Name: Prozapalny, zwyrodnieniowy model hodowli narządów symulujący wczesne stadium choroby krążka międzykręgowego. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Poznaj trójwymiarowy model hodowli narządów krążków międzykręgowych wołowych, symulujący prozapalne środowisko zwyrodnienia. Ta metoda umożliwia badanie patofizjologii choroby i testowanie terapii bez użycia zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez AO Foundation i AOSpine International. Babak Saravi otrzymał stypendium od Niemieckiej Fundacji Kręgosłupa i Niemieckiej Fundacji Choroby Zwyrodnieniowej Stawów. Gernot Lang był wspierany przez-Ottenstein-Programme for Advanced Clinician Scientists, Wydział Lekarski, Uniwersytet we Fryburgu, Niemcy.

Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu bydlęcych ogonów pozyskanych z lokalnych rzeźni. Materiały biologiczne użyte w niniejszym badaniu pochodzą z łańcucha żywnościowego i nie wymagają zatwierdzenia etycznego w prawie szwajcarskim i europejskim.
1. Wycięcie krążka międzykręgowego bydła
<ol>
	<li>Dokładnie spłucz cały ogon wodą z kranu, aby usunąć brud i włosy z powierzchni. 
	UWAGA: W przypadku nienaruszonych, dystalnych końców, do eksperymentów można użyć maksymalnie 9 IVD (kość ogonowa 1-9) na ogon, w zależności od pożądanego rozmiaru IVD. Biorąc pod uwagę pożądaną średnicę w zakresie 15-20 mm, do eksperymentów użyliśmy 12 ogonów bydlęcych z 5 wykańczanymi wykańczalniami do diagnostyki in vitro na ogon.</li>
	<li>Zanurz cały ogon w pudełku zawierającym 1% roztwór betadyny na 10 minut. Krótko osusz ogon sterylną gazą i umieść go na sterylnym serwecie. 
	UWAGA: Podczas preparowania dysku należy nawilżyć ogony gazą zwilżoną roztworem Ringera, aby zapobiec odwodnieniu. Przechowuj ogony (lub pozostałe segmenty) owinięte w mokrą gazę, aż cała procedura preparowania zostanie zakończona.</li>
	<li>Za pomocą skalpela (nr 20) należy jak najdokładniej usunąć tkankę miękką z kręgosłupa ogonowego, aby ułatwić identyfikację wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro. Usuń wyrostki kolczyste i poprzeczne kręgów za pomocą szczypiec do usuwania kości. 
	UWAGA: Wybierz IVD o żądanej średnicy. W niniejszym badaniu zastosowano IVD o zakresie średnic 15-20 mm.</li>
	<li>Przetnij poprzecznie szczypcami do kości przez środek każdego trzonu kręgu, aby uzyskać poszczególne segmenