Name: Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji genów hamujących inwazję nowotworową przy użyciu błony nazębnej kurcząt. To podejście umożliwia szybki screening bez zaawansowanych urządzeń do hodowli zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grant Kanadyjskiego Towarzystwa Badawczego Onkologicznego #702849 dla JDL i KS. Dr Lewis prowadzi Katedrę Badań nad Rakiem Prostaty Franka i Carli Sojonky, wspieraną przez Alberta Cancer Foundation.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Van't Veer, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li>
<li>Eccles, S. A., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+recent+discoveries+and+novel+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies.</a> Lancet. 369 (9574), London, England. 1742-1757 (2007).</li>
<li>Weber, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of metastasis.</a> Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-driven+extracellular+matrix+remodeling+drives+haptotaxis+during+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).</li>
<li>Leong, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).</li>
<li>Kain, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+as+an+expanding+experimental+model+for+cancer+and+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics+%3A+An+official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research.</a> Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+tumor+cell+intravasation+and+subsequent+metastasis+via+regulation+of+in+vivo+tumor+cell+motility+by+the+tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).</li>
<li>Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cancer+metastasis+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815(2011).</li>
<li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+whole+genome+motility+screen+reveals+novel+therapeutic+targets+to+block+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis.</a> Nature Communications. 9 (1), 2343(2018).</li>
<li>Leong, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia+are+required+for+cancer+cell+extravasation+and+are+a+therapeutic+target+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis.</a> Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).</li>
<li>Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilletts%2C+L+%22The+Tumor+Microenvironment%3A+Methods+and+Protocols%22">The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols</a>. Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. , Springer. New York. 27-37 (2016).</li>
</ol>

Nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół szybkich badań przesiewowych opartych na mikroskopii fluorescencyjnej, który można wykorzystać do ważnych zastosowań, takich jak badania przesiewowe genetyczne lub kandydatów na leki. Komórki rakowe, które zostały transdukowane za pomocą biblioteki genetycznej będącej przedmiotem zainteresowania lub transfekowane indywidualnymi konstruktami ekspresyjnymi, mogą być szybko badane i określane ilościowo pod kątem fenotypu zainteresowania przy użyciu tego modelu CAM piskląt. Ponieważ protokoły...

