy utworzyła się mieszanina pojedynczych komórek i niektórych grudek komórek składających się z dwóch do czterech komórek. Zatrzymaj dysocjację komórek, dodając do zawiesiny komórki do 12 mililitrów BM z inhibitorem ROCK.

Odwirować komórki, a następnie odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Podczas pracy z tą samą kulturą organoidów w kilku probówkach, połącz granulki komórek przed ponownym ich zawieszeniem w 12 mililitrach BM. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów wstępnie zwilżone BM i zbierz przepływ do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, a następnie umyj sitko 10 mililitrami BM i zbierz przepływ do tej samej probówki. Przenieś odkształconą zawiesinę komórkową do dwóch nowych 15-mililitrowych stożkowych probówek i powtórz wirowanie.

Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w czterech mililitrach IEM uzupełnionym 10 mikromolowym inhibitorem ROCK na pełną płytkę hodowlaną używaną jako materiał wyjściowy. Wymieszaj niewielką ilość zawiesiny komórkowej w stosunku jeden do jednego z błękitem trypanowym do liczenia, a następnie policz komórki i oblicz całkowitą liczbę żywych komórek, licząc każdą pojedynczą komórkę w małych grudkach. Przygotować zawiesinę komórkową zawierającą od 3 X 10 do szóstych żywych komórek na mililitr IEM uzupełnioną 10 mikromolowym inhibitorem ROCK.

Aby wysiać komórki, ostrożnie zassaj DPBS z wkładek pokrytych ECM, trzymając płytkę poziomo. Odpipetować 800 mikrolitrów IEM uzupełnionego inhibitorem ROCK do każdego przedziału podstawno-bocznego i 150 mikrolitrów zawiesiny komórek przygotowanych na membranę pokrytą ECM w komorze wierzchołkowej kroplami. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Gdy komórki osiądą osadzanie się na błonie, należy codziennie mierzyć przeznabłonkowy opór elektryczny lub TEER i obrazować wkładki membranowe za pomocą mikroskopu. Aby odświeżyć monowarstwy, należy usunąć pożywkę z podstawno-bocznych przedziałów płytki zawierającej wkładki membranowe, a następnie ostrożnie zassać pożywkę z komór wierzchołkowych. Dodaj kroplami 150 mikrolitrów świeżego IEM do każdej komory wierzchołkowej i dodaj 800 mikrolitrów świeżego IEM do każdej komory podstawno-bocznej.

Jeśli używasz ręcznego miernika TEER, wyczyść elektrodę 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie umieść elektrodę w probówce zawierającej BM. Podłącz elektrodę do ręcznego miernika TEER i przekręć przełącznik funkcji, aby zmierzyć w omach i włączyć zasilanie. Umieść krótką elektrodę w komorze wierzchołkowej wkładu, a długą elektrodę w komorze podstawno-bocznej, nie dotykając monowarstwy. Zmierzyć rezystancję w studzience ślepej próby, a następnie w pozostałych próbkach.

Przemyć elektrodę BM między próbkami o różnych warunkach. Po zakończeniu wyczyść elektrodę wodą demi i 70% etanolem, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Protokół ten został wykorzystany do pobrania organoidów jelitowych i przygotowania monowarstw komórek nabłonkowych.

Monowarstwa, która była hodowana przez osiem dni w IEM, jest pokazana tutaj. Strukturę można zaobserwować podczas wystawiania monowarstw na pożywkę do różnicowania enterocytów lub EDM, podczas gdy monowarstwy wystawione na działanie pożywki kombinowanej lub CDM wykazują gładszą strukturę. Po tworzeniu monowarstw przeprowadzono ilościowo pomiar TEER.

Całkowicie zlewająca się monowarstwa miała wartość TEER około 100 omów centymetrów kwadratowych, która wzrastała pod wpływem dowolnego ośrodka różnicującego. Monowarstwy we wszystkich warunkach pośrednich wykazywały niższą pozorną przepuszczalność dla żółcieni Lucyfera. Wydzielanie lizozymu przez monowarstwy jelita krętego hodowane w IEM było wyższe niż w przypadku monowarstw hodowanych w IEM do momentu zlewania się i przez kolejne cztery dni w EDM lub CDM.

Monowarstwy hodowane w IEM, IEM i późniejszym EDM lub IEM i późniejszym CDM wykazują różnice w morfologii, które zaobserwowano w przypadku barwień H&E, Ki67, MUC2 i Alcian Blue. Po różnicowaniu komórki proliferacyjne zmniejszyły się, podczas gdy ekspresja genów markerów komórek kubkowych i enterocytów wzrosła w porównaniu z obserwowaną w warunkach IEM, jak wykazano w LGR5, MUC2 i ekspresji genów fosfatazy alkalicznej. Podczas przygotowywania monowarstw ważne jest, aby zapobiec anoikis w organoidach po ich strawieniu.

Dodatkowo ECM w komórkach powinien być równomiernie rozłożony na membranach Transwell. Monowarstwy pochodzące z organoidów umożliwiają ocenę transportu cząsteczek przy użyciu różnych substratów fluorescencyjnych w sposób dostosowany do pacjenta.