Name: Obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Poznaj mikroskopię ekspansyjną do wizualizacji białek podocytarnych z rozdzielczością nanometryczną na konwencjonalnym mikroskopie. Ta metoda osiąga 70 nm i jest dostępna dla szerokiej społeczności badawczej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Blanka Duvnjak i Nikola Kuhr za ich doskonałą pomoc techniczną.

1. Dzielenie i rozsiewanie komórek
<ol>
	<li>Rozgrzej sterylną modyfikowaną pożywkę Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), w tym 10% płodową surowicę cielęcą (FCS), sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i sterylną trypsynę do temperatury 37 °C. Aktywuj czystą ławkę.</li>
	<li>Przygotować płytkę 6-dołkową, dodając jedno sterylne szklane szkiełko nakrywkowe (10 mm) do każdego dołka za pomocą sterylnych kleszczyków.</li>
	<li>Umieść 10 cm naczynie do hodowli komórkowych z komórkami Cos7 pod czystą ławką. Pod czystą ławką odessać pożywkę z komórek za pomocą urządzenia próżniowego.</li>
	<li>Trzymaj kątowe naczynie do hodowli komórkowych w jednej ręce i dodaj 10 ml sterylnego PBS na bok naczynia do hodowli komórkowych, aby uniknąć spłukiwania komórek. Odłóż naczynie do hodowli komórkowych tak, aby PBS wypłukał całe naczynie do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Usunąć PBS i dodać 1 ml trypsyny do środka naczynia do hodowli komórkowej i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję trypsynizacji, dodając 10 ml DMEM, w tym 10% FCS i pipetuj roztwór komórkowy w górę iw dół pipetorem, aby ręcznie oddzielić komórki.</li>
	<li>Przeanalizuj liczbę komórek na mililitr za pomocą komory liczącej.</li>
	<li>Wysiewaj 68 000 komórek w podłożu o pojemności 2 ml na studzienkę na szklanych szkiełkach przykrywkowych w płytce 6-dołkowej. Rozprowadź komórki w 6-dołkowej płytce, ostrożnie potrząsając płytką w poziomie i w pionie. 
	UWAGA: Komórki powinny leżeć rozrzucone.</li>
	<li>Inkubować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek
<ol>
	<li>Przygotować dwie sterylne probówki o pojemności 1,5 ml (jedną do rozcieńczonego DNA (A) i jedną do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji lipidów kationowych (B)). Odpipetować 0,75 μ5 μg nefryny i 0,75 μg plazmidu ekspresji cDNA podocyny na studzienkę do jednej probówki o pojemności 1,5 ml i rozcieńczyć do 100 μl zredukowanej pożywki surowicy na studzienkę. Dodać 3 μl kationowego odczynnika do transfekcji lipidów na studzienkę do drugiej probówki o pojemności 1,5 ml i rozcieńczyć 100 μl zredukowanej pożywki surowicy. Inkubować obie reakcje przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Połączyć obie reakcje (A i B) z kompleksem DNA-lipid i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie dodaj 200 μl kompleksu DNA-lipid do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin bez zmiany pożywki.</li>
</ol>
3. Znakowanie immunologiczne struktur komórkowych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający (4% (w/v) paraformaldehydu w PBS, 1 ml / studzienkę), roztwór permeabilizacyjny (0,5% (w/v) Triton X-100 w PBS, 1 ml / studzienkę) i roztwór blokujący (5% (v/v) albumina surowicy bydlęcej w PBS, 1 ml / studzienkę).</li>
	<li>Usuń pożywkę za pomocą urządzenia próżniowego. Dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, aby usunąć dodatkowe podłoże. Całkowicie zassać PBS. 
	UWAGA: Aby uniknąć zmywania komórek za pomocą PBS, upewnij się, że nie pipetujesz PBS bezpośrednio na szklane szkiełko podstawowe.</li>
	<li>Napraw komórki za pomocą 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA) rozpuszczonego w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Alternatywnie, zamocuj komórki w 3% (v/v) glioksaloetanolu18.</li>
	<li>Wyrzuć PFA i umyj komórki dwukrotnie w PBS (po 2 ml każdy), unikając bezpośredniego pipetowania na szkiełka nakrywkowe. Przepuszczalność utrwalonych komórek za pomocą Triton X-100 0,5% (w/v) w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór permeabilizacyjny i przemyć dwukrotnie PBS, jak wskazano w kroku 3.2.</li>
	<li>Zablokuj komórki, dodając 1 ml 5% (v/v) BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować komórki z 200 μl pierwszorzędowego przeciwciała (przeciwciało anty-podocyny 1:200 w 1% (v/v) BSA w PBS) przez noc, w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Alternatywnie inkubować przeciwciało pierwszorzędowe przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć je trzykrotnie PBS, jak w kroku 3.2. Dodawać przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-królicze Alexa 488 1:1000 w 1% (v/v) BSA w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Trzymaj komórki w ciemności za pomocą pudełka.</li>
	<li>Wyrzuć przeciwciało drugorzędowe i przemyj trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Usunąć PBS i inkubować komórki z 200 μl przeciwciała anty-nefrynowego 1:100 w 1% (v/v) BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj trzykrotnie PBS. Trzymaj komórki w ciemności za pomocą pudełka.</li>
