Name: Mysi model przewlekłego zapalenia trzustki poprzez infuzję TNBS z dróg żółciowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną technikę infuzji TNBS do dróg żółciowych w celu generowania myszego modelu przewlekłego zapalenia trzustki. Ta metoda umożliwia badanie neuropatycznego bólu i fibrozy trzustki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Departament ds. Weteranów (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536), a Narodowy Instytut Zdrowia przyznaje granty #1R01DK105183, DK120394 i DK118529 dla HW. Dziękujemy dr Hongju Wu za podzielenie się doświadczeniem technicznym.

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnych Komitetów ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny oraz Centrum Medycznego Ralpha H. Johnsona. W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J w wieku 8-10 tygodni. Myszy trzymano w standardowym cyklu 12 jasnych / 12 ciemnych z dostępem ad libitum do pożywienia i wody.
1. Przygotowanie roztworu TNBS do wstrzykiwań
<ol>
	<li>Przygotuj 10% etanol w 0,9% soli fizjologicznej. Rozpuścić podstawowy TNBS (patrz tabela materiałów) w 10% etanolu do końcowego stężenia 7,5 mM, dodając 7,5 μl TNBS do 1 ml 10% etanolu. 
	UWAGA: TNBS stanowi zagrożenie chemiczne. Przygotuj roztwór pod wyciągiem i używaj środków ochrony osobistej, takich jak rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z TNBS.</li>
	<li>Załaduj 50 μl 0,75% roztworu TNBS do strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 31. Załadować 50 μl 10% etanolu w soli fizjologicznej do strzykawki o tym samym rozmiarze, co układ sterowania pojazdu. Umieścić strzykawki na lodzie i chronić je przed światłem do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i operacja myszy
<ol>
	<li>Ogolić włosy z obszaru chirurgicznego jamy brzusznej.</li>
	<li>Należy wstrzyknąć jedną dawkę zapobiegawczą leku przeciwbólowego (np. buprenorfiny 0,1 mg/kg i.p.) przed zabiegiem chirurgicznym.</li>
	<li>Indukuj i utrzymuj mysz w znieczuleniu ogólnym za pomocą 1,5-2% izofluranu i 1 l/min tlenu. Potwierdź znieczulenie, szczypiąc palce u nóg i obserwując zwierzę pod kątem braku odruchu.</li>
	<li>Umieść mysz na podgrzewanej podkładce chirurgicznej podczas operacji. Nałóż maść weterynaryjną na każde oko, gdy mysz jest pod narkozą.</li>
	<li>Zdezynfekuj pole operowane, przecierając pole operacyjne 3x 2% jodem, a następnie 70% alkoholem (tabela materiałów).</li>
	<li>Wykonaj laparotomię mikronożyczkami, aby wygenerować nacięcie o długości 0,5-1 cm.</li>
	<li>Delikatnie odsłoń dwunastnicę i zlokalizuj wspólny przewód żółciowy za pomocą bawełnianych wacików (tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść prosty mikroklips hemo (tabela materiałów) na bliższym wspólnym przewodzie, aby zapobiec przepływowi TNBS lub roztworów nośnika do wątroby i pęcherzyka żółciowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A, B).</li>
	<li>Delikatnie odsłonić dwunastnicę i wprowadzić igłę do przewodu trzustkowego przez brodawkę Vatera.</li>