Przerzuty są główną przyczyną zgonów pacjentów z rakiem1,2,3. Przerzutowe komórki rakowe wykorzystują odrębne szlaki sygnałowe, w zależności od rodzaju nowotworu, na pięciu etapach kaskady przerzutów: inwazja miejscowa, wynaczynienie, przeżycie w krążeniu, wynaczynienie i ekspansja kolonii w odległych miejscach przerzutów. Obecna wiedza na temat tego procesu przerzutowego sugeruje, że istnieją dwa etapy wąskiego gardła, jeden to kierunkowa inwazja komórki rakowej z guza pierwotnego, a drugi to ustalenie odległej zmiany przerzutowej4,5,6. Oba etapy wymagają, aby komórki rakowe aktywnie oddziaływały z kolagenem i naczyniami krwionośnymi w miejscach początkowej inwazji lub tworzenia odległych zmian przerzutowych. Dlatego przerzutowe komórki rakowe muszą być w stanie przyczepiać się do komórek, przebudowywać włókna kolagenowe i kierunkowo atakować wzdłuż ścian naczyniowych7. Największe znaczenie mają modele przesiewowe, które mogą szybko zidentyfikować cele terapeutyczne leków przeciwprzerzutowych w celu zablokowania komórek rakowych przed wykonaniem tych etapów. Istniejące modele badań przesiewowych in vitro nie naśladują w pełni złożonego środowiska żywych tkanek. Modele myszy są kosztowne i czasochłonne. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na platformy do badań przesiewowych przyżyciowych, które zapewniają złożone środowisko żywych tkanek i szybką identyfikację celów.
W ciągu ostatniej dekady zarodek kurczaka stał się solidnym i opłacalnym modelem przerzutów raka u ludzi8,9,10,11,12. Tkanka błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jest cienka i przezroczysta, co czyni ją idealną do przyżyciowego obrazowania mikroskopowego zachowań komórek i kolonii w guzie pierwotnym i/lub miejscach przerzutów12. Pierwotny wzrost guza z wielu linii komórek raka ludzkiego może zostać zainicjowany i przerzutowany w ciągu zaledwie kilku dni po mikrowstrzyknięciu do tkanki CAM. Komórki nowotworowe mogą być podawane do tkanki CAM na kilka sposobów, w tym dożylnie, dożylnie, dożylnie lub jako kolagen na roślinach, ta elastyczność pozwala badaczowi skupić się na określonych etapach progresji raka, na przykład tworzeniu się zmian przerzutowych, inwazji guza pierwotnego lub angiogenezie.
Tutaj opisujemy ilościową platformę przesiewową, która może być wykorzystana do pomiaru zdolności komórek rakowych do tworzenia inwazyjnych zmian przerzutowych. Komórki rakowe, które zostały transdukowane za pomocą biblioteki ekspresji, są wstrzykiwane dożylnie do układu naczyniowego CAM o niskiej gęstości. Kolonie przerzutowe tworzą się przez 4-5 dni, następnie ocenia się zdolność inwazji i interakcję naczyniową powstałych kolonii. Poszczególne kolonie, którym nie udaje się dokonać inwazji, są wycinane, rozmnażane, a ich fenotyp jest potwierdzany w CAM poprzez ponowne wstrzyknięcie i ilościowe określenie zwartości kolonii i kontaktów komórek rakowych z naczyniami krwionośnymi. Konstrukty biblioteki ekspresji odpowiedzialne za fenotyp mutacji pojedynczej kolonii przerzutowej są identyfikowane na podstawie izolowanego genomowego DNA kolonii za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ta sama platforma może być dalej wykorzystywana do walidacji związku przyczynowego między genem a obserwowanym fenotypem lub do przeprowadzania dogłębnych badań mechanistycznych obserwowanego fenotypu.

