Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej
11 lutego 2021
Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.
Model jelitowy jest szeroko adaptowalnym i fizjologicznym sposobem pomiaru nieszczelności jelita i migracji leukocytów w jelicie u myszy in vivo. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw zwiększonej przepuszczalności jelit i patologicznego zapalenia jelit. Technika ta może być wykorzystana do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw funkcji bariery jelitowej i patologicznego stanu zapalnego, jak widać we wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego i chorobie Leśniowskiego-Crohna.
Model ten wykorzystuje dobrze unaczyniony, zewnętrzny odcinek jelita, albo jelita krętego, albo proksymalnej okrężnicy, do badania funkcji bariery jelitowej lub rekrutacji komórek odpornościowych u myszy. Dzięki tak szerokiemu zastosowaniu, model pętli jelitowej może dostarczyć informacji na temat chorób wynikających zarówno z nieszczelnej bariery jelitowej, jak i odpowiedzi zapalnej. Trudności można przezwyciężyć, ćwicząc kroki chirurgiczne.
Niezwykle ważne jest, aby zewnętrzizować w pełni unaczyniony segment jelita i wybrać odpowiednie miejsca dla podwiązania, aby uniknąć krwawienia. Model pętli jelitowej jest techniką mikrochirurgiczną, dlatego też, podobnie jak w przypadku innych zabiegów chirurgicznych, bardzo korzystne jest wizualne pokazanie i prezentacja metody krok po kroku. Po uzyskaniu znieczulenia chirurgicznego należy rozpocząć od wyszorowania sierści linii środkowej brzucha wacikami nasączonymi alkoholem lub gąbką z gazy nasączoną 70% etanolem.
Nie zwilżaj dużego obszaru futra alkoholem, aby zapobiec hipotermii. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej. Wykonaj poziome nacięcie na środku brzucha i odsłoń otrzewną, uważając, aby nie uszkodzić narządów wewnątrzbrzusznych.
Umieść wstępnie przyciętą mokrą bawełnianą gazę na odsłoniętej jamie brzusznej. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby zmobilizować i zewnętrzizować jelito ślepe i ostrożnie umieść je na mokrej bawełnianej gazie. Następnie zmobilizuj i delikatnie zewnętrznij jelito kręte.
Rozłóż co najmniej sześć centymetrów końcowego odcinka jelita krętego na mokrej bawełnianej gazie, nie naruszając naczyń krezkowych i dopływu krwi. Utrzymuj odsłonięte tkanki wilgotne przez cały czas ciepłym HBSS. Zidentyfikuj główną tętnicę zaopatrującą jelito kręte w krezce, w pobliżu jelita ślepego.
Następnie zlokalizuj dwa miejsca podwiązania w krezce, które są wolne od krytycznych naczyń krwionośnych. Mocno chwyć końcowe jelito kręte kleszczami tkankowymi i użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby fenestrować krezkę, unikając naczyń krwionośnych. Umieść jedwabny szew w poprzek perforacji i zawiąż węzeł chirurgiczny, aby utworzyć pierwsze podwiązanie.
Użyj linijki, aby zmierzyć cztery centymetry od pierwszej ligatury i utwórz drugą ligatrę. Ostrożnie przeciąć obok każdego podwiązania cienkimi nożyczkami, aby odizolować czterocentymetrową pętlę jelita krętego, utrzymując nienaruszony dopływ krwi i błonę krezkową. Delikatnie przepłukać zawartość segmentu pętli jelita krętego ciepłym HBSS za pomocą elastycznej żółtej rurki do karmienia dołączonej do 10-mililitrowej strzykawki.
Upewnij się, że zawartość światła została wypłukana z jamy brzusznej, aby utrzymać miejsce operacji w czystości. Podwiązać dwa odcięte końce zaczerwienionej pętli jelita krętego za pomocą jedwabnego szwu. Użyj jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 30, aby powoli wstrzyknąć 250 mikrolitrów odczynnika, takiego jak FITC-dextrans lub chemokina, do światła jelita.
Pętla jelita krętego napompuje się, powodując umiarkowane rozdęcie błony śluzowej. Zamknij ścianę brzucha za pomocą uchwytu na igłę, anatomicznych kleszczyków i niewchłanialnych szwów jedwabnych 3,0 z igłą do odwrotnego cięcia. Po wysuszeniu zwierzęcia, aby zapobiec hipotermii, umieść je w komorze anestezjologicznej o regulowanej temperaturze na okres inkubacji.
Przygotuj mysz do operacji i zewnętrznij jelito ślepe, jak pokazano wcześniej. Za pomocą mokrych bawełnianych wacików zewnętrznij całe jelito kręte i umieść je na mokrej bawełnianej gazie. Zidentyfikuj proksymalną okrężnicę i dopływ krwi znajdujący się w mezookrężnicy.
Zmobilizuj bliższą okrężnicę i utwórz pierwszą ligaturę w obszarze wolnym od naczyń w mezookrężnicy w odległości około 0,5 centymetra dystalnie od jelita ślepego. Zmierz dwa centymetry od pierwszej ligatury i utwórz drugą ligaturę w obszarze wolnym od dopływu krwi w mezokrę. Za pomocą cienkich nożyczek ostrożnie przetnij obok każdego podwiązania, aby wyizolować dwucentymetrową pętlę pcLoop.