	<li>Gdy igła znajdzie się w kanaliku, umieść zakrzywiony mikroklips do hemo (Tabela materiałów) nad dwunastnicą otaczającą igłę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A), aby zabezpieczyć igłę na miejscu i zapobiec przedostawaniu się wstrzykniętego roztworu do dwunastnicy.</li>
	<li>Stopniowo wstrzykiwać roztwór (TNBS lub nośnik) do przewodu trzustkowego w ciągu jednej minuty. 
	UWAGA: TNBS należy podawać powoli przez jedną minutę i łatwo jest kontrolować prędkość infuzji, gdy trzustka jest perfundowana za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 5/16 cala i igłą 31G. Trzymaj rękę tak stabilnie, jak to możliwe, aby uniknąć nakłucia przewodu żółciowego. Jeśli TNBS zostanie pomyślnie wstrzyknięty, wewnątrz trzustki może być widoczny żółty kolor.</li>
	<li>Po infuzji ostrożnie zdejmij mikrozacisk w pobliżu wątroby, a następnie usuń mikrozacisk przytrzymujący igłę i dwunastnicę.</li>
	<li>Ostrożnie przywróć dwunastnicę do pierwotnej pozycji.</li>
	<li>Pozostaw 0,5 ml ciepłej sterylnej soli fizjologicznej (36-37 °C) w jamie brzusznej przed zamknięciem, aby pomóc dwunastnicy powrócić do pierwotnej pozycji i pomóc w odzyskaniu perystaltyki.</li>
	<li>Zamknij nacięcie w warstwie mięśniowej za pomocą ciągłego szwu 5-0. Zamknij skórę za pomocą przerywanego szwu ze szwem 4-0.</li>
	<li>Umieść klatkę zawierającą myszy na poduszce grzewczej, aby umożliwić powrót do zdrowia po znieczuleniu.</li>
	<li>Upewnij się, że myszy są ciepłe i zdolne do spontanicznych ruchów przed powrotem do pomieszczenia trzymania.</li>
	<li>Kontynuuj podawanie leku przeciwbólowego (np. buprenorfiny 0,1 mg/kg domięśniowo) co 12 godzin i dodatkowego ogrzewania przez 48 godzin po zabiegu.</li>
</ol>
3. Monitorowanie zachowania myszy
<ol>
	<li>Usuń szwy w 7 dniu po operacji.</li>
	<li>Monitoruj zdrowie i zachowanie myszy codziennie w pierwszym tygodniu po operacji. Zwracaj uwagę na oznaki niepokoju, takie jak wokalizowanie, zgarbiona postawa pleców lub zmniejszona lokomocja. Mierz masę ciała co drugi dzień.</li>
	<li>Użyj monofili von Freya (VFFs) do pomiaru nadwrażliwości mechanicznej brzucha przed i 2, 3 tygodnie po operacji zgodnie z opisem9,14.
	<ol>
		<li>Zastosuj VFF o różnych przyłożonych siłach w kolejności rosnącej do górnej części brzucha 10 razy co 1-2 s. Rozważ podnoszenie, cofanie lub lizanie brzucha (reakcja wycofania) jako pozytywną reakcję.</li>
		<li>Zastosuj silniejszy bodziec, jeśli nie zaobserwuje się pozytywnej odpowiedzi, i słabszy bodziec, jeśli zaobserwuje się pozytywną reakcję. Próg wycofania to siła, przy której mysz reaguje w 50% przypadków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pobieranie i analiza histologiczna tkanki trzustki
<ol>
	<li>Poświęć myszy pod narkozą przez zwichnięcie szyjki macicy i ostrożnie wypreparuj trzustkę z jelita i innych narządów.</li>
	<li>Utrwal trzustkę w 10% paraformaldehydzie na 24 godziny, zanurz w parafinie, wytnij skrawki tkanki o grubości 5 μm i umieść je na szkiełkach w celu barwienia.</li>
	<li>Wykonaj barwienie hematoksyliny-eozyny i trichromu Massona przy użyciu standardowych metod, jak wcześniej podano4.</li>
</ol>

