Name: Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Poznaj mechanizmy adaptacji komórek płuc u myszy podczas połączonego działania ozonu i endotoksyny bakteryjnej LPS. Metoda fluorescencyjna pozwala analizować śmierć neutrofili i odpowiedź immunologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prowadzone badania są finansowane z grantu NSERC przyznanego przez prezydenta, a także z funduszy na rozpoczęcie działalności przez Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Kanadyjskie Centrum Innowacji Jądrowych im. Sylvii Fedoruk jest finansowane przez Innovation Saskatchewan. Obrazowanie fluorescencyjne wykonano w Centrum Obrazowania WCVM, które jest finansowane przez NSERC. Jessica Brocos (studentka studiów magisterskich) i Manpreet Kaur (studentka studiów magisterskich) zostali sfinansowani z funduszy start-upowych z Kanadyjskiego Centrum Innowacji Jądrowych Sylvii Fedoruk.

<ol><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).</li>
<li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+lung%3A+%22the+first+responders%22%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the lung: "the first responders".</a> Cell Tissue Research. , (2017).</li>
<li>Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+inhibits+acute+lung+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).</li>
<li>Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+9+partially+regulates+lung+inflammation+induced+following+exposure+to+chicken+barn+air%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+Medicine+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+mediates+the+late+phase+of+neutrophil+recruitment+to+the+lung+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).</li>
<li>Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+inhibits+activation+and+migration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils.</a> Cell Tissue Research. , (2013).</li>
<li>Cakmak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+long-term+PM2.5+and+ozone+exposure+and+mortality+in+the+Canadian+Census+Health+and+Environment+Cohort+%28CANCHEC%29%2C+by+spatial+synoptic+classification+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone.</a> Environment International. 111, 200-211 (2018).</li>
<li>Dauchet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+exposure+to+air+pollution%3A+Associations+with+lung+function+and+inflammatory+markers+in+non-smoking%2C+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults.</a> Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).</li>
<li>Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+air+pollution+on+emergency+room+visits+for+respiratory+illnesses+in+Montreal%2C+Quebec%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).</li>
<li>Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ozone+on+leukocyte+function+in+exposed+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects.</a> Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).</li>
<li>Rush, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+chronic+exposure+to+air+pollution+and+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).</li>
<li>Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Chronic+Ozone+and+Particulate+Air+Pollution+on+Mortality+in+Patients+With+Sepsis+Across+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States.</a> Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).</li>
<li>Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+ozone+and+asthma+emergency+department+visits+in+Saint+John%2C+New+Brunswick%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada.</a> Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).</li>
<li>Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone+modifies+the+metabolic+and+endocrine+response+to+glucose%3A+Reproduction+of+effects+with+the+stress+hormone+corticosterone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).</li>
<li>Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+low-dose+ozone-induced+murine+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 8 (11), 14463(2020).</li>
<li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regional+murine+ozone-induced+lung+inflammation+using+%5B18F%5DF-FDG+microPET%2FCT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15699(2020).</li>
<li>Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+responses+to+secondary+endotoxin+challenge+in+rats+exposed+to+pig+barn+air%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+Medicine+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24(2008).</li>
<li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%2C+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).</li>
<li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+CD34+produces+defects+in+platelets%2C+microparticles%2C+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation.</a> Cell Tissue Research. , (2020).</li>
<li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li>
<li>Yipp, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+is+a+Host+Defense+Niche+for+Immediate+Neutrophil-Mediated+Vascular+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection.</a> Science Immunology. 2 (10), (2017).</li>
<li>Lee, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li>
<li>Hawkins, C. L., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+identification%2C+and+quantification+of+oxidative+protein+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).</li>
<li>Hemming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Pollutant+Ozone+Causes+Damage+to+Lung+Surfactant+Protein+B+%28SP-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B).</a> Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).</li>
<li>Oosting, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+surfactant+protein+A+to+ozone+in+vitro+and+in+vivo+impairs+its+interactions+with+alveolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+necrotic+neutrophils+release+interleukin-16C+and+macrophage+migration+inhibitory+factor+from+stores+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Discovery%22%5BJournal%5D)">Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol.</a> Cell Death & Discovery. 1, 15056(2015).</li>
<li>Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CXCR4+in+Normal+and+Abnormal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrapulmonary+manifestations+of+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extrapulmonary manifestations of COVID-19.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).</li>
<li>Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAulakh%2C+GK+%222017+IEEE+Nuclear+Science+Symposium+and+Medical+Imaging+Conference+%28NSS%2FMIC%29%22">2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC)</a>. , 1-2 (2017).</li>
<li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+image+x-radiography+for+functional+lung+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple image x-radiography for functional lung imaging.</a> Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów ani ujawnień.