<table><tbody><tr><td>Jednorazowe strzykawki 1 ml</td><td>BD</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>stożkowe probówki wirówkowe 15 ml.</td><td>Corning</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>18 miernik x 1 1/2&nbsp; Precyzyjna igła BD</td><td>BD</td><td>BD305196</td><td>używamy 1,2 mm x 40 mm, w razie potrzeby można użyć krótszych igieł</td></tr><tr><td>2,5% roztworu trypsyny</td>, dostępnych <td></td><td></td><td>jest wiele źródeł</td></tr> rak <tr><td>piersi myszy 4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>B16F10 mysia linia komórkowa czerniaka</td><td>ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa.</td>Dostępnych <td></td><td>jest wiele źródeł</td> Każda <td>wirówka kompatybilna z TC, która może być używana do wirowania komórek, jest odpowiednia</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe, 22 mm.</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-101</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td>konfokalny</td> Używamy wacików <td>bawełnianych Nikon A1r</td></tr><tr><td>,</td><td>dostępnych</td><td></td> jest wiele źródeł, <td>należy je wysterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Pożywki hodowlane odpowiednie dla użytych linii komórkowych</td><td>dostępnych jest</td><td></td> wiele źródeł <td>Hodujemy linie komórkowe HT1080, HEp3 i b16 w DMEM, 10% nośniki FBS</td></tr><tr><td>Inkubator jaj</td> dostępnych <td></td><td>jest wiele źródeł</td><td>Dokładny model, który jest niezbędny, zależy od skali ekranu. Dostępne źródła to MGF Company Inc., Savannah, GA, lub&nbsp; Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA</td></tr><tr><td>probówki eppendor, 1,5 ml</td><td>Sigma</td><td>T4816-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Zapłodnione białe jaja Leghorn</td><td>każdy lokalny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>drobne kleszcze</td><td>dostępne wiele</td><td></td> źródeł <td>musi być wysterylizowany przed użyciem</td></tr><tr><td>Hemocytometr&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>MDH-4N1-50PK</td><td></td></tr><tr><td>HT1080 ludzka linia komórkowa włókniakomięsaka</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td></td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td><td>do analizy obrazu</td><td>Używamy Nikon Elements</td></tr><tr><td>Lectin Lens Culinary Aglutynina (LCA) sprzężona z fluoresceiną lub rodaminą&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1042, FL-1041</td><td>Rozcieńczony materiał (5 mg / ml) 50-100x w zależności od czułości mikroskopu. Musi mieć inny kolor niż kolor linii komórkowej używanej do badań przesiewowych</td></tr><tr><td>MDA-MB-468 ludzkiego raka piersi</td><td>ATCC</td><td>HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td>dostępnych <td></td><td></td><td>jest wiele źródeł</td></tr><tr><td>Plastikowe naczynia do ważenia&nbsp;</td><td>Simport</td><td>CA11006-614</td><td>wymiary to 78x78x25mm; dostępnych jest wiele innych źródeł</td></tr><tr><td>małe nożyczki chirurgiczne&nbsp;</td>dostępnych <td></td><td>jest wiele źródeł</td>, <td>które należy wysterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego sodu, średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, długość 10 cm&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowe szalki Petriego (używane jako pokrywki do szalek ważących).</td><td>&nbsp; Firma VWR&nbsp;</td><td>CA25378-115&nbsp;</td><td>wymiary to 100x100x15mm; dostępnych jest wiele innych źródeł</td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td></td><td></td> Używamy wężyka laboratoryjnego <td>Zeiss Lumar v12</td></tr><tr><td>Tygon R-3603</td><td>Cole-Parmer</td><td>AAC00001</td><td>średnicy wewnętrznej, 3/32 cala średnicy zewnętrznej, grubości ścianki 1/32 cala</td></tr><tr><td>U-118 MG glejak ludzki</td><td>ATCC</td><td>HTB-15</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG glejak wielopostaciowy</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do pipet&nbsp;</td>dostępnych <td></td><td>jest wiele źródeł</td><td>, używamy David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Wzór 720</td></tr></tbody></table>

odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Ostatnie postępy w badaniach nad rakiem zilustrowały bardzo złożoną naturę przerzutów nowotworowych. Stwierdzono, że wiele genów lub sieci genów jest zaangażowanych w różnicową regulację przerzutowych genów kaskadowych raka i produktów genowych w zależności od typu nowotworu, tkanki i indywidualnych cech pacjenta. Stanowią one potencjalnie ważne cele dla terapii genetycznych i podejść medycyny spersonalizowanej. Opracowanie platform do szybkich badań przesiewowych ma zasadnicze znaczenie dla identyfikacji tych celów genetycznych.
Błona kosmówkowo-omoczniowa piskląt (CAM) jest wysoce unaczynioną, bogatą w kolagen błoną znajdującą się pod skorupką jaja, która pozwala na wymianę gazową w rozwijającym się zarodku. Ze względu na lokalizację i unaczynienie CAM, opracowaliśmy go jako przyżyciowy model przerzutów raka u ludzi, który pozwala na solidny ksenograf ludzkich komórek rakowych i obrazowanie w czasie rzeczywistym interakcji komórek rakowych z macierzą bogatą w kolagen i naczyniami krwionośnymi. 
Korzystając z tego modelu, zaprojektowano ilościową platformę przesiewową do identyfikacji nowych czynników powodujących lub supresorów przerzutów raka. Przetransdukowaliśmy pulę komórek nowotworowych głowy i szyi HEp3 z kompletną biblioteką genów shRNA ludzkiego genomu, a następnie wstrzyknęliśmy komórki, o niskiej gęstości, do układu naczyniowego CAM. Komórki namnażały się i tworzyły kolonie pojedynczych komórek nowotworowych. Poszczególne kolonie, które nie były w stanie zaatakować tkanki CAM, były widoczne jako zwarty fenotyp kolonii i wycinane w celu identyfikacji transdukowanego shRNA obecnego w komórkach. Obrazy poszczególnych kolonii oceniano pod kątem ich inwazyjności. Przeprowadzono wiele rund selekcji w celu zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich. Indywidualne, izolowane klony komórek rakowych lub nowo zmodyfikowane klony, które wyrażają interesujące geny, poddano pierwotnemu testowi tworzenia guza lub analizie kooptacji unaczynienia komórek rakowych. Podsumowując, przedstawiamy platformę do szybkich badań przesiewowych, która pozwala na identyfikację celu przeciwprzerzutowego i analizę przyżyciowej dynamicznej i złożonej kaskady zdarzeń.

