Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Cześć, nazywam się Gurpreet. Nasze laboratorium bada mechanizmy zapalenia i naprawy płuc. Cześć, mam na imię Jessica i badam pęcherzyki płucne szczurów laboratoryjnych wywołane ozonem za pomocą fluorescencyjnych metod mikroskopowych.

Witam wszystkich, nazywam się Manpreet. Zajmuję się badaniem zapalenia płuc za pomocą metod obrazowania na zwierzętach. Płuca są stale narażone na bezpośrednie i pośrednie zniewagi wynikające ze sterylnych, takich jak ozon, i składników mikrobiologicznych, takich jak bakteryjny lipopolisacharyd lub LPS.

Przytłaczająca odpowiedź gospodarza może skutkować upośledzeniem oddychania i ostrym uszkodzeniem płuc, charakteryzującym się rekrutacją neutrofili w płucach, z powodu nieuregulowanej odporności, koagulacji i przebudowy tkanek gospodarza. Opisujemy kompleksową analizę różnych przedziałów, a mianowicie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, czyli BAL, perfuzatu naczyniowego płuc, czyli LVP, kriogenicznych odcinków płuc lewych, krwi obwodowej oraz szpiku kostnego mostka i kości udowej. W przypadku ekspozycji na ozon delikatnie umieść myszy w niestandardowym pudełku indukcyjnym i stale wystawiaj myszy na działanie 0.05 PPM ozonu przez dwie godziny.

W przypadku ekspozycji na LPS znieczulenie myszy pod wpływem lekkiej dootrzewnowej mieszanki ketaminy i ksylazyny. Teraz wkropl 50 mikrolitrów roztworu LPS do zewnętrznych nozdrzy myszy. Wkrap myszom kontrolnym 50 mikrolitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej.

W określonych punktach czasowych znieczulij myszy pełną dawką mieszanki ketaminy i ksylazyny. Następnie zdezynfekuj myszy i sprawdź, czy nie ma odruchów pedałowania, czyli uszczypnij jeden z palców kończyny tylnej i obserwuj, czy kończyna się nie cofa. Brak odruchu oznacza głębokie znieczulenie.

Teraz wykonaj nacięcie poniżej mostka i odsłoń serce. Umieść igłę o rozmiarze 25 przymocowaną do strzykawki z heparyną do prawej komory i pobierz krew przez nakłucie serca. Zebrać krew do strzykawek z heparyną i odsączyć w probówkach do mikrofuge w celu dalszego przetwarzania.

Ostrożnie użyj pęsety lub kleszczy, aby usunąć obszar tchawicy z leżącej nad nim tkanki. Teraz przeciąć klatkę piersiową, aby odsłonić płuca. Przełóż bawełnianą ligaturę poniżej tchawicy i pozostaw ją na razie taką.

Odetnij tchawicę, oddaloną od płuc o około jedną trzecią jej długości w celu tracheostomii. Włóż kaniulę polietylenową o rozmiarze 28 do tchawicy. Mocno zawiąż bawełnianą ligaturę, aby utrzymać kaniulę na miejscu.

Upewnij się, że nie zapadasz kaniuli. Teraz stopniowo wstrzykuj 0,5 ml PBS do kaniuli za pomocą strzykawki o pojemności jednego ml. Po wstrzyknięciu PBS należy odessać strzykawkę, o ile nie wytrzymuje ona ssania.

Zbierz zasysany płyn do oznakowanej probówki z mikrofagami i powtórz tę procedurę jeszcze dwa razy. Przetnij zstępującą aortę piersiową w miejscu między połową klatki piersiowej i brzucha, aby uniknąć cofania się podczas perfuzji płuc. Osusz jamę w pobliżu przeciętego końca aorty z krwi.

Następnie przeprowadź perfuzję do płuc 0,5 ml soli fizjologicznej w postaci heparyny o temperaturze pokojowej, wstrzyknij ją przez prawą komorę. Zbierz perfuzat naczyniowy z jamy na odciętym końcu zstępującej aorty piersiowej. Po podwiązaniu prawego oskrzela pozwól lewemu płucu nadmuchać się 0,5 ml paraformaldehydu przez pięć minut.

Teraz zdezynfekuj część brzuszną. Wytnij część brzuszną i oderwij ją od kości miednicy. Zbierz kość miednicy i odizoluj lewą i prawą kość udową na wypełnionej solą fizjologiczną szalce Petriego trzymanej na lodzie.

Zbierz brzuszną klatkę piersiową i mostek na wypełnioną solą szalkę Petriego, która również jest przechowywana na lodzie. Przetnij odcięte końce kości czterokrotnie 0,5 ml soli fizjologicznej za pomocą dobrze dopasowanych igieł na strzykawkach o pojemności 1 ml. Zbierz frakcje z każdej kości do oznaczonych probówek Falcona, wyposażonych w filtry i umieszczonych na lodzie.