<ol><li>Klauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+induced+vs.+classical+animal+models+of+chronic+pancreatitis%3A+a+critical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison.</a> The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).</li>
<li>Liao, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+2+is+involved+in+%C2%B5-opioid+receptor+suppression+in+the+spinal+dorsal+horn+in+a+rat+model+of+chronic+pancreatitis+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain.</a> Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).</li>
<li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+activity+governs+increased+susceptibility+to+pancreatitis+in+mice+expressing+human+PRSS1R122H%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Stem+Cell+Therapy+Mitigates+Chronic+Pancreatitis+via+Differentiation+into+Acinar-like+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice.</a> Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).</li>
<li>Aghdassi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+investigating+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+and+Tissue+Repair%22%5BJournal%5D)">Animal models for investigating chronic pancreatitis.</a> Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26(2011).</li>
<li>Scoggins, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-dependent+acinar+cell+apoptosis+triggers+epithelial+proliferation+in+duct-ligated+murine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).</li>
<li>Bradley, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+duct+pressure+in+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis.</a> The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).</li>
<li>Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+pancreatitis%3A+can+it+be+translated+to+human+pain+study%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study.</a> World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).</li>
<li>Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+behavioral+changes+in+nociception+in+a+novel+rat+model+of+chronic+pancreatitis+for+the+study+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain.</a> Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).</li>
<li>Cattaruzza, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+ankyrin+1+mediates+chronic+pancreatitis+pain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+insular+cortex+mediates+hyperalgesia+induced+by+chronic+pancreatitis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats.</a> Molecular Brain. 12 (1), 76(2019).</li>
<li>Puig-Diví, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+pancreatic+disease+by+trinitrobenzene+sulfonic+acid+infusion+into+rat+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts.</a> Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX4+Gene+Transfer+Induces+alpha-to-beta+Cell+Phenotypic+Conversion+and+Confers+Therapeutic+Benefits+for+Diabetes+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment.</a> Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).</li>
<li>Ceppa, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+proteases+mediate+inflammatory+pain+in+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).</li>
<li>Puig-Divi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+pancreatic+disease+by+trinitrobenzene+sulfonic+acid+infusion+into+rat+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts.</a> Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).</li>
<li>Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitability+and+suppression+of+A-type+K%2B+current+of+pancreas-specific+afferent+neurons+in+a+rat+model+of+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).</li>
<li>Drewes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+in+chronic+pancreatitis%3A+the+role+of+neuropathic+pain+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms.</a> Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Wlew TNBS do przewodu żółciowego w celu wywołania przewlekłego zapalenia trzustki jest technicznie trudny u myszy, ponieważ do 22,5% myszy może umrzeć w ciągu 3-4 dni od infuzji leku10. W tym przypadku raport ten udoskonalił procedurę w oparciu o wcześniejsze badania i zmniejszył wczesną śmiertelność myszy do <10%. Na przykład zwiększona objętość leku (z 35 μl do 50 μl) może zapewnić, że leki dotrą do całej trzustki. Używanie strzykawki insulinowej i igły o mniejszym rozmiarze (31G) zmniejsza pote...

