Ekonomiczny i wszechstronny wysokowydajny system oczyszczania białek za pomocą wielokolumnowego adaptera płytowego

Ekonomiczny i wszechstronny wysokowydajny system oczyszczania białek za pomocą adaptera płytowego z wieloma kolumnami. Cześć, oczyszczanie białek jest niezbędne do badania struktury i funkcji białek. I zwykle stosuje się go w połączeniu z technikami biofizycznymi.

Jest to szczególnie ważne w erze proteomiki funkcjonalnej, która wymaga wysokoprzepustowej produkcji białek. Postawiliśmy hipotezę, że adapter płytkowy z wieloma kolumnami, MCPA, może łączyć wiele kolumn chromatograficznych różnych żywic z płytkami wielodołkowymi w celu równoległego oczyszczania. Dzięki temu adapterowi opracowaliśmy ekonomiczną i wszechstronną metodę oczyszczania białek, która może być stosowana pod wpływem grawitacji lub próżni rywalizującej pod względem prędkości zautomatyzowanego systemu.

Tutaj pokazujemy tę metodę chromatografii powinowactwa niklu i chromatografii jonowymiennej. Zamontuj MCPA, umieszczając przebitą matę uszczelniającą na długiej płycie ociekowej, a następnie włóż żądaną liczbę kolumn w otwory maty uszczelniającej. Umieść otwarte płytki zbiorcze w podstawie kolektora i zamknij górną częścią kolektora.

Przymocuj rurkę i umieść zmontowany MCPA z kolumnami na górze. Odpipetować 1,2 mililitra roztworu niklu-NTA do kolumn. Podczas pipetowania należy upewnić się, że kulki pozostają całkowicie wymieszane.

Włącz pompę i przepuść 20% etanol przez kolumny i do płytki zbiorczej poniżej. Wyłącz pompę po przepuszczeniu cieczy. Zawartość płytki zbiorczej wyrzucić do pojemnika na odpady.

Dodaj trzy objętości żywicy buforu EDTA do wszystkich kolumn. Włącz pompę i przepuść płyn. Teraz przemyj kolumny trzema objętościami żywicy 0,5 molowego buforu wodorotlenku sodu.

Umyj kolumny czterema objętościami żywicy zawierającymi 100 milimolowy siarczan niklu, a następnie 10 objętościami żywicy wody Mili-Q. Jeśli kolumna pracuje wolniej, przepchnij płyn za pomocą tłoka strzykawki. Wlej zawartość talerzy zbiorczych do pojemnika na odpady.

Następnie przemyć kolumny dwukrotnie czterema objętościami żywicy zawierającymi 10-milimolowy bufor do płukania imidazolu i opróżnić płytki zbiorcze. Jeśli oczyszczanych jest wiele próbek, zastąp otwarte płytki zbiorcze płytkami 48-dołkowymi. Przy wyłączonej próżni załaduj lizaty do kolumn.

Użyj cienkiego plastikowego mieszadła, aby delikatnie wymieszać kulki i lizaty w kolumnie, aby zmaksymalizować wiązanie. Włącz pompę i przepuść płyn. Jeśli kolumna zostanie zablokowana, przenieś mieszaninę żywicy lizatu do kolumny ze świeżym filtrem.

Zamroź płytki zbiorcze, aby zatrzymać przepływ. Zastąp otwartą płytką zbiorczą, a następnie umyj kolumny dziewięcioma objętościami żywicy 10-milimolowego buforu do płukania imidazolu. Powtórz ten krok cztery lub pięć razy.

Aby uniknąć przepełnienia, należy okresowo opróżniać talerze odpływowe. Zastąp otwarte płytki zbiorcze płytką 96-dołkową, upewniając się, że A1 znajduje się w lewym górnym rogu. Odpipetować jedną objętość żywicy denaturującego buforu elucyjnego do kolumn.

Przepuść płyn przez wodę i sprawdź płytkę zbiorczą, aby upewnić się, że między studzienkami nie ma zanieczyszczeń. Przy następnym rozcieńczeniu powtórz poprzednie kroki i zbierz na świeżej płytce zbiorczej. Pobrać 50 mikrolitrów podwielokrotności każdej elucji do analizy czystości i stężenia.

Następnie umyj kolumny dwoma mililitrami 20% etanolu. Dodaj kolejne dwa miliony 20% etanolu do kolumn i użyj świeżego cienkiego plastikowego mieszadła, aby wymieszać kulki w etanolu przed przeniesieniem do probówki o grubości 50 mil w celu przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zamontuj MCPA w kolektorze próżniowym z otwartą płytką zbiorczą i tłokami strzykawkowymi we wszystkich kolumnach.