	<li>Usunąć PBS i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko śwince morskiej osła 633, 1:200, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj trzykrotnie PBS. Trzymaj komórki w ciemności za pomocą pudełka.</li>
</ol>
4. Mikroskopia ekspansywacyjna
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Aby uformować przekładki do komory żelowania, należy pociąć szklane szkiełka nakrywkowe #1.0 i #1.5 na paski o średnicy 5 mm (po cztery na szkiełko) za pomocą noża diamentowego. Umieść paski szkiełka nakrywkowego #1,5 mm tak, aby tworzyły kwadrat o długości 2,5 cm na szkiełku podstawowym i umieść je w komorze barwienia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A1-C1). Odpipetuj kroplę ddH2O w rogi kwadratu, aby przykleić paski szkiełka szklanej pokrywy do siebie i do szkiełka (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A2-C2).<br />
		UWAGA: Unikać całkowitego wyschnięcia ddH2O, ponieważ spowoduje to utratę siły przylegania. W razie potrzeby nałóż więcej kropel ddH2O. Odczekaj około 20 minut, aby szkiełka nakrywkowe #1,5 mm były stabilnie przymocowane przed rozpoczęciem kroku 4.1.2.</li>
		<li>Umieść cztery szklane paski szkiełka nakrywkowego #1.0 na szkiełku nakrywkowym #1.5 mm. Przyklej paski, pipetując kroplę na każdym pasku szkiełka nakrywkowego #1,5 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A3-C3). 
		UWAGA: Grubość żelu powinna wynosić co najmniej 0,15 mm, aby ułatwić obsługę w trakcie trwania protokołu. Jednak, aby uniknąć nadmiernej ilości żelu na wierzchu komórek, utrzymuj wysokość przekładek blisko podłoża komórki. Używając pasków szkiełka nakrywkowego #1.5 i #1.0 jako przekładek, wysokość przekładek wyniesie około 0,3 mm. Ogniwa przylegają do szkła nakrywkowego (wysokość 0,12 mm). Dlatego żel będzie wystarczająco gęsty, aby sobie z nim poradzić, ale unika się nadmiaru żelu na wierzchu komórek, używając szklanych pasków #1.0 i #1.5 jako przekładek.</li>
		<li>W przypadku pokrywy komory żelowania owiń szklankę nakrywkową (#1.5) folią parafinową. Unikaj wszelkich fałd i zabrudzeń na folii parafinowej (Rysunek 2A5-C5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kotwienie i polimeryzacja (żelowanie)
	<ol>
		<li>Przygotować bufor kotwiący (patrz tabela 1). W celu zakotwiczenia należy zastąpić PBS 250 μl buforu kotwiczącego na studzienkę bezpośrednio na szklanym szkiełku nakrywkowym i inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Utrzymuj podłoże w ciemności za pomocą pudełka. 
		UWAGA: Alternatywnie inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Do każdego eksperymentu przygotuj świeży bufor kotwiczący i odczekaj 10-15 minut, aż prawidłowo się rozpuści. Kwas 6-((Akrylo)amino)heksanowy, ester sukcynimidylowy (AcX) należy wymieniać co 4-5 miesięcy, aby zapewnić odpowiednie zakotwiczenie.</li>
		<li>Usunąć bufor kotwiczący i przemyć raz 1,5 ml PBS na studzienkę.</li>
		<li>Aby zabarwić włókna aktynowe, rozmrozić roztwór falloidyny zgodny z ExM i inkubować falloidynę (5 μl falloidyny rozcieńczonej w 195 μl 1% (v/v) BSA w PBS/studzienkę) przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przechowuj próbki w ciemności za pomocą pudełka.</li>
		<li>W międzyczasie rozpuścić akrylan sodu w ddH2O za pomocą mieszadła. Na lodzie przygotować roztwór monomeru (patrz Tabela 1). 
		UWAGA: Rozpuszczony akrylan sodu powinien być przezroczystym i bezbarwnym roztworem. Jeśli roztwór jest żółty, zastąp go nowym akrylanem sodu.</li>
		<li>Przygotować roztwór żelujący na lodzie (patrz Tabela 1). Odpipetować nadtlenek amonu (APS) do roztworu żelującego tuż przed nałożeniem roztworu żelującego do komory żelowania.</li>
		<li>Usuń falloidynę z komórek i przemyj 1,5 ml PBS dwukrotnie w temperaturze pokojowej. Pozostawić 1,5 ml PBS w studzience, aby ułatwić usunięcie próbki ze szklanego szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Umieścić komórki na szkle nakrywkowym w komorze żelowania za pomocą kleszczyków i kaniuli, aby podnieść szkiełko nakrywkowe z płytki 6-dołkowej. 
		UWAGA: Komórki powinny znajdować się na wierzchu szklanego szkiełka nakrywkowego. Szkiełko nakrywkowe nie powinno dotykać przekładek.</li>
		<li>Dodaj APS do roztworu żelującego i krótko przemieszaj. Pobrać pipetą 200 μl roztworu żelującego na próbkę (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 2A4-C4). Ostrożnie zamknij komorę żelowania, unikając pęcherzyków powietrza w żelu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A5-C5).</li>
		<li>Inkubować komorę żelowania przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu polimeryzacji żelu w komorze barwienia na mokro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja (trawienie)
	<ol>
		<li>Wyjmij komorę barwienia z inkubatora. Aby otworzyć pokrywę komory żelowania, należy umieścić żyletkę między pokrywą a przekładką. Ostrożnie zdejmij pokrywę. Usuń przekładki za pomocą żyletki i wyeliminuj cały dodatkowy żel, przecinając go żyletką.</li>