Metody przedstawione w obecnym badaniu podkreślają przydatność analizy wieloprzedziałowej do badania wielu zdarzeń komórkowych podczas zapalenia płuc. Wyniki podsumowaliśmy w tabeli 2. Wraz z wieloma laboratoriami intensywnie badaliśmy mysią reakcję na donosowe wkraplanie LPS, która charakteryzuje się szybką rekrutacją neutrofili w płucach, która osiąga szczyt między 6-24 godzinami, po czym zaczyna się rozdzielczość. Ostatnio wykazaliśmy, że subklinicznyO3 (w stężeniu 0,05 ppm przez 2 godziny)...

Ostre uszkodzenie płuc (ALI) jest kluczową patologiczną reakcją płuc na zakaźne lub inne szkodliwe bodźce, która charakteryzuje się jednoczesną aktywacją krzepnięcia, fibrynolitycznego i wrodzonego układu odpornościowego1. Neutrofile natychmiast wykrywają wzorce uszkodzeń mikrobiologicznych i wewnątrzkomórkowych za pośrednictwem rodziny receptorów Toll-like (TLR)2,3,4. Neutrofile uwalniają wstępnie uformowane cytokiny i cytotoksyczną zawartość granulek, które mogą następnie powodować uboczne uszkodzenie tkanek. Wynikające z tego uszkodzenie pęcherzyków płucnych jest naznaczone wtórną śmiercią komórki, co prowadzi do uwolnienia cząsteczek takich jak adenozynotrójfosforan (ATP)5, co rozpoczyna błędne koło rozregulowania układu odpornościowego.
Nierozwiązany problem w zrozumieniu ALI dotyczy pytania, w jaki sposób uraz jest inicjowany w błonie pęcherzykowej. Kompleks transportu elektronów V, syntaza F1F0 ATP, jest białkiem mitochondrialnym, o którym wiadomo, że ulega ekspresji we wszystkich przypadkach na błonie komórkowej (w tym śródbłonka, leukocytów, nabłonka) podczas stanu zapalnego. Cytoszkielet komórkowy, który składa się z aktyny i tubuliny, zawiera wiele białek modulujących kształt i funkcję komórek, a także białek mitochondrialnych. Niedawno wykazaliśmy, że blokada syntazy ATP przez endogenną cząsteczkę, angiostatynę, wycisza rekrutację neutrofili, aktywację i indukowane lipopolisacharydem (LPS) zapalenie płuc 6. Tak więc zarówno mechanizmy biochemiczne (syntaza ATP), jak i immunologiczne (TLR4) mogą regulować barierę pęcherzykową podczas zapalenia płuc.
Narażenie na ozon (O3), zanieczyszczenie środowiska, upośledza czynność płuc, zwiększa podatność na infekcje płuc, a krótkie niskie poziomy ekspozycji na O3 zwiększają ryzyko zgonu u osób z podstawowymi chorobami układu krążeniowo-oddechowego7,8,9,10,11,12,13,14. Tak więc narażenie na fizjologicznie istotne stężenia O3 zapewnia sensowny model ALI do badania podstawowych mechanizmów zapalenia7,8. Nasze laboratorium niedawno opracowało mysi model ALI3 class="xref">15. Po wykonaniu dawki i czasu reakcji na niskie stężeniaO3 zaobserwowaliśmy, że narażenie na 0,05 ppm O3 przez 2 godziny indukuje ostre uszkodzenie płuc, które jest zaznaczone przez podjednostkę β syntazy ATP w płucach (ATPβ) i ekspresję angiostatyny, podobnie jak w modelu LPS. Przyżyciowe obrazowanie płuc wykazało dezorganizację mikrowłókien aktyny pęcherzyków płucnych wskazujących na uszkodzenie płuc oraz ablację poziomów reaktywnych form tlenu (ROS) przegrody zębodołowej (co wskazuje na zniesienie podstawowej sygnalizacji komórkowej) i potencjału błony mitochondrialnej (wskazującej na ostrą śmierć komórki) po 2 godzinach ekspozycji na 0,05 ppm O315, co korelowało z niejednorodnym płucem 18FDG retention16, rekrutacja neutrofili i uwalnianie cytokin, w szczególności IL-16 i SDF-1α. Wniosek płynący z naszych ostatnich badań jest taki, że O3 powoduje wykładniczo wysoką toksyczność, gdy jest narażony na stężenia poniżej dopuszczalnych limitów 0,063 ppm przez 8 godzin (dziennie) dla ludzi. Co ważne, nie ma jasnego zrozumienia, czy te subkliniczne ekspozycje naO3 mogą modulować mechanizmy pośredniczone przez TLR4, takie jak endotoksyna bakteryjna17. W związku z tym zbadaliśmy model ekspozycji na O3 i LPS z podwójnym uderzeniem i obserwowaliśmy adaptacje komórkowe immunologiczne i nieimmunologiczne.
Opisujemy kompleksową analizę mikroskopową fluorescencyjną różnych przedziałów płucnych i ogólnoustrojowych, a mianowicie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (tj. BAL), który pobiera próbki z przestrzeni pęcherzykowych, perfuzat naczyń płucnych (tj., LVP), który pobiera próbki z naczyń płucnych i śródmiąższu przegrody pęcherzykowej w przypadku naruszenia bariery śródbłonkowej, kriosekcji lewego płuca, aby przyjrzeć się rezydentnym leukocytom miąższowym i przylegającym pozostawionym w płucu z płukaniem tkanka, krew obwodowa, która reprezentuje krążące leukocyty oraz perfuzyjne szpik kostny mostka i kości udowej, które pobierają próbki odpowiednio proksymalnych i dystalnych miejsc mobilizacji komórek krwiotwórczych podczas zapalenia.