Przewlekłe zapalenie trzustki (CP) jest przewlekłą chorobą zapalną charakteryzującą się zanikiem trzustki, zwłóknieniem, bólem brzucha i ostateczną utratą zarówno funkcji zewnątrzwydzielniczych, jak i hormonalnych1. Obecne leczenie medyczne i chirurgiczne nie jest lecznicze, ale jest podejmowane w celu złagodzenia objawów, które są konsekwencją choroby: opornego na leczenie bólu brzucha, dysfunkcji endokrynologicznej i zewnątrzwydzielniczej. Dlatego pilnie potrzebne są skuteczniejsze metody leczenia2. Modele zwierzęce stanowią niezbędne narzędzie do lepszego zrozumienia choroby i zbadania potencjalnych metod terapeutycznych3. Opracowano wiele mysich modeli CP, z których powszechnie stosuje się modele ceruleiny i/lub alkoholu. Wykazano, że ceruleina, oligopeptyd stymulujący wydzielanie trzustki, w sposób powtarzalny indukuje model CP obejmujący między innymi zanik trzustki, zwłóknienie4. Inny popularny model wykorzystuje seryjne wstrzyknięcia L-argininy, która powoduje niewydolność zewnątrzwydzielniczą podobną do obserwowanej u ludzi5. CP może być również wywołany przez całkowite lub częściowe podwiązanie przewodu trzustkowego, a także nadciśnienie w przewodzie trzustkowym6,7. Pomimo różnorodności modeli zwierzęcych dostępnych dla MPD, żaden z tych modeli nie odtwarza skutecznie bólu brzucha doświadczanego przez pacjentów z MPD8.
Poprzednie badania wykazały, że miejscowe wstrzyknięcie kwasu 2,4,6 -trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) do trzustki odwzorowuje uporczywy ból odczuwany przez pacjentów z CP9,10,11. Myszy leczone TNBS wykazywały nadwrażliwość brzucha i zwiększone zachowania związane z bólem, a także "uogólnioną nadwrażliwość" na bolesne bodźce, zjawisko, które zaobserwowano u pacjentów z CP10. Oprócz dokładnego naśladowania bólu CP, model TNBS replikuje również inne patologiczne cechy ludzkiego stanu, takie jak zwłóknienie, naciekanie komórek jednojądrzastych i zastępowanie komórek groniastych tkanką tłuszczową10,12. Jednak infuzja TNBS przez drogi żółciowe jest technicznie trudną procedurą u myszy, która może spowodować śmierć. O ile nam wiadomo, nie ma protokołu wizualnego, który pokazywałby, w jaki sposób przeprowadza się wlew do dróg żółciowych. W tym artykule demonstrujemy procedurę infuzji dróg żółciowych TNBS w celu wygenerowania mysiego modelu CP. Ta procedura pomoże wygenerować wartościowe modele zwierzęce do badania CP i innych chorób trzustki i może być wykorzystana do wprowadzania innych materiałów (np. wirusa, komórek) do trzustki13.

<table><tbody><tr><td>10% neutralna buforowana formalina v/v</td><td>Fisher Scientific</td><td>23426796</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki nasączone alkoholem, sterylne</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>System znieczulenia zwierząt</td><td>VetEquip, Inc.</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>Chlorowodorek buprenorfiny, do wstrzykiwań</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absolutny (200 proof), klasa biologii molekularnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo drobne nożyczki do mikro preparacji 4" proste, ostre</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe 4-calowa bardzo delikatna końcówka</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana podkładka</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły Hegar-Baumgartner 5,25 "</td><td>Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.</td><td>RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa z igłą o rozmiarze 31 BD</td><td></td><td>324909</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki do przygotowania jodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Mikroklips do nakładania kleszczy 5,5 "</td><td>Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>Mikro klips, prosty, mocny, zakrzywiony 1x6mm</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5433</td><td></td></tr><tr><td>Mikroklips, prosty, szerokość klipsa 0,75 mm</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5420</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu pikrylosulfonowego, TNBS, 1M w H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>92822-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Szew polipropylenowy 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>Szew polipropylenowy 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 0,9% roztwór dożylny</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>Obłożnik chirurgiczny, sterylny</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta na tkanki</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr><tr><td>Włókna Von Frey</td><td>Bioseb</td><td>EB2-VFF</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model przewlekłego zapalenia trzustki poprzez infuzję tnbs z dróg żółciowych

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Przewlekłe zapalenie trzustki (CP) to złożona choroba obejmująca zapalenie i zwłóknienie trzustki, zanik gruczołów, bóle brzucha i inne objawy. Opracowano kilka modeli gryzoni do badania CP, z których model infuzji kwasu 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) w drogach żółciowych odtwarza cechy bólu neuropatycznego obserwowanego w CP. Jednak wlew leku z dróg żółciowych u myszy jest technicznie trudny. Protokół ten demonstruje procedurę infuzji TNBS do dróg żółciowych w celu wytworzenia mysiego modelu CP. TNBS podawano do trzustki przez bańkę Vatera w dwunastnicy. Protokół ten zoptymalizował objętość leku, techniki chirurgiczne i postępowanie z lekiem podczas zabiegu. Myszy leczone TNBS wykazywały cechy CP odzwierciedlone w zmniejszeniu masy ciała i masy trzustki, zmianach w zachowaniach związanych z bólem i nieprawidłowej morfologii trzustki. Dzięki tej poprawie śmiertelność związana z wstrzyknięciem TNBS była minimalna. Procedura ta ma kluczowe znaczenie nie tylko w generowaniu modeli chorób trzustki, ale jest również przydatna w miejscowym dostarczaniu leków trzustkowych.