		<li>Umieść szkiełko z żelem i szkłem nakrywkowym do naczynia wypełnionego PBS. Delikatnie wstrząsając, wyjmij oderwane szkło nakrywkowe z żelu. Aby łatwo usunąć żel z naczynia, umieść szkiełko pod żelem, aby przymocować żel do szkiełka.</li>
		<li>Mając żel na szkiełku, podziel żel na małe kawałki (ćwiartka żelu jest podzielona na dwie do trzech części) za pomocą żyletki. Delikatnie wepchnij jeden kawałek żelu do dołka 6-dołkowej płytki ze szklanym dnem i zawiń go pędzlem. Utrzymuj żel nawilżony niewielką ilością PBS za pomocą pędzla, aby uniknąć odwodnienia żelu. 
		UWAGA: Komórki są skierowane w dół.</li>
		<li>Używając mikroskopu odwróconego, wykonaj zdjęcia poglądowe z małą aperturą numeryczną, aby określić współczynnik rozszerzalności po rozprężeniu.</li>
		<li>Przygotować bufor do wytrawiania (patrz tabela 1). Rozcieńczyć proteinazę K do 4 U/ml w buforze wytrawiającym, aby otrzymać roztwór trawiący. 
		UWAGA: Bufor trawienny bez proteinazy K może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 500 μl roztworu wytrawiającego i zanurzyć żel w roztworze. Pozostaw do strawienia przez noc w temperaturze pokojowej i zamknij pokrywkę, trzymając próbki w ciemności. 
		UWAGA: Alternatywnie pozostaw do strawienia w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ekspansja
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór wytrawiający za pomocą pipety i wyrzucić go. Dodać 1 ml ddH2O. Inkubować zanurzony żel przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń wodę i dodaj 1 ml świeżego ddH2O. Odczekaj 10 minut i kontynuuj wymianę wody co 10 minut, aż do osiągnięcia plateau ekspansji. 
		UWAGA: Możliwe jest 4,5-krotne rozszerzenie próbki. Żel staje się optycznie przezroczysty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowania
	<ol>
		<li>Usuń wodę z żelu i natychmiast rozpocznij mikroskopię. Używając mikroskopu odwróconego, należy przede wszystkim użyć obiektywu pneumatycznego (małe powiększenie), aby znaleźć zobrazowane komórki w stanie przed ekspansją (krok 4.3.4).</li>
		<li>Przełącz się na obiektyw 40x (olej/woda) i 63x, aby uzyskać lepszą rozdzielczość. Wzbudz się interesującą Cię długością fali i zrób zdjęcie za pomocą aparatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>walidacja
	<ol>
		<li>Wykonaj obraz poglądowy próbki. Znajdź i dopasuj te same struktury w próbce, które zostały zobrazowane w kroku 4.3.4. Do walidacji użyj kanału o najlepszym stosunku sygnału do szumu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3 A-B). 
		UWAGA: Dostosuj parametry obrazowania, aby uzyskać podobną jasność, jak na obrazie uzyskanym w stanie nierozszerzonym (krok 4.3.4).</li>
		<li>Nakładaj obrazy przed i po rozszerzeniu, obracając je i przesuwając za pomocą ImageJ. Użyj narzędzia do pomiaru odległości w ImageJ, aby zmierzyć odległości między łatwo rozpoznawalnymi strukturami. Zmierz co najmniej 10 różnych struktur. 
		UWAGA: Alternatywnie, użyj skryptu Pythona do mierzenia odległości zgodnie z opisem w14.</li>
		<li>Oblicz współczynnik rozszerzalności, dzieląc pomiary po i przed rozprężaniem.</li>
		<li>Aby określić zniekształcenia, należy wykonać zdjęcia z większą aperturą numeryczną (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A-B). Nałóż te obrazy i przeanalizuj je za pomocą ImageJ lub zgodnie z opisem w15. 
		UWAGA: Oznaczanie zniekształceń powinno być wykonywane rutynowo, ale niekoniecznie na każdej próbce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts%3A+a+collaborative+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li>
<li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+up%3A+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+nephrin%2C+podocin%2C+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li>
<li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li>
<li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8(2003).</li>
<li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPHS2%2C+encoding+the+glomerular+protein+podocin%2C+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li>
<li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li>
<li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+principles+and+uses+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396(2018).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li>
<li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56(2018).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona metoda umożliwia badaczowi wizualizację białek komórkowych, np. podocyny, nefryny oraz składników cytoszkieletu, np. F-aktyny. W ramach tego protokołu transfekowane komórki cos7 są wykorzystywane jako model do badania interakcji białek membrany szczelinowej z F-aktyną. Niestety, unieśmiertelnione linie komórkowe podocytów nie wyrażają wystarczających endogennych ilości białek diafragmy szczelinowej19.
Dzięki tej metodzie białka komórkowe mogą być wizualizo...

Albuminuria jest zastępczym parametrem ryzyka sercowo-naczyniowego i wynika z przerwania filtra kłębuszkowego1. Filtr kłębuszkowy składa się z okienkowanego śródbłonka, błony podstawnej kłębuszków nerkowych i membrany szczelinowej utworzonej przez podocyty. Pierwotne i wtórne wyrostki stopy podocytów owijają się wokół ściany naczynia włosowatego kłębuszka nerkowego2. Delikatna struktura wyrostków stopy jest utrzymywana przez korowe wiązki aktyny, które służą również jako kotwice dla wielu białek przepony szczelinowej i innych białek adaptorowych2. Białko szkieletowe przepony szczelinowej nazywa się nefryną i oddziałuje w sposób homofilny z cząsteczkami nefryny przeciwstawnych podocytów. Poprzez różnorodne białka adaptorowe, nefryna jest połączona z cytoszkieletem aktyny2,3. Mutacje w genie NPHS1 kodującym nefrynę prowadzą do zespołu nerczycowego typu fińskiego4.
Jednym z białek oddziałujących na nefrynę jest podocyna, białko podobne do spinki do włosów z rodziny stomatyny3. Podocin rekrutuje nefrynę do tratw lipidowych i łączy ją z cytoszkieletem aktynowym 5. Podocin jest kodowany przez gen NPHS2. Mutacje w NPHS2 prowadzą do steroidoopornego zespołu nerczycowego6.
Aby uwidocznić i kolokalizować białka adaptorowe aktyny, można zastosować techniki immunofluorescencji. Niestety, bariera dyfrakcyjna światła ogranicza rozdzielczość konwencjonalnych mikroskopów fluorescencyjnych do 200-350 nm7. Nowatorskie techniki mikroskopowe, np. wymuszone zubożenie emisji (STED)8, mikroskopia lokalizacyjna aktywowana foto (PALM)9, stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM lub dSTORM) lub mikroskopia delecji w stanie podstawowym, po której następuje powrót pojedynczej cząsteczki (GSDIM)9,10,11, umożliwiają uzyskanie rozdzielczości do około 10 nm. Jednak te techniki super rozdzielczości wymagają bardzo drogich mikroskopów, dobrze wyszkolonego personelu i dlatego nie są dostępne w wielu laboratoriach.
Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM) to nowatorska i prosta technika, która umożliwia obrazowanie w super rozdzielczości za pomocą konwencjonalnych mikroskopów i jest potencjalnie dostępna dla dużej społeczności badawczej12. W mikroskopii ekspansji retencji białek (proExM) próbka będąca przedmiotem zainteresowania (komórki lub tkanka) jest utrwalana i barwiona fluoroforami13. Białka w próbce są następnie kowalencyjnie zakotwiczone przez małą cząsteczkę (kwas 6-(((akryloilo)amino)heksanowy, ester sukcynimidylowy, AcX) w pęczniejącym hydrożelu13. Poprzez trawienie enzymatyczne z proteinazą K (ProK), białka i fluorofory utrzymują swoją względną pozycję w żelu po rozprężeniu13. Po pęcznieniu żelu próbka rozszerza się do 4,5-krotności (90-krotne rozszerzenie objętościowe), co prowadzi do efektywnej rozdzielczości bocznej około 60-70 nm (300 nm/4,5). Modyfikacje tej techniki mogą nawet pozwolić na 10-krotne rozszerzenie (1000-krotne rozszerzenie objętościowe), co daje rozdzielczość 20-30 nm na konwencjonalnych mikroskopach14,15,16.
Struktury kłębuszkowe nerek myszy i człowieka zostały zobrazowane za pomocą ExM17. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół proExM do wizualizacji obrazów F-aktyny i białka adaptera aktyny podocyny w super rozdzielczości w komórkach przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego.