<table><tbody><tr><td>33-plex Bioplex panel chemokinowy</td><td>Biorad</td><td>12002231</td><td></td></tr><tr><td>63X olej (NA 1,4-0,6) Obiektywy mikroskopowe</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO CS (11506188)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 350 sprzężona koza anty-mysia IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 sprzężona koza anty-mysia IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 sprzężona falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>A12370</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 sprzężony mysz anty-&alpha; klon tubuliny DM1A</td><td>Millipore</td><td>05-829X-555</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 sprzężona koza anty-chomik IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21112</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 sprzężona koza anty-szczura IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633 sprzężona koza anty-królik IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Chomik ormiański anty-CD61 (klon 2C9. G2) IgG1 kappa</td><td>BD Pharmingen</td><td>553343</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 J Myszy</td><td>Jackson Laboratories</td><td>64</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Leica Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&,6-diamidino-2-fenyloindol)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>podwielokrotność w 2 &mikro; l zapasy i przechowywać w temperaturze -20&deg; C</td></tr><tr><td>Odwrócony fluorescencyjny mikroskop szerokokątny</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Narketan)</td><td>Vetoquinol</td><td>100 mg/ml</td><td>Rozcieńczyć 10 razy, aby uzyskać 10 mg/ml zapasu</td></tr><tr><td>Żywy (kalceina)/martwy (Ethidium homodimer-1) zestaw cytotoksyczności</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ATP5A1 IgG2b (klon 7H10BD4F9)</td> <td>Invitrogen</td><td>459240</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ATP5&beta; IgG2b (klon 3D5AB1)</td><td>Invitrogen</td><td>A-21351</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-NK1.1 IgG2a kappa (klon PK136)</td><td>Invitrogen</td><td>16-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Test białka Pierce 660 nm</td><td>Thermoscientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>Antyangiostatyna królika (mysz aa 98-116) IgG</td><td>Abcam</td><td>ab2904</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-CX3CR1 IgG (RRID 467880)</td><td>Invitrogen</td><td>14-6093-81</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-Ki-67 (klon SolA15) IgG2a kappa</td><td>Invitrogen</td><td>14-5698-82</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-Ly6G IgG2a kappa (klon 1A8)</td><td>Invitrogen</td><td>16-9668-82</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (klon RB6-8C5)</td><td>Invitrogen</td><td>53-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Szczurzy blok anty-mysi CD16/CD32 Fc (klon 2.4G2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowany mitotracker pomarańczowy</td><td>Invitrogen</td><td>M7511</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>20 mg/ml</td><td>Rozcieńczyć 2 razy, aby uzyskać 10 mg/ml bulionu</td></tr></tbody></table>

wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i lps

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Płuca są nieustannie narażone na bezpośrednie i pośrednie zniewagi w postaci sterylnych (cząsteczki lub reaktywne toksyny) i zakaźnych (bakteryjnych, wirusowych lub grzybiczych) stanów zapalnych. Przytłaczająca odpowiedź gospodarza może skutkować upośledzeniem oddychania i ostrym uszkodzeniem płuc, które charakteryzuje się rekrutacją neutrofili w płucach w wyniku patologicznej odpowiedzi immunologicznej, krzepnięcia i przebudowy tkanek gospodarza. Czułe metody mikroskopowe do wizualizacji i ilościowego określania adaptacji komórkowych płuc myszy w odpowiedzi na niskie dawki (0,05 ppm) ozonu, silnego zanieczyszczenia środowiska w połączeniu z bakteryjnym lipopolisacharydem, agonistą TLR4, mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów zapalnych i naprawczych gospodarza. Opisujemy kompleksową fluorescencyjną analizę mikroskopową różnych przedziałów płucnych i ogólnoustrojowych, a mianowicie płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych, perfuzatu naczyniowego płuc, kriosekcji płuc lewych i perfuzatu szpiku kostnego mostka. Wykazano uszkodzenia makrofagów pęcherzykowych, neutrofili, tkanki miąższowej płuc, a także komórek szpiku kostnego w korelacji z opóźnioną (do 36-72 h) odpowiedzią immunologiczną, która jest zaznaczona dyskretnymi gradientami chemokiny w analizowanych przedziałach. Ponadto przedstawiono macierz zewnątrzkomórkową płuc i interakcje komórkowe cytoszkieletu (aktyna, tubulina), mitochondrialne i reaktywne formy tlenu, antykoagulacyjny plazminogen, jego antyangiogenny fragment peptydu angiostatyna, mitochondrialne podjednostki kompleksu V syntazy ATP, α i β. Te markery zastępcze, po uzupełnieniu odpowiednimi testami in vitro opartymi na komórkach i technikami obrazowania in vivo zwierząt, takimi jak mikroskopia przyżyciowa, mogą dostarczyć istotnych informacji w celu zrozumienia odpowiedzi płuc na nowe czynniki immunomodulujące.

Połączony O3 a ekspozycja na LPS prowadzi do zapalenia systemowego i mobilizacji szpiku kostnego po 72 h: Liczba komórek w różnych przedziałach wykazała istotne zmiany w całkowitej liczbie komórek krwi obwodowej i szpiku kostnego kości udowej po połączonym O3 oraz ekspozycję na LPS. Chociaż połączone O3 a ekspozycja na LPS nie wywołała żadnych zmian w całkowitej objętości płynu z BAL (Rycina 1A) lub ...