Wyjąć wszystkie tłoki strzykawki z pierwszego rzędu. Zdejmij gumową uszczelkę z tłoka strzykawki o grubości pięciu mililitrów, a następnie przebij otwór w środku. Następnie przepchnij spód otwartej kolumny przez przebitą gumową uszczelkę.

Powtórz te kroki i wstaw w pierwszym rzędzie kolumn. Upewnij się, że kulki sefarozy Q są w pełni wymieszane. A za pomocą niebieskiej końcówki pipety, która jest wycięta dwa centymetry od dna, odpipeuj 800 mikrolitrów kulek sefarozy Q do otwartych kolumn

Gdy kulki osiądą na dnie kolumn, włącz pompę próżniową na tyle, aby przepuścić 20% etanolu. Umyj kolumny dwukrotnie dwoma milimolami Tris o wielkości 10 milimolów. Wyłącz pompę tuż przed przejściem bufora Tris, aby zapobiec wysychaniu żywicy.

Spływ można wyrzucić i zastąpić 48-dołkowymi płytkami zbiorczymi. Przenieść wszystkie próbki, które mają być oczyszczone, do kolumn Q Sepharose w pierwszym rzędzie i użyć cienkiego plastikowego mieszadła do mieszania próbek i kulek przez około dwie minuty przed włączeniem pompy próżniowej. Przechowuj lub zamrażaj przepływy do późniejszej analizy.

Za pomocą otwartej płytki zbiorczej umyj kolumny dwukrotnie dwoma milimolami Tris o wielkości 10 milimolów. Zastąp otwarte płytki zbiorcze płytką 96-dołkową. Pierwszą frakcję elucyjną można zebrać w pierwszym rzędzie lub w drugim rzędzie.

Aby wymyć w drugim rzędzie, należy usunąć tłoki strzykawki z tych pozycji. Przesunąć kolumny Q Sepharose do tych pozycji, a następnie umieścić tłoki strzykawki w otwartych kolumnach w pierwszym rzędzie. Odpipetować jeden mililitr pierwszych stężeń soli do kolumn Sepharose Q.

Włącz pompę i zbierz elucję. Aby zebrać następną elucję, należy usunąć tłoki strzykawki z następnych pozycji, przesunąć kolumny Q Sepharose do tych pozycji, a następnie wymienić tłoki w poprzednich pozycjach. Powtórz te kroki dla każdego kolejnego stężenia soli używanego do elucji.

Upewnij się, że nowa płytka zbiorcza jest używana na każde cztery elucjacje i że każda płytka jest oznakowana i przechowywana. Z otwartymi płytkami zbiorczymi, przemyć kolumny dwoma mil czteromolowego chlorku sodu, 10 milimolowym Tris. Odpipeuj dwa miliony 20% etanolu i przepuść przez to, aż znajdzie się tuż nad kulkami, a następnie uszczelnij kolumny do przechowywania.

Na przykład MCPA z powodzeniem oczyściła 14 mutantów AbpSH3 w warunkach denaturacji za pomocą niklu-NTA. Niewielkie zanieczyszczenie można zaobserwować przy 25 kilodaltonach, chociaż białko jest nadal w dużej mierze czyste. Niewielkie zanieczyszczenia obserwowane w warunkach denaturacji są usuwane w warunkach rodzimych.

Wykazano to, gdy 11 różnych domen SH3 zostało oczyszczonych. To pokazuje, że MCPA może być używany do porównywania warunków oczyszczania. AbpSH3 można oddzielić od większości zanieczyszczeń poprzez oczyszczanie jonowymienne z lizatów.

Uzyskano dobre wyniki znacznie czystego białka AbpSH3 przy różnych zanieczyszczeniach o wyższej masie cząsteczkowej. Oczyszczanie próbek po niklu-NTA za pomocą wymiany jonowej z MCPA skutecznie usunęło te ciężkie zanieczyszczenia. Chociaż nadal występuje niewielkie zanieczyszczenie, frakcje są nadal w dużej mierze czyste i dostarczyły dobrych danych biofizycznych przy użyciu NMR i termicznych testów denaturacji chemicznej.

Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że nasza hipoteza jest poprawna i że MCPA może z powodzeniem oczyszczać miligramowe ilości białek przy użyciu różnych technik chromatograficznych. System MCPA można skonfigurować na wiele sposobów w ramach tych samych przebiegów, aby zoptymalizować warunki oczyszczania. Konfiguracja jest prosta, tania i łatwa do przeszkolenia dla niedoświadczonych użytkowników, szczególnie w laboratoriach, które nie oczyszczają rutynowo białek.