Delikatnie przepłucz pcLoop ciepłym HBSS, aby usunąć kał za pomocą elastycznej żółtej rurki do karmienia dołączonej do 10-mililitrowej strzykawki. Upewnij się, że zawartość światła została wypłukana z jamy brzusznej, aby utrzymać miejsce operacji w czystości. Następnie podwiąż dwa odcięte końce spłukiwanej pętli pcLoop za pomocą jedwabnego szwu.
Użyj jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 30, aby powoli wstrzyknąć 200 mikrolitrów odczynnika, takiego jak dekstran FITC lub chemokina, do światła jelita. pcLoop napompuje się, powodując umiarkowane rozdęcie błony śluzowej. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby delikatnie włożyć z powrotem podwiązaną pętlę pcLoop, jelito kręte i jelito ślepe.
Zamknij ścianę brzucha za pomocą uchwytu na igłę, anatomicznych kleszczyków i niewchłanialnych szwów jedwabnych 3,0 z igłą do odwrotnego cięcia. Po okresie inkubacji poddaj znieczuloną mysz eutanazji i zbierz tkanki do analizy. W celu zweryfikowania dokładności modelu pętli I do oceny przepuszczalności jelit przeprowadzono test FITC-dekstran pcLoop w celu oceny roli białka Jam-a związanego ze ścisłym połączeniem w regulacji funkcji bariery jelitowej in vivo.
Dzięki modelowi pcLoop 2,5-krotny wzrost poziomu FITC-dekstranu w surowicy określono ilościowo u myszy zerowych Jam-a w porównaniu z grupą kontrolną. Podobne wyniki uzyskano u myszy z selektywną utratą Jam-a na komórkach nabłonka jelitowego. Model pcLoop wykorzystano do zbadania rekrutacji granulocytów obojętnochłonnych (PMN) do błony śluzowej jelit i późniejszej migracji przeznabłonkowej in vivo.
Liczbę PMN w zawartości światła w pcLoop określono ilościowo za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Liczba PMN obecnych w segmencie bliższej części jelita grubego była niska w warunkach fizjologicznych. Wstępne leczenie cytokinami prozapalnymi, TNF alfa i IFN gamma, przed operacją, skutkowało zwiększoną liczbą PMN rekrutowanych w świetle pcLoop.
Podanie atraktantu APEMO LTB4 doprowadziło do dramatycznego wzrostu liczby PMN. Immunohistochemiczne barwienie PMN w błonie śluzowej okrężnicy potwierdza podwyższoną rekrutację PMN po stymulacji cytokinami i LTB4. Udział Jam-a w migracji przeznabłonkowej PMN badano przy użyciu modelu pcLoop na myszach z selektywną utratą Jam-a na komórkach nabłonka jelitowego.
Utrata nabłonkowego Jam-a doprowadziła do zmniejszenia liczby transmigrujących PMN w świetle okrężnicy w porównaniu z kontrolą miotu. Krytycznym aspektem tej techniki jest pamiętanie o zachowaniu dopływu krwi do zewnętrznego odcinka jelita podczas wykonywania operacji. Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić inne metody, takie jak test przepuszczalności jelit i test migracji przeznabłonkowej neutrofili, w celu zbadania utraty integralności bariery i zapalenia jelit in vivo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje solidny model in vivo u myszy z wykorzystaniem eksternalizowanego, unaczynionego odcinka jelita (jelita cienkiego lub proksymalnej części okrężnicy) do ilościowej oceny przepuszczalności jelitowej oraz transepithelialnej migracji (TEpM) neutrofili polimorfonuklearnych (PMN). Model ten eliminuje ograniczenia podejść ex vivo, umożliwiając badania fizjologiczne funkcji bariery jelitowej i rekrutacji komórek odpornościowych w kontekście chorób takich jak nieswoiste zapalenia jelit (IBD).
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Gastroenterologia
- Immunologia
- Fizjologia in vivo
Wprowadzenie
- Błona śluzowa jelita tworzy selektywną barierę, umożliwiającą wchłanianie składników odżywczych i wody, jednocześnie blokując patogeny i toksyny.
- Zaburzenie tej bariery zwiększa przepuszczalność oraz infiltrację komórek odpornościowych, co stanowi kluczowe cechy IBD i zaburzeń z nią związanych.
- Istniejące metody in vivo służące do badania funkcji bariery i migracji komórek odpornościowych mają ograniczone możliwości ilościowe.
- Białko połączeń ścisłych JAM-A jest zaangażowane w regulację zarówno integralności bariery, jak i migracji PMN.
Cel badania
- Ustanowienie i zaprezentowanie znormalizowanego, powtarzalnego modelu in vivo do badania przepuszczalności jelitowej oraz migracji transendotelialnej (TEpM) granulocytów obojętnochłonnych (PMN) u myszy.
- Ilościowa ocena roli białka JAM-A w regulacji tych procesów.