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Cześć, nazywam się Gurpreet. Nasze laboratorium bada mechanizmy zapalenia i naprawy płuc. Cześć, mam na imię Jessica i badam pęcherzyki płucne szczurów laboratoryjnych wywołane ozonem za pomocą fluorescencyjnych metod mikroskopowych.Witam wszystkich, nazywam się Manpreet. Zajmuję się badaniem zapalenia płuc za pomocą metod obrazowania na zwierzętach. Płuca są stale narażone na bezpośrednie i pośrednie zniewagi wynikające ze sterylnych, takich jak ozon, i składników mikrobiologicznych, takich jak bakteryjny lipopolisacharyd lub LPS.Przytłaczająca odpowiedź gospodarza może skutkować upośledzeniem oddychania i ostrym uszkodzeniem płuc, charakteryzującym się rekrutacją neutrofili w płucach, z powodu nieuregulowanej odporności, koagulacji i przebudowy tkanek gospodarza. Opisujemy kompleksową analizę różnych przedziałów, a mianowicie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, czyli BAL, perfuzatu naczyniowego płuc, czyli LVP, kriogenicznych odcinków płuc lewych, krwi obwodowej oraz szpiku kostnego mostka i kości udowej. W przypadku ekspozycji na ozon delikatnie umieść myszy w niestandardowym pudełku indukcyjnym i stale wystawiaj myszy na działanie 0.05 PPM ozonu przez dwie godziny.W przypadku ekspozycji na LPS znieczulenie myszy pod wpływem lekkiej dootrzewnowej mieszanki ketaminy i ksylazyny. Teraz wkropl 50 mikrolitrów roztworu LPS do zewnętrznych nozdrzy myszy. Wkrap myszom kontrolnym 50 mikrolitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej.W określonych punktach czasowych znieczulij myszy pełną dawką mieszanki ketaminy i ksylazyny. Następnie zdezynfekuj myszy i sprawdź, czy nie ma odruchów pedałowania, czyli uszczypnij jeden z palców kończyny tylnej i obserwuj, czy kończyna się nie cofa. Brak odruchu oznacza głębokie znieczulenie.Teraz wykonaj nacięcie poniżej mostka i odsłoń serce. Umieść igłę o rozmiarze 25 przymocowaną do strzykawki z heparyną do prawej komory i pobierz krew przez nakłucie serca. Zebrać krew do strzykawek z heparyną i odsączyć w probówkach do mikrofuge w celu dalszego przetwarzania.Ostrożnie użyj pęsety lub kleszczy, aby usunąć obszar tchawicy z leżącej nad nim tkanki. Teraz przeciąć klatkę piersiową, aby odsłonić płuca. Przełóż bawełnianą ligaturę poniżej tchawicy i pozostaw ją na razie taką.Odetnij tchawicę, oddaloną od płuc o około jedną trzecią jej długości w celu tracheostomii. Włóż kaniulę polietylenową o rozmiarze 28 do tchawicy. Mocno zawiąż bawełnianą ligaturę, aby utrzymać kaniulę na miejscu.Upewnij się, że nie zapadasz kaniuli. Teraz stopniowo wstrzykuj 0,5 ml PBS do kaniuli za pomocą strzykawki o pojemności jednego ml. Po wstrzyknięciu PBS należy odessać strzykawkę, o ile nie wytrzymuje ona ssania.Zbierz zasysany płyn do oznakowanej probówki z mikrofagami i powtórz tę procedurę jeszcze dwa razy. Przetnij zstępującą aortę piersiową w miejscu między połową klatki piersiowej i brzucha, aby uniknąć cofania się podczas perfuzji płuc. Osusz jamę w pobliżu przeciętego końca aorty z krwi.Następnie przeprowadź perfuzję do płuc 0,5 ml soli fizjologicznej w postaci heparyny o temperaturze pokojowej, wstrzyknij ją przez prawą komorę. Zbierz perfuzat naczyniowy z jamy na odciętym końcu zstępującej aorty piersiowej. Po podwiązaniu prawego oskrzela pozwól lewemu płucu nadmuchać się 0,5 ml paraformaldehydu przez pięć minut.Teraz zdezynfekuj część brzuszną. Wytnij część brzuszną i oderwij ją od kości miednicy. Zbierz kość miednicy i odizoluj lewą i prawą kość udową na wypełnionej solą fizjologiczną szalce Petriego trzymanej na lodzie.Zbierz brzuszną klatkę piersiową i mostek na wypełnioną solą szalkę Petriego, która również jest przechowywana na lodzie. Przetnij odcięte końce kości czterokrotnie 0,5 ml soli fizjologicznej za pomocą dobrze dopasowanych igieł na strzykawkach o pojemności 1 ml. Zbierz frakcje z każdej