<table><tbody><tr><td>Akrylamid >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 6-((Akrylo)amino)heksanowy, ester sukcynimidylowy, Akryloil-X, SE</td><td>invitrogen</td><td>A-20770</td><td>przechowywać do 4 miesięcy</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Deckgl&auml; ser (okulary nakrywkowe)</td><td>Engelbrecht</td><td>K12432</td><td>24x32mm #1.0</td></tr><tr><td>Frez Diamont</td><td>VWR</td><td>201-0392</td><td>do cięcia szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Guanidine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272-100G</td><td>8M Kolbę można przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Marten pędzel do włosów</td><td>Leon Hardy</td><td>3 (770)</td><td></td></tr><tr><td>"Menzel" Deckgl&auml; ser (okulary nakrywkowe)</td><td>Thermo Fischer&nbsp;</td><td>15654786</td><td>24x24mm #1,5</td></tr><tr><td>N,N'-metylenobisakryloamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Objekttr&auml; ger UniMark</td><td>Marienfeld</td><td>703010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Akrylan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408220</td><td>sprawdź czystość&nbsp;</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> barwiąca <td>wyprodukowana w warsztacie uniwersyteckim</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>ROTH</td><td>2367.1</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe szklane płytki denne</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actin-ExM 546&nbsp;</td><td>chrometra</td><td>niedostępna</td><td>1:40</td></tr><tr><td>Anti Podocin wyprodukowany w króliku</td><td>Sigma</td><td>P-0372-200UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Osioł anty świnka morska CF633</td><td>Sigma</td><td>SAB4600129-50UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Koza anty królik 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11034</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Świnka morska anty nefryna</td><td>Origene</td><td>BP5030</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AXIO Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>niedostępny</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Zakłócenie filtra kłębuszkowego składającego się ze śródbłonka kłębuszków nerkowych, błony podstawnej kłębuszków nerkowych i podocytów, powoduje albuminurię. Wyrostki stopy podocytów zawierają wiązki aktyny, które wiążą się z białkami adaptorowymi cytoszkieletu, takimi jak podocyna. Te białka adaptorowe, takie jak podocyna, łączą szkielet przepony szczeliny kłębuszkowej, takiej jak nefryna, z cytoszkieletem aktyny. Badanie lokalizacji i funkcji tych i innych białek podocytarnych jest niezbędne do zrozumienia roli filtra kłębuszkowego w zdrowiu i chorobie. Prezentowany protokół umożliwia użytkownikowi wizualizację aktyny, podocyny i nefryny w komórkach za pomocą obrazowania w super rozdzielczości na konwencjonalnym mikroskopie. Najpierw komórki są barwione konwencjonalną techniką immunofluorescencji. Wszystkie białka w próbce są następnie kowalencyjnie zakotwiczone w pęczniejącym hydrożelu. Poprzez trawienie proteinazą K białka strukturalne są rozszczepiane, co pozwala na izotropikalne pęcznienie żelu w ostatnim etapie. Dializa próbki w wodzie powoduje 4-4,5-krotne rozszerzenie próbki, a próbka może być obrazowana za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego, co daje potencjalną rozdzielczość 70 nm.

