Obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej
April 23rd, 2021
Przedstawiona metoda umożliwia wizualizację znakowanych fluorescencyjnie białek komórkowych za pomocą mikroskopii ekspansywnej, co prowadzi do rozdzielczości 70 nm na konwencjonalnym mikroskopie.
Ten mikroskopijny protokół ekspansji umożliwia badaczowi wizualizację białek kłębuszków nerkowych z rozdzielczością w nanoskali na konwencjonalnym mikroskopie. Główną zaletą mikroskopii ekspansywnej jest to, że jest ona dostępna dla dużej społeczności naukowej. Zacznij od wykonania przekładek do komory żelowania.
Wytnij szklaną okładkę numer jeden i numer 1,5 wsuwa się w pięciomilimetrowe paski za pomocą noża diamentowego. Umieść szkiełko podstawowe w komorze barwiącej i umieść paski szkiełka nakrywkowego o numerze 1.5 na szkiełku podstawowym tak, aby tworzyły kwadrat o powierzchni 2.5 centymetra. Odpipetować kroplę podwójnie destylowanej wody w rogi kwadratu, aby przykleić paski szkiełka szklanej pokrywy do siebie i do szkiełka podstawowego.
Odczekaj około 20 minut, aby szkiełka nakrywkowe z numerem 1,5 były stabilnie przymocowane. Odmierzyć pipetą kroplę wody na każdym pasku szkiełka nakrywkowego o numerze 1,5. Umieść cztery szklane paski szkiełka nakrywkowego numer jeden na szkiełkach nakrywkowych numer 1.5.
W przypadku pokrywy komory żelowania owiń szklankę nakrywkową folią parafinową, unikając wszelkich fałd lub zabrudzeń na folii. W celu zakotwiczenia należy usunąć PBS z komórek wybarwionych immunologicznie i dodać 250 mikrolitrów buforu kotwiczącego na studzienkę bezpośrednio na szklane szkiełko nakrywkowe. Inkubować płytkę przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.
Trzymaj podłoże w ciemności za pomocą pudełka. Po inkubacji usunąć bufor kotwiczący i przemyć szkiełko nakrywkowe jednorazowo 1,5 mililitra PBS na studzienkę. Aby zabarwić włókna aktynowe, rozmrozić roztwór falloidyny zgodny z EXM i inkubować go przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
W międzyczasie rozpuść akrylan sodu w wodzie podwójnie destylowanej za pomocą mieszadła i przygotuj roztwór monomeru na lodzie. Usuń falloidynę z komórek i umyj je dwukrotnie 1,5 mililitra PBS w temperaturze pokojowej. Pozostaw 1,5 mililitra PBS w studzience po ostatnim praniu.
Za pomocą kleszczy i kaniuli podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki sześciodołkowej i umieść je w komorze żelowania. Dodaj APS do roztworu żelującego i krótko przemieszaj. Pobrać pipetą 200 mikrolitrów roztworu żelującego na próbkę i ostrożnie zamknąć komorę, unikając pęcherzyków powietrza w żelu.
Dodaj wodę do komory barwienia i inkubuj komorę barwienia przez co najmniej godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu polimeryzacji żelu. Wyjmij komorę barwienia z inkubatora. Aby otworzyć pokrywę komory żelowania, włóż żyletkę między pokrywę a przekładkę i ostrożnie zdejmij pokrywę.
Usuń przekładki za pomocą żyletki i odetnij cały dodatkowy żel. Za pomocą pędzla odczep krawędzie żelu. Umieść szkiełko z żelem i szkłem nakrywkowym do naczynia wypełnionego PBS.
Następnie wyjmij oderwaną szklankę nakrywkową z żelu, delikatnie nią potrząsając. Umieść szkiełko pod żelem, aby przymocować żel do szkiełka. Trzymając żel na szkiełku, podziel żel na małe kawałki za pomocą żyletki.
Delikatnie wepchnij jeden kawałek żelu do studzienki na sześciodołkowej płytce ze szklanym dnem i rozłóż ją pędzlem. Użyj pędzla, aby żel był nawilżony niewielką ilością PBS. Używając mikroskopu odwróconego, wykonuj zdjęcia poglądowe z małą aperturą numeryczną dla obrazów przed ekspansją.
Rozcieńczyć proteinazę K do czterech jednostek na mililitr w buforze wytrawiającym, aby uzyskać roztwór wytrawiający. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu wytrawiającego do każdej studzienki i zanurz żel w roztworze. Pozostaw do przetrawienia przez noc w temperaturze pokojowej z zamkniętą pokrywą, aby utrzymać próbki w ciemności.
Usunąć roztwór wytrawiający za pomocą pipety i wyrzucić go. Dodaj jeden mililitr podwójnie destylowanej wody i inkubuj zanurzony żel przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usuń wodę i dodaj jeden mililitr świeżej, podwójnie destylowanej wody.