kości do oznaczonych probówek Falcona, wyposażonych w filtry i umieszczonych na lodzie.Odwirować wszystkie próbki przez 10 minut przy prędkości 3000 obr./min. Zbierz supernatanty i błyskawicznie je zamroź. Rozpuścić komórki w co najmniej 200 mikrolitrach PBS.Wykonaj całkowitą liczbę leukocytów. Zabarwić inny płyn BAL mieszanką zieleni kalceinowej i czerwonego homodimeru etydyny jednym barwnikiem. Analizować supernatant pod kątem chemokin i całkowitego stężenia białka.Odwiruj komórki, aby przygotować dwa cytospiny na każdym szkiełku i wybarwić białka biochemiczne i odpornościowe. Wykonaj zmodyfikowane barwienie H i E na kriosekcjach płuc dla wszystkich grup. Ręcznie obrysuj od 150 do 200 komórek w panelu scalonego obrazu.Skopiuj konspekt obszarów zainteresowania do wszystkich kanałów. Zmierz wstępnie ustawione parametry dla wszystkich kanałów. Podziel intensywność fluorescencji barwionej cząsteczki przez intensywność DAPI lub CD61.Są one określane jako znormalizowane współczynniki intensywności fluorescencji DAPI lub CD 61. Następnie wykreśl parametry, aby ocenić wszelkie zmiany po ekspozycji. Chociaż łączna ekspozycja nie wywołała żadnych zmian w całkowitej liczbie komórek szpiku kostnego BAL, LVP lub mostka, myszy wykazywały leukocytozę ogólnoustrojową po 24 godzinach, po której nastąpiła leukopenia po 72 godzinach od ekspozycji.Są one wyświetlane w morfologii krwi obwodowej. Liczba komórek szpiku kostnego kości udowej wykazuje późny skok po 72 godzinach w porównaniu ze wszystkimi punktami czasowymi. Należy zwrócić uwagę na brak barwienia Siglec-F i CX3CRI w komórkach wielojądrzastych po 24 godzinach na obrazie cytospinu BAL.Cytospiny BAL i LVP wykazały obecność dużych komórek jednojądrzastych CD11b i GR1 dodatnich w godzinach zero. Komórki wielojądrzaste przedstawione jako dominujący typ komórek we wszystkich przedziałach po ekspozycji. Całkowita zawartość białka BAL była najwyższa po 36 godzinach od łącznej ekspozycji.Jednak białko LVP pozostało niezmienione po ekspozycji. Poziomy eotaksyny-2 i interleukiny-2 były najwyższe w ciągu czterech godzin w LVP. Chemokiny te uległy redukcji we frakcji BAL.Co ciekawe, neutrofile alarmujące IL-16 i wiele wrodzonych chemokin zostało zmienionych w LVP, ale nie we frakcji BAL. Na początku badania ponad 95% komórek BAL było jednojądrowych z aktyną korową, lamellipodiami, włóknami stresowymi i tubulinowymi i były one silnie dodatnie pod względem zmniejszonego barwienia mitotrackerem. Po czterech godzinach zaobserwowaliśmy koliste komórki BAL, które utraciły aktynę, ale wykazywały rozproszoną sieć mikrotubul, jak pokazano w czerwonym i niższym zredukowanym barwieniu mitotrackerem.Wcześnie po połączonej ekspozycji komórki BAL wydawały się podwójnie dodatnie na obecność kalceiny i homodimeru etydyny-1, co wskazuje na częściowo uszkodzone komórki. Po 36 godzinach komórki BAL były w dużej mierze zdolne do życia, czyli zielone. Zaobserwowaliśmy dyskretne barwienie ATP alfa i Ly6G w makrofagach pęcherzykowych BAL i neutrofilach.Zaobserwowaliśmy zmniejszenie znormalizowanego przez DAPI ATP alfa i wzrost wewnątrzkomórkowej zawartości białka Ly6G. Połączone ekspozycje indukowały przejściowe ekspresje Bal, komórki NK i K1.1, ATP neutrofili, podjednostki PETA, czynnika proliferacji, Ki-67 i utrzymujące się ekspresje neutrofili GR1, płytek krwi CX3CRI i antyangiogennego białka angiostatyny w komórkach BAL po ekspozycji. Chociaż spodziewano się uszkodzenia przegrody oskrzelowej i pęcherzykowej, zaskakujące było zaobserwowanie agregatów komórkowych w większych naczyniach po 36 godzinach od ekspozycji.Na koniec mamy podsumowanie wyników w tej tabeli. Mamy nadzieję, że nasz mysi model posłuży jako łatwo dostępny prototyp, który będzie można odtworzyć w laboratoriach przechowawczych poziomu drugiego w celu zbadania mechanizmów inwazyjnej śmierci komórek i infekcji. Dziękuję.