Koncepcja i harmonogram tego protokołu proExM przedstawione są na Rysunku 1. W 5. dniu komórki poddane transfekcji są utrwalane i barwione fluorescencyjnymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko białku zainteresowania (Rysunek 1A,B). W 6. dniu traktowanie AcX prowadzi do powstania grup aminowych we wszystkich białkach (w tym w fluoroforach) (Rysunek 1A,B)<sup class="...

Przedstawiona metoda umożliwia wizualizację znakowanych fluorescencyjnie białek komórkowych za pomocą mikroskopii ekspansywnej, co prowadzi do rozdzielczości 70 nm na konwencjonalnym mikroskopie.

Obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Ten mikroskopijny protokół ekspansji umożliwia badaczowi wizualizację białek kłębuszków nerkowych z rozdzielczością w nanoskali na konwencjonalnym mikroskopie. Główną zaletą mikroskopii ekspansywnej jest to, że jest ona dostępna dla dużej społeczności naukowej. Zacznij od wykonania przekładek do komory żelowania.Wytnij szklaną okładkę numer jeden i numer 1,5 wsuwa się w pięciomilimetrowe paski za pomocą noża diamentowego. Umieść szkiełko podstawowe w komorze barwiącej i umieść paski szkiełka nakrywkowego o numerze 1.5 na szkiełku podstawowym tak, aby tworzyły kwadrat o powierzchni 2.5 centymetra. Odpipetować kroplę podwójnie destylowanej wody w rogi kwadratu, aby przykleić paski szkiełka szklanej pokrywy do siebie i do szkiełka podstawowego.Odczekaj około 20 minut, aby szkiełka nakrywkowe z numerem 1,5 były stabilnie przymocowane. Odmierzyć pipetą kroplę wody na każdym pasku szkiełka nakrywkowego o numerze 1,5. Umieść cztery szklane paski szkiełka nakrywkowego numer jeden na szkiełkach nakrywkowych numer 1.5.W przypadku pokrywy komory żelowania owiń szklankę nakrywkową folią parafinową, unikając wszelkich fałd lub zabrudzeń na folii. W celu zakotwiczenia należy usunąć PBS z komórek

imaging-podocytic-proteins-nephrin-actin-podocin-with-expansion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie opisujemy metodę zwaną patologią ekspansji, wariant mikroskopii ekspandywnej, w którym kliniczne próbki tkanek są chemicznie ekspandowane za pomocą sieci polimerowej do mikroskopowego badania struktur w nanoskali.

Patologia ekspansji: metoda obrazowania optycznego w wysokiej rozdzielczości klinicznych próbek tkanek

Zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia w podocytach są jednym z najważniejszych sposobów kontrolowania funkcji filtracji kłębuszków nerkowych. W tym miejscu wyjaśniamy podejście o wysokiej przepustowości, które umożliwia wykrywanie obchodzenia się z wapniem w czasie rzeczywistym i aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych.

Analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Obrazowanie klinicznych próbek tkanek w nanoskali może pomóc lepiej zrozumieć patogenezę choroby. Patologia ekspansji (ExPath) to wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), zmodyfikowana pod kątem kompatybilności ze standardowymi klinicznymi próbkami tkanek, w celu zbadania konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Obrazowanie nanoskopowe skrawków tkanek ludzkich poprzez ekspansję fizyczną i izotropową

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Prezentowana jest tutaj nowa wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), Magnify, która jest zmodyfikowana do 11-krotnej ekspansji, zachowując szeroki wachlarz klas biomolekuł i jest kompatybilna z szerokim zakresem typów tkanek. Umożliwia badanie konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

Ten manuskrypt opisuje dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skóry poprzez episomalne przeprogramowanie w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i późniejsze różnicowanie w podocyty.

Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Poznaj mikroskopię ekspansyjną do wizualizacji białek podocytarnych z rozdzielczością nanometryczną na konwencjonalnym mikroskopie. Ta metoda osiąga 70 nm i jest dostępna dla szerokiej społeczności badawczej.

Obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Przeglądaj więcej filmów