- Zapewnienie platformy do badania mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji bariery jelitowej i stanów zapalnych.
Zastosowane metody
- Mikrochirurgiczna eksterioryzacja i podwiązanie unaczynionego segmentu jelita krętego lub bliższej części jelita grubego myszy (iLoop/pcLoop).
- Wstrzyknięcie do światła jelita dekstranu FITC w celu pomiaru przepuszczalności jelitowej za pomocą fluorescencji surowicy.
- Podanie do światła jelita chemoatraktantów (np. LTB4) lub cytokin (TNF-α, IFN-γ) w celu indukcji i ilościowego oznaczenia migracji PMN.
- Cytometria przepływowa i immunohistochemia w celu analizy obecności PMN w treści światła jelita oraz w tkance.
Główne wyniki
- Model iLoop/pcLoop umożliwia precyzyjny i powtarzalny pomiar przepuszczalności jelit oraz TEpM PMN in vivo.
- Myszy z nokautem genu Jam-a oraz myszy z epitelioselektywną delecją Jam-a wykazują 2,5-krotny wzrost poziomu FITC-dekstranu w surowicy, co wskazuje na zwiększoną przepuszczalność.
- Wstępne traktowanie cytokinami prozapalnymi oraz podanie LTB4 znacząco zwiększają rekrutację i migrację PMN do światła jelita.
- Utrata JAM-A w nabłonku ogranicza transmigrację PMN, co podkreśla jego rolę regulacyjną.
Wnioski
- Model eksternalizowanej pętli jelitowej jest potężnym narzędziem do badań in vivo nad funkcją bariery jelitowej i stanami zapalnymi.
- JAM-A ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności bariery i regulacji migracji PMN podczas homeostazy i stanu zapalnego.
- Model ten usprawnia badanie homeostazy jelitowej oraz patogenezy chorób, takich jak IBD.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena przepuszczalności jelitowej oraz transepitelialnej migracji neutrofili jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka związanego z celami terapeutycznymi i mechanizmami uwikłanymi w nieswoiste zapalne choroby jelit oraz powiązane z nimi patologie. Standaryzowany mysi model pętli jelitowej umożliwia powtarzalną i fizjologicznie istotną ocenę funkcji bariery oraz rekrutacji komórek odpornościowych in vivo, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków i w badaniach translacyjnych. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji w zarządzaniu portfolio badawczym, dostarczając rzetelnych danych na temat integralności bariery i odpowiedzi zapalnych w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę funkcji bariery jelitowej oraz migracji komórek odpornościowych in vivo.
- Wspiera mechanisticzną weryfikację ryzyka dla celów terapeutycznych, takich jak białka połączeń ścisłych (np. JAM-A).
- Zapewnia ilościowe wyniki dla funkcjonalnej walidacji celów w szlakach zapalnych.
- Ułatwia selekcję potencjalnych mechanizmów w oparciu o ich istotność fizjologiczną.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne odczyty in vivo dla testów przepuszczalności i migracji komórek odpornościowych.
- Standaryzuje pomiar stężenia FITC-dekstranu w surowicy oraz liczby PMN w świetle jelita w celu zapewnienia porównywalności testów.
- Umożliwia skalowalność w badaniach przesiewowych związków lub perturbacji genetycznych w modelach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera rzetelną ocenę interwencji ukierunkowanych na integralność bariery lub stan zapalny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli przedklinicznych do cech ludzkich schorzeń, takich jak dysfunkcja bariery i naciek neutrofilów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację hipotez terapeutycznych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalne wyniki in vivo.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów dla badań translacyjnych w zakresie IBD i schorzeń pokrewnych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Model ten integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz badania mechanistyczne w fizjologicznie istotnym systemie in vivo.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia ilościowe testowanie hipotez dotyczących funkcji barierowej oraz migracji komórek odpornościowych.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne testy in vivo w zakresie przepuszczalności i migracji PMN.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty z surowicy i światła jelita do statystycznego porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną w modelach zapalenia jelit istotnych dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań mechanistycznych i interwencyjnych w badaniach nad barierą jelitową.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad barierą jelitową i stanami zapalnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę przepuszczalności i migracji komórek odpornościowych in vivo w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczanie rzetelnych danych funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów i mechanizmów w ramach programów badawczych nad chorobami zapalnymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii oraz starannego zachowania unaczynienia segmentu jelita.
- Wymaga dostępu do infrastruktury do cytometrii przepływowej, detekcji fluorescencji oraz immunohistochemii.
- Wymaga standaryzacji procedur chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwość adaptacji zarówno do segmentów jelita cienkiego, jak i grubego w celu zwiększenia elastyczności systemu modelowego.
- Zależność od rygorystycznej techniki wykonania w celu uniknięcia zmiennych zakłócających, takich jak niedokrwienie tkanki czy kontaminacja.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:29
Generation of the Ileal Loop
4:29
Generation of the Proximal Colon Loop (pcLoop)
6:37
Results: JAM-A Regulates Intestinal Permeability in vivo and Promotes LTB4-dependent Recruitment of PMN into the Lumen of the pcLoop
8:46
Conclusion