Wstrzyknięcie komórek nowotworowych uznaje się za udane, jeśli większość komórek zatrzymanych w naczyniach włosowatych występuje pojedynczo i w znacznej odległości od siebie (~0,05-0,1 cm), tak aby kolonie nie nakładały się na siebie po 5-6 dniach inkubacji (Rysunek 3A). Wstrzyknięcie uznaje się za nieudane, jeśli w większości naczyń włosowatych widoczne są skupiska komórek nowotworowych; embriony wykazujące taką cechę należy odrzucić (Ry...

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

Nasz protokół pozwala na skuteczną identyfikację genów lub kombinacji genów, które blokują inwazję raka u widza. Hodowla nie wymaga zaawansowanych urządzeń do utrzymania zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, jako ogólne lub ogólne, biblioteki specjalne mogą być wyświetlane w przeglądarce w ciągu kilku tygodni.Ten system badań przesiewowych pomoże naukowcom odkryć nowe terapeutyczne cele genowe lub kombinacje genów docelowych, które można wykorzystać do blokowania przerzutów raka. W przypadku wstrzyknięcia dożylnego należy skoncentrować komórki do 0,5 do 1 miliona komórek na mililitr, używając lodowatego 1X PBS do rozcieńczenia lub ponownego zawieszenia komórek. Spodziewaj się, że na każde 10 zarodków potrzeba około jednego mililitra zawiesiny komórkowej.Aby zmontować aparat do wstrzykiwań, należy zamontować igłę na strzykawce, a następnie przedłużyć igłę strzykawki za pomocą rurki o długości od trzech do pięciu centymetrów. Złamij końcówkę igły borokrzemianowej za pomocą drobnych kleszczy. Załadować do strzykawki od 50 do 200 mikrolitrów zawiesiny komórek rakowych.I włóż igłę borokrzemianową do rurki. Sprawdzić, czy igła nie jest zatkana komórkami i nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli zaobserwuje się zatkanie komórek w kapilarze, usuń kapilarę, ponownie zawieś komórki i zastąp ją nową kapilarą.Użyj tłoka, aby wypchnąć wszelkie bąbelki. Zdejmij pokrywę i przenieś zarodek pod stereoskop. Zidentyfikować odpowiednią żyłę, która ma zostać wstrzyknięta na powierzchnię CAM; która jest zwykle tylko nieznacznie szersza niż średnica końcówki igły borokrzemianowej i znajduje się w połowie odległości między zarodkiem a ścianką szalki wagowej.Na ogół łatwiej jest wstrzyknąć w punkt bezpośrednio przylegający do rozwidlenia żyły. Dociśnij końcówkę igły do ściany naczynia krwionośnego i delikatnie uciskaj w tym samym kierunku, co przepływ krwi. W razie potrzeby użyj bawełnianego wacika, aby pomóc zakotwiczyć lub ustabilizować wstrzykiwane naczynie.Delikatnie wcisnąć tłok strzykawki na 2 do 10 sekund, aż do wstrzyknięcia żądanej objętości. Zarodek należy wyrzucić, jeśli w miejscu wstrzyknięcia pojawi się nadmierne krwawienie lub przezroczyste nagromadzenie płynu. Wyjąć igłę z kamery i delikatnie przetrzeć miejsce wstrzyknięcia bawełnianym wacikiem, aby usunąć krew lub nadmiar komórek rakowych.Przykryć pokrywką wstrzyknięty zarodek w naczyniu wagowym i umieścić go z powrotem w inkubatorze. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte. Sprawdź wzrokowo zarodki pod kątem zanieczyszczenia bakteryjnego lub pleśni lub śmierci.I wyrzuć zanieczyszczone zarodki zgodnie z laboratoryjnymi procedurami utylizacji. Upewnij się, że kolonie przerzutów mają jednolity kształt w ciągu pierwszych jednego do trzech dni po wstrzyknięciu. I zidentyfikuj inwazyjne lub nieinwazyjne kolonie przerzutowe w czwartym do piątym dniu po wstrzyknięciu.W piątym dniu po wstrzyknięciu należy wyjąć zarodki z inkubatora oraz sprawdzić i zlokalizować CAM zarodków pod kątem rozmieszczenia kolonii z przerzutami. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie pociągnij tkankę CAM, która zawiera interesującą kolonię przerzutów, w górę za pomocą cienkich kleszczy i odetnij ją nożyczkami chirurgicznymi. Przenieś tkankę CAM do pustej, sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i zamknij pokrywę probówki.Powtarzaj procedurę wycinania, aż wszystkie interesujące kolonie zostaną zebrane do oddzielnych probówek. Delikatnie zmielić tkankę CAM w mikroprobówce wirówkowej, używając oddzielnej sterylnej igły o rozmiarze 18 dla każdej kolonii. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu kolagenu A 1X i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Odwiruj komórki i tkankę CAM w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze otoczenia. Odessać roztwór kolagenu-A i ponownie zawiesić komórki niekompletne podłoże dla interesującej nas linii komórkowej. Następnie ponownie odwiruj komórki i tkankę.Ponownie zawiesić komórki i kawałki tkanek w jednym mililitrze kompletnego podłoża i współczynnika selekcji, jeśli taki istnieje. Następnie przenieś do pojedynczego 12-dołkowego naczynia do hodowli tkankowej. Przez następny tydzień do trzech tygodni codziennie monitoruj komórki rakowe pod kątem wzrostu i zanieczyszczenia.Gdy komórki osiągną 70 do 80% konfluencji, przenieś je do naczynia hodowlanego o większej objętości. Przejdź do sekwencjonowania lub następnej rundy selekcji, gdy tylko zostanie osiągnięta odpowiednia liczba komórek rakowych. Zarodki wykazujące nagromadzenie komórek rakowych z powodu nieudanego wstrzyknięcia można zobaczyć w większości naczyń włosowatych.Po osiągnięciu optymalnego stężenia komórek i czasu trwania wstrzyknięcia, w piątym dniu po wstrzyknięciu komórki transdukowane powinny wytwarzać szeroką gamę fenotypów kolonii, przy czym większość kolonii jest inwazyjna, o czym świadczą komórki rakowe wyglądające na rozproszone w tkance CAM. Należy zwrócić uwagę na kolonie przerzutowe, które wydają się zwarte i znajdują się na tyle daleko od sąsiednich kolonii, że można je wyciąć kleszczami i nożyczkami oraz jednym kawałkiem tkanki CAM. Izolowane dodatnie trafienie w ekran powinno wyświetlać fenotyp zwartej kolonii po ponownym wstrzyknięciu.W celu pomiaru kontaktów naczyń krwionośnych komórek rakowych należy zwrócić uwagę na jasność zabarwienia ściany naczynia krwionośnego i wstrzyknąć odpowiednią ilość lektyn do sygnału ściany naczynia. Podczas próby skorzystania z tego protokołu należy unikać niedostatecznego lub nadmiernego wstrzyknięcia i usunąć nadmierne krwawienie lub nagromadzenie płynu. Przy użyciu tej techniki zidentyfikowano kilka nowych genów, które napędzają inwazję komórek rakowych u widza.