Odwirować wszystkie próbki przez 10 minut przy prędkości 3000 obr./min. Zbierz supernatanty i błyskawicznie je zamroź. Rozpuścić komórki w co najmniej 200 mikrolitrach PBS.

Wykonaj całkowitą liczbę leukocytów. Zabarwić inny płyn BAL mieszanką zieleni kalceinowej i czerwonego homodimeru etydyny jednym barwnikiem. Analizować supernatant pod kątem chemokin i całkowitego stężenia białka.

Odwiruj komórki, aby przygotować dwa cytospiny na każdym szkiełku i wybarwić białka biochemiczne i odpornościowe. Wykonaj zmodyfikowane barwienie H i E na kriosekcjach płuc dla wszystkich grup. Ręcznie obrysuj od 150 do 200 komórek w panelu scalonego obrazu.

Skopiuj konspekt obszarów zainteresowania do wszystkich kanałów. Zmierz wstępnie ustawione parametry dla wszystkich kanałów. Podziel intensywność fluorescencji barwionej cząsteczki przez intensywność DAPI lub CD61.

Są one określane jako znormalizowane współczynniki intensywności fluorescencji DAPI lub CD 61. Następnie wykreśl parametry, aby ocenić wszelkie zmiany po ekspozycji. Chociaż łączna ekspozycja nie wywołała żadnych zmian w całkowitej liczbie komórek szpiku kostnego BAL, LVP lub mostka, myszy wykazywały leukocytozę ogólnoustrojową po 24 godzinach, po której nastąpiła leukopenia po 72 godzinach od ekspozycji.

Są one wyświetlane w morfologii krwi obwodowej. Liczba komórek szpiku kostnego kości udowej wykazuje późny skok po 72 godzinach w porównaniu ze wszystkimi punktami czasowymi. Należy zwrócić uwagę na brak barwienia Siglec-F i CX3CRI w komórkach wielojądrzastych po 24 godzinach na obrazie cytospinu BAL.

Cytospiny BAL i LVP wykazały obecność dużych komórek jednojądrzastych CD11b i GR1 dodatnich w godzinach zero. Komórki wielojądrzaste przedstawione jako dominujący typ komórek we wszystkich przedziałach po ekspozycji. Całkowita zawartość białka BAL była najwyższa po 36 godzinach od łącznej ekspozycji.

Jednak białko LVP pozostało niezmienione po ekspozycji. Poziomy eotaksyny-2 i interleukiny-2 były najwyższe w ciągu czterech godzin w LVP. Chemokiny te uległy redukcji we frakcji BAL.

Co ciekawe, neutrofile alarmujące IL-16 i wiele wrodzonych chemokin zostało zmienionych w LVP, ale nie we frakcji BAL. Na początku badania ponad 95% komórek BAL było jednojądrowych z aktyną korową, lamellipodiami, włóknami stresowymi i tubulinowymi i były one silnie dodatnie pod względem zmniejszonego barwienia mitotrackerem. Po czterech godzinach zaobserwowaliśmy koliste komórki BAL, które utraciły aktynę, ale wykazywały rozproszoną sieć mikrotubul, jak pokazano w czerwonym i niższym zredukowanym barwieniu mitotrackerem.

Wcześnie po połączonej ekspozycji komórki BAL wydawały się podwójnie dodatnie na obecność kalceiny i homodimeru etydyny-1, co wskazuje na częściowo uszkodzone komórki. Po 36 godzinach komórki BAL były w dużej mierze zdolne do życia, czyli zielone. Zaobserwowaliśmy dyskretne barwienie ATP alfa i Ly6G w makrofagach pęcherzykowych BAL i neutrofilach.

Zaobserwowaliśmy zmniejszenie znormalizowanego przez DAPI ATP alfa i wzrost wewnątrzkomórkowej zawartości białka Ly6G. Połączone ekspozycje indukowały przejściowe ekspresje Bal, komórki NK i K1.1, ATP neutrofili, podjednostki PETA, czynnika proliferacji, Ki-67 i utrzymujące się ekspresje neutrofili GR1, płytek krwi CX3CRI i antyangiogennego białka angiostatyny w komórkach BAL po ekspozycji. Chociaż spodziewano się uszkodzenia przegrody oskrzelowej i pęcherzykowej, zaskakujące było zaobserwowanie agregatów komórkowych w większych naczyniach po 36 godzinach od ekspozycji.

Na koniec mamy podsumowanie wyników w tej tabeli. Mamy nadzieję, że nasz mysi model posłuży jako łatwo dostępny prototyp, który będzie można odtworzyć w laboratoriach przechowawczych poziomu drugiego w celu zbadania mechanizmów inwazyjnej śmierci komórek i infekcji. Dziękuję.