Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Nasz protokół pozwala na skuteczną identyfikację genów lub kombinacji genów, które blokują inwazję raka u widza. Hodowla nie wymaga zaawansowanych urządzeń do utrzymania zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, jako ogólne lub ogólne, biblioteki specjalne mogą być wyświetlane w przeglądarce w ciągu kilku tygodni.

Ten system badań przesiewowych pomoże naukowcom odkryć nowe terapeutyczne cele genowe lub kombinacje genów docelowych, które można wykorzystać do blokowania przerzutów raka. W przypadku wstrzyknięcia dożylnego należy skoncentrować komórki do 0,5 do 1 miliona komórek na mililitr, używając lodowatego 1X PBS do rozcieńczenia lub ponownego zawieszenia komórek. Spodziewaj się, że na każde 10 zarodków potrzeba około jednego mililitra zawiesiny komórkowej.

Aby zmontować aparat do wstrzykiwań, należy zamontować igłę na strzykawce, a następnie przedłużyć igłę strzykawki za pomocą rurki o długości od trzech do pięciu centymetrów. Złamij końcówkę igły borokrzemianowej za pomocą drobnych kleszczy. Załadować do strzykawki od 50 do 200 mikrolitrów zawiesiny komórek rakowych.

I włóż igłę borokrzemianową do rurki. Sprawdzić, czy igła nie jest zatkana komórkami i nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli zaobserwuje się zatkanie komórek w kapilarze, usuń kapilarę, ponownie zawieś komórki i zastąp ją nową kapilarą.

Użyj tłoka, aby wypchnąć wszelkie bąbelki. Zdejmij pokrywę i przenieś zarodek pod stereoskop. Zidentyfikować odpowiednią żyłę, która ma zostać wstrzyknięta na powierzchnię CAM; która jest zwykle tylko nieznacznie szersza niż średnica końcówki igły borokrzemianowej i znajduje się w połowie odległości między zarodkiem a ścianką szalki wagowej.

Na ogół łatwiej jest wstrzyknąć w punkt bezpośrednio przylegający do rozwidlenia żyły. Dociśnij końcówkę igły do ściany naczynia krwionośnego i delikatnie uciskaj w tym samym kierunku, co przepływ krwi. W razie potrzeby użyj bawełnianego wacika, aby pomóc zakotwiczyć lub ustabilizować wstrzykiwane naczynie.

Delikatnie wcisnąć tłok strzykawki na 2 do 10 sekund, aż do wstrzyknięcia żądanej objętości. Zarodek należy wyrzucić, jeśli w miejscu wstrzyknięcia pojawi się nadmierne krwawienie lub przezroczyste nagromadzenie płynu. Wyjąć igłę z kamery i delikatnie przetrzeć miejsce wstrzyknięcia bawełnianym wacikiem, aby usunąć krew lub nadmiar komórek rakowych.

Przykryć pokrywką wstrzyknięty zarodek w naczyniu wagowym i umieścić go z powrotem w inkubatorze. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte. Sprawdź wzrokowo zarodki pod kątem zanieczyszczenia bakteryjnego lub pleśni lub śmierci.

I wyrzuć zanieczyszczone zarodki zgodnie z laboratoryjnymi procedurami utylizacji. Upewnij się, że kolonie przerzutów mają jednolity kształt w ciągu pierwszych jednego do trzech dni po wstrzyknięciu. I zidentyfikuj inwazyjne lub nieinwazyjne kolonie przerzutowe w czwartym do piątym dniu po wstrzyknięciu.

W piątym dniu po wstrzyknięciu należy wyjąć zarodki z inkubatora oraz sprawdzić i zlokalizować CAM zarodków pod kątem rozmieszczenia kolonii z przerzutami. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie pociągnij tkankę CAM, która zawiera interesującą kolonię przerzutów, w górę za pomocą cienkich kleszczy i odetnij ją nożyczkami chirurgicznymi. Przenieś tkankę CAM do pustej, sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i zamknij pokrywę probówki.

Powtarzaj procedurę wycinania, aż wszystkie interesujące kolonie zostaną zebrane do oddzielnych probówek. Delikatnie zmielić tkankę CAM w mikroprobówce wirówkowej, używając oddzielnej sterylnej igły o rozmiarze 18 dla każdej kolonii. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu kolagenu A 1X i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odwiruj komórki i tkankę CAM w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze otoczenia. Odessać roztwór kolagenu-A i ponownie zawiesić komórki niekompletne podłoże dla interesującej nas linii komórkowej. Następnie ponownie odwiruj komórki i tkankę.

Ponownie zawiesić komórki i kawałki tkanek w jednym mililitrze kompletnego podłoża i współczynnika selekcji, jeśli taki istnieje. Następnie przenieś do pojedynczego 12-dołkowego naczynia do hodowli tkankowej. Przez następny tydzień do trzech tygodni codziennie monitoruj komórki rakowe pod kątem wzrostu i zanieczyszczenia.

Gdy komórki osiągną 70 do 80% konfluencji, przenieś je do naczynia hodowlanego o większej objętości. Przejdź do sekwencjonowania lub następnej rundy selekcji, gdy tylko zostanie osiągnięta odpowiednia liczba komórek rakowych. Zarodki wykazujące nagromadzenie komórek rakowych z powodu nieudanego wstrzyknięcia można zobaczyć w większości naczyń włosowatych.

Po osiągnięciu optymalnego stężenia komórek i czasu trwania wstrzyknięcia, w piątym dniu po wstrzyknięciu komórki transdukowane powinny wytwarzać szeroką gamę fenotypów kolonii, przy czym większość kolonii jest inwazyjna, o czym świadczą komórki rakowe wyglądające na rozproszone w tkance CAM. Należy zwrócić uwagę na kolonie przerzutowe, które wydają się zwarte i znajdują się na tyle daleko od sąsiednich kolonii, że można je wyciąć kleszczami i nożyczkami oraz jednym kawałkiem tkanki CAM. Izolowane dodatnie trafienie w ekran powinno wyświetlać fenotyp zwartej kolonii po ponownym wstrzyknięciu.

W celu pomiaru kontaktów naczyń krwionośnych komórek rakowych należy zwrócić uwagę na jasność zabarwienia ściany naczynia krwionośnego i wstrzyknąć odpowiednią ilość lektyn do sygnału ściany naczynia. Podczas próby skorzystania z tego protokołu należy unikać niedostatecznego lub nadmiernego wstrzyknięcia i usunąć nadmierne krwawienie lub nagromadzenie płynu. Przy użyciu tej techniki zidentyfikowano kilka nowych genów, które napędzają inwazję komórek rakowych u widza.