Kontynuuj wymianę wody co 10 minut, aż do osiągnięcia plateau ekspansji, co spowoduje, że żel stanie się optycznie przezroczysty. Usuń wodę z żelu i natychmiast rozpocznij mikroskopię. Używając odwróconego mikroskopu, użyj obiektywu pneumatycznego o małym powiększeniu, aby znaleźć komórki w stanie przed ekspansją.
Przełącz się na obiektywy 40 x i 63 x, aby uzyskać lepszą rozdzielczość. Wzbudz się interesującą Cię długością fali i zrób zdjęcie za pomocą aparatu. Ten protokół EXM umożliwia nawet czterokrotną rozbudowę.
Aby określić współczynnik rozszerzalności, konieczne jest zobrazowanie komórek przed i po ekspansji. Niewystarczające zakotwiczenie i homogenizacja mogą prowadzić do zniekształceń i pęknięć komórek. Reprezentatywne przykłady pękniętych komórek pokazano tutaj.
Metoda ta może być stosowana do badania kolokalizacji F-aktyny i białek adapterowych aktyny, takich jak podocyna i nefryna. Podocin jest przedstawiony na zielono, aktyna na niebiesko, a nefryna na czerwono. Białe obszary wskazują na kolokalizację.
Intensywność i obfitość sygnału fluorescencyjnego są kluczem do udanego EXM. Skuteczne zakotwiczenie barwników fluorescencyjnych za pomocą ACX ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu. W naszych rękach rozpuszczony ACX jest dobry do trzech do czterech miesięcy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół mikroskopiczny ekspansji umożliwia wizualizację białek kłębuszkowych z rozdzielczością na skalę nanometrów na konwencjonalnym mikroskopie. Metoda ta umożliwia rozdzielczość 70 nm, co czyni ją dostępną dla dużego grona naukowców.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Mikroskopia ekspansyjna poprawia rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii.
- Umożliwia badaczom szczegółową wizualizację białek komórkowych.
- Technika ta jest przyjazna dla użytkownika i dostępna dla wielu naukowców.
- Do identyfikacji określonych białek używa się fluorescencyjnego oznakowania.
Cel badania
- Przedstawić metodę wizualizacji białek kłębuszkowych.
- Dostarczyć protokół, który może być łatwo przyjęty przez naukowców.
- Osiągnąć rozdzielczość na skalę nanometrów przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego.
Stosowane metody
- Przygotowanie elementów rozdzielających do komory żelującej.
- Cięcie szklanych pokrywek mikroskopowych na określone wymiary.
- Przyklejanie pasków pokrywek mikroskopowych do szklanej szklanki za pomocą destylowanej wody.
- Wykorzystanie fluorescencyjnego oznakowania do wizualizacji białek.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja białek kłębuszkowych z rozdzielczością 70 nm.
- Demonstracja dostępności metody dla różnych zastosowań badawczych.
- Walidacja techniki na konwencjonalnym mikroskopie.
- Możliwość szerszej stosowania w badaniach obrazowania komórkowego.
Wnioski
- Mikroskopia ekspansyjna jest cennym narzędziem dla naukowców.
- Metoda ta poprawia możliwości konwencjonalnej mikroskopii.
- Otwiera nowe możliwości do badania szczegółowej struktury komórkowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Expansion microscopy enables nanoscale visualization of podocytic proteins such as nephrin, actin, and podocin using standard fluorescence microscopes, addressing a key bottleneck in early renal target validation. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in glomerular disease models, facilitating more informed portfolio decisions in nephrology drug discovery. The method's accessibility and resolution empower cross-functional teams to interrogate protein localization and interactions critical for translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of podocyte protein networks for mechanistic hypothesis testing.
- Supports functional target validation by visualizing protein colocalization and structural integrity.
- Improves predictive confidence in disease-relevant glomerular models.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated cellular systems for downstream compound screening.
- Enables quantitative assessment of protein abundance and localization for assay standardization.
- Supports reproducibility and scalability by leveraging conventional microscopy infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with translational biomarker strategies in renal disease research.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Reduces biological ambiguity in risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust protein localization studies in glomerular systems, supporting both early target validation and translational research.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by resolving nanoscale protein interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution readouts to compare protein distribution across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical biomarker alignment in renal disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, accessible imaging capability for diverse protein localization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in glomerular target validation.
- Operational Value: Standardizes high-resolution imaging using widely available instrumentation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying protein function and localization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of renal targets and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence and sample preparation for expansion microscopy.
- Needs access to conventional fluorescence microscopy and compatible reagents for gelation and anchoring.
- Demands cross-team standardization of staining and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different cell types or protein targets based on anchoring efficiency.
- Sample distortion or signal loss can occur if anchoring or homogenization steps are suboptimal.