visualizing-lung-cellular-adaptations-during-combined-ozone-lps

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Oksydaza NADPH jest głównym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS) w fagocytach. Ze względu na efemeryczną naturę ROS, pomiar i monitorowanie poziomu ROS u żywych zwierząt jest trudne. Opisano mało inwazyjną metodę seryjnego oznaczania ilościowego ROS u żywych myszy.

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Przedstawiona tutaj jest procedura krok po kroku do wywołania ostrego uszkodzenia płuc u myszy poprzez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydu dotchawiczego i przeprowadzenie analizy FACS próbek krwi, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i tkanki płucnej. Minimalna inwazyjność, prosta obsługa, dobra odtwarzalność i miareczkowanie ciężkości choroby to zalety tego podejścia.

Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Selektywne wkraplanie kwasu dooskrzelowego do lewego płuca u myszy powoduje jednostronne i samoograniczające się ostre uszkodzenie płuc, które modeluje ludzki zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) wywołany aspiracją kwasu żołądkowego.

Model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc przez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego

Ten manuskrypt opisuje protokół określający, czy narażenie na ozon, podstawowe zanieczyszczenie powietrza, upośledza efferocytozę makrofagów pęcherzykowych in vivo. Protokół ten wykorzystuje powszechnie stosowane odczynniki i techniki i może być dostosowany do wielu modeli uszkodzenia płuc w celu określenia wpływu na efferocytozę makrofagów pęcherzykowych.

Ocena in vivo efferocytozy makrofagów pęcherzykowych po ekspozycji na ozon

Obecny protokół opisuje model uszkodzenia płuc u myszy używających kwasu oleinowego do naśladowania zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Model ten zwiększa mediatory stanu zapalnego w obrzęku i zmniejsza podatność płuc. Kwas oleinowy jest stosowany w postaci soli (oleinianu), ponieważ ta fizjologiczna forma pozwala uniknąć ryzyka zatoru.

Mysi model zespołu ostrej niewydolności oddechowej wywołanej kwasem oleinowym

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Mysi model chirurgiczny do tworzenia uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia lewego płuca (IR) przy jednoczesnym utrzymaniu wentylacji i unikaniu niedotlenienia.

Mysi model intubacji jamy ustnej i tchawicy i wentylowanej operacji reperfuzji niedokrwienia płuc

W tym badaniu wykazano, że nieinwazyjna technika instylacji tchawicy pozwala na rozwój ALI u szczurów za pomocą podstawowego laryngoskopu, aby zapewnić precyzyjne dostarczanie LPS do płuc. LPS jest wprowadzany za pomocą rurki tchawicowej za pomocą laryngoskopu. Skala uszkodzenia płuc jest oceniana w wielu punktach czasowych.

Nieinwazyjne podanie lipopolisacharydu przez endotchawicę w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u gryzoni

Poznaj mechanizmy adaptacji komórek płuc u myszy podczas połączonego działania ozonu i endotoksyny bakteryjnej LPS. Metoda fluorescencyjna pozwala analizować śmierć neutrofili i odpowiedź immunologiczną.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Przeglądaj więcej filmów