Procedury wlewu do przewodu żółciowego zostały zoptymalizowane w celu zmniejszenia śmiertelności myszy związanej z tym zabiegiem10. TNBS podawano początkowo w całkowitej objętości 35 μL lub 50 μL. Wstrzyknięcie TNBS w objętości 50 μL pozwalało objąć całą trzustkę i indukowało bardziej jednorodny fenotyp choroby (Rycina 1B). Ponadto zastosowanie strzykawki insulinowej z igłą 31G pozwalało na lepszą kontrolę szybkości wlewu w porównaniu ze standardowymi strzykawkami i r...

Przewlekłe zapalenie trzustki (CP) to choroba charakteryzująca się stanem zapalnym i zwłóknieniem trzustki, często związana z nieuleczalnym bólem brzucha. Ten artykuł koncentruje się na udoskonaleniu techniki generowania mysiego modelu CP poprzez infuzję dróg żółciowych z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS).

Mysi model przewlekłego zapalenia trzustki poprzez infuzję TNBS z dróg żółciowych

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

Przewlekłe zapalenie trzustki jest złożoną chorobą obejmującą zapalenie trzustki, zwłóknienie, ból brzucha i inne objawy. Model infuzji TNBS do dróg żółciowych odtwarza ból neuropatyczny obserwowany u pacjentów z przewlekłym zapaleniem trzustki. Ten protokół infuzji TNBS do dróg żółciowych został zoptymalizowany w celu wywołania generowania modelu przewlekłego zapalenia trzustki u myszy.Ponieważ fuzja leków w drogach żółciowych u myszy jest technicznie trudna, jej wizualizacja będzie pomocna dla badaczy nowych w tej metodzie. Przed zabiegiem oraz dwa i trzy tygodnie po nim użyj monofili Von Freya, aby przyłożyć różne poziomy siły w kolejności rosnącej do górnej części brzucha ośmio- do 10-tygodniowej myszy C57 black six, 10 razy przez jedną do dwóch sekund na aplikację. Rozważ zwiększenie retrakcji lub lizania brzucha jako pozytywnej odpowiedzi.Następnie załaduj strzykawkę insulinową wyposażoną w igłę o rozmiarze 31 z 50 mikrolitrami świeżo przygotowanego 0,75-procentowego roztworu TNBS. Załadować drugą strzykawkę z 50 mikrolitrami 10-procentowego etanolu w soli fizjologicznej jako kontrolę pojazdu i umieścić obie strzykawki na lodzie chronionym przed światłem. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, usuń włosy z okolicy brzucha znieczulonej myszy, goląc się lub nakładając krem do depilacji i umieść mysz na rozgrzanej podkładce chirurgicznej pod mikroskopem preparacyjnym.Nałóż maść weterynaryjną na każde oko i zdezynfekuj miejsce operacyjne trzema sekwencyjnymi dwuprocentowymi chusteczkami z jodu i trzema chusteczkami z 70-procentowym etanolem, użyj mikronożyczek, aby wykonać nacięcie od 0,5 do jednego centymetra jednym ciągłym ruchem i użyj bawełnianych wacików, aby delikatnie odsłonić dwunastnicę i zlokalizować wspólny przewód żółciowy. Aby zapobiec przepływowi leku do wątroby i pęcherzyka żółciowego, należy użyć mikroskopu, aby umieścić prosty mikro hemoklin na bliższym wspólnym przewodzie i wprowadzić igłę strzykawki załadowanej TNBS przez brodawkę powozu do przewodu trzustkowego. Użyj zakrzywionego mikro hemokolpupu, aby zabezpieczyć igłę i wlej roztwór do przewodu trzustkowego w ciągu jednej minuty.Po dostarczeniu całego roztworu ostrożnie zdejmij mikrozaciski i potwierdź, że dwunastnica powróciła do swojej pierwotnej pozycji. Przed zamknięciem jamy brzusznej dodaj 500 mikrolitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej o temperaturze od 36 do 37 stopni Celsjusza, aby pomóc dwunastnicy powrócić do pierwotnej pozycji i pomóc w odzyskaniu perystaltyki. Użyj szwu ciągłego ze szwem pięcioma O, aby zamknąć nacięcie w warstwie mięśniowej i zamknij skórę za pomocą szwu przerywanego ze szwem czterech O.Następnie umieść mysz w klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego położenia. Monitoruj zdrowie i zachowanie myszy codziennie w pierwszym tygodniu po operacji pod kątem oznak niepokoju, takich jak wokalizacja, zgarbiona postawa pleców lub ograniczenie lokomocji i mierz masę ciała co drugi dzień. Jak zaobserwowano, wstrzyknięcie 50 mikrolitrów tuszu, jak wykazano, powoduje infiltrację całej trzustki, co pozwala na indukcję bardziej jednorodnego fenotypu choroby.W tej reprezentatywnej analizie, w ciągu pierwszych trzech dni po operacji, myszy w grupie kontrolnej straciły około sześciu procent swojej pierwotnej masy ciała, po czym stopniowo odzyskiwały i przybierały ponad 100% pierwotnej masy ciała do 21 dnia. Natomiast myszy, które otrzymały TNBS, straciły około 15 procent swojej pierwotnej masy ciała w ciągu pierwszych pięciu dni po operacji i odzyskały nieco poniżej 100 procent pierwotnej masy ciała do 21 dnia. W porównaniu z myszami kontrolnymi, zwierzęta, którym wstrzyknięto TNBS, wykazywały zwiększoną nadwrażliwość mechaniczną brzucha w drugim i trzecim tygodniu po operacji.Rozmiar i masa ciała trzustki zostały znacznie zmniejszone u myszy TNBS w porównaniu z trzustką pobraną od zwierząt kontrolnych, co sugeruje wyraźny zanik trzustki u zwierząt leczonych TNBS zgodny z wynikami u ludzi z ciężkim i długotrwałym przewlekłym zapaleniem trzustki. Analiza histologiczna skrawków tkanki trzustki od myszy kontrolnych leczonych etanolem wykazała normalną morfologię, podczas gdy skrawki tkanek myszy leczonych TNBS wykazywały pustą realizację z masywną utratą komórek groniastych, które zostały zastąpione przez naciek komórek tłuszczowych i zwłóknienie. Zapobieganie przedostawaniu się wstrzykniętego TNBS do pęcherza moczowego i jelita jest ważne, ponieważ TNBS ma działanie uszkadzające tkanki.Podczas infuzji należy trzymać rękę tak stabilnie, jak to możliwe, aby uniknąć nakłucia przewodu żółciowego. Oprócz wywoływania rozwoju przewlekłego zapalenia trzustki, ta sztuka infuzji dróg żółciowych myszy może być wykorzystana do rozwoju innych modeli chorób trzustki. Ten mysi model przewlekłego zapalenia trzustki TNBS może być wykorzystany do badania zarówno patogenezy, jak i leczenia przewlekłego zapalenia trzustki, a także innych chorób trzustki.

a-mouse-model-for-chronic-pancreatitis-via-bile-duct-tnbs-infusion

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje procedurę generowania modelu myszy z ostrym żółciowym zapaleniem trzustki poprzez trzustkowy wlew taurocholanu sodu. Model ten pomaga badać zmiany patofizjologiczne wywołane przez taurocholan sodu w trzustce.