discovery-metastatic-regulators-using-rapid-quantitative-intravital

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Błona chorioallantoiczna (CAM) zarodka kurczaka stanowi unikalne, naturalnie immunodeficyjne środowisko hodowlane do badania angiogenezy i tumorigenzy. Niniejszy artykuł wideo prezentuje poszczególne etapy hodowli kurczaka ex ovo, aplikację substancji potencjalnie angiogennych oraz skuteczną inokulację komórek i tkanek nowotworowych na powierzchni CAM.

Hodowla kurcząt ex ovo oraz test CAM ex ovo: jak to naprawdę działa

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

W tym filmie opisujemy wszczepianie komórek rakowych na błonę kosmówkowo-omoczniową kurczaka w celu wygenerowania modelu in ovo. Model z powodzeniem wszczepia komórki raka jajnika w celu zbadania progresji raka ginekologicznego.

Modelowanie raka błony moczowo-omoczniowej kurczaka: model in ovo do badania nowotworzenia i przerzutów komórek rakowych

Ten film demonstruje procedurę dożylnego wstrzykiwania komórek rakowych do naczyń krwionośnych błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu wygenerowania modelu przerzutów raka CAM. Wstrzyknięte komórki ostatecznie tworzą rozproszone kolonie pojedynczych komórek nowotworowych, co pozwala na badanie inwazji raka i przerzutów.

Dożylne wstrzyknięcie komórek rakowych do naczyń błony moczowo-omoczniowej kurczaka: procedura mająca na celu ustalenie modelu raka błony moczowo-omoczniowej w celu zbadania inwazji raka i przerzutów

W tym filmie opisujemy izolację przerzutowych kolonii komórek rakowych z błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) kurczaka przy użyciu hodowli jaj bez skorupy. Ta metoda pomaga w badaniach przesiewowych pod kątem czynników, które mogą być odpowiedzialne za przerzuty raka.

Izolacja kolonii komórek rakowych z kurczaka CAM: procedura izolowania komórek rakowych z kultur jaj bez skorupek

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) in ovo jest przeszczepiona świeżymi tkankami nowotworowymi pochodzącymi z mięsaka, ich pojedynczymi zawieszeniami komórkowymi oraz stałymi i przejściowymi fluorescencyjnie znakowanymi liniami komórkowymi mięsaka. Model służy do badania zachowań przeszczepu (żywotność, wskaźnik proliferacji Ki67, martwica, infiltracja) i gospodarza (naciekanie fibroblastów, wrastanie naczyń).

Test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka

Inwazja okołonerwowa jest agresywnym fenotypem dla raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz innych nowotworów. Model błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia został wykorzystany do badania angiogenezy, inwazji raka i przerzutów. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ten model można wykorzystać do oceny inwazji okołonerwowej in vivo.

Błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Test CAM-Delam do oceny zdolności przerzutowej komórek nowotworowych jest stosunkowo szybki, łatwy i tani. Metoda ta może być stosowana do odkrywania mechanizmów molekularnych regulujących powstawanie przerzutów oraz do badań przesiewowych leków. Zoptymalizowany test do analizy próbek ludzkich nowotworów może być metodą kliniczną spersonalizowanego leczenia raka.

Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy protokół rozwoju modelu ksenoprzeszczepu błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) dla ludzkiej tkanki jajnika i demonstrujemy skuteczność tej techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia.

Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika

Poznaj metodę identyfikacji genów hamujących inwazję nowotworową przy użyciu błony nazębnej kurcząt. To podejście umożliwia szybki screening bez zaawansowanych urządzeń do hodowli zwierząt.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Przeglądaj więcej filmów