Model ostrego żółciowego zapalenia trzustki: metoda generowania mysiego modelu ostrego żółciowego zapalenia trzustki za pomocą infuzji z przewodu trzustkowego

Modele zwierzęce dla ciężkiego ostrego zapalenia trzustki umożliwiają badanie zmian patofizjologicznych na początkowym etapie, ułatwiając obserwację ewolucji zdarzeń zapalnych. Tutaj przedstawiamy protokół indukcji ciężkiego ostrego żółciowego zapalenia trzustki poprzez wsteczny wlew taurocholanu sodu do przewodu trzustkowego znieczulonych myszy C57BL / 6.

Taurocholan sodu wywołał ciężkie ostre zapalenie trzustki u myszy C57BL/6

Mysi model ciężkiego ostrego zapalenia trzustki jest opisany tutaj. Przedstawiona tutaj procedura jest bardzo szybka, prosta i dostępna, co potencjalnie pozwala na badanie mechanizmów molekularnych i różnych interwencji terapeutycznych w ostrym zapaleniu trzustki w wygodny sposób.

Ustanowienie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki przy użyciu wstecznego wstrzyknięcia taurocholanu sodu do przewodu żółciowo-trzustkowego

Stworzyliśmy mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby, który dostarcza odpowiedniego modelu zwierzęcego do mechanistycznego badania atrezji dróg żółciowych (BA) wywołanego przez wirusa i platformy dla przyszłych terapii BA.

Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych

Dootrzewnowe podawanie leków jest bezpiecznym i skutecznym nieinwazyjnym sposobem na wywołanie uszkodzenia trzustki. W badaniu tym porównano pięć różnych protokołów wstrzyknięć dootrzewnowych na myszach w celu wywołania różnego stopnia uszkodzenia trzustki i ustanowiono model ciężkiego uszkodzenia trzustki w celu zbadania zmian patologicznych i strategii leczenia ciężkiego ostrego zapalenia trzustki (SAP).

Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym

Niniejszy protokół opisuje nowatorskie podejście do modelowania przewlekłego obturacyjnego zapalenia trzustki, które polega na wizualizacji przewodu trzustkowego oraz elektrokrzepnięciu przewodu trzustkowego w celu spowoduje jego niedrożności.

Model obturacyjnego przewlekłego zapalenia trzustki ustanowiony poprzez elektrokoagulację

Opisano protokół kaniulacji ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewód Whartona. W tym eksperymencie roztwór błękitu trypanowego został użyty jako barwnik, aby zademonstrować, w jaki sposób technika ta skutecznie dostarcza infuzje do docelowej ślinianki oraz aby wykazać niezawodność tego nowego podejścia jako potencjalnej klinicznej terapii lekowej lub komórkowej w regeneracji ślinianek.

Kaniulacja ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewódna Whartonowski

Opisano metodę wizualizacji i kwantyfikacji trójwymiarowej struktury żyły wrotnej wątroby myszy lub wewnątrzwątrobowych przewodów żółciowych. Tę technikę odlewu żywicznego można zastosować również do innych układów przewodowych lub naczyniowych, co umożliwia wizualizację lub kwantyfikację nienaruszonej architektury komunikacyjnej układu in situ.

Trójwymiarowe odlewanie w żywicy i obrazowanie żyły wrotnej myszy lub wewnątrzpasączniczego systemu przewodów żółciowych

Opisano protokół przewlekłych infuzji glukozy i intralipidów u szczurów. Model ten można wykorzystać do badania wpływu nadmiaru składników odżywczych na funkcjonowanie narządów i parametry fizjologiczne.

Model przewlekłego wlewu składników odżywczych u szczura

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

Poznaj zoptymalizowaną technikę infuzji TNBS do dróg żółciowych w celu generowania myszego modelu przewlekłego zapalenia trzustki. Ta metoda umożliwia badanie neuropatycznego bólu i fibrozy trzustki.

Mysi model przewlekłego zapalenia trzustki poprzez infuzję TNBS z dróg żółciowych

Przeglądaj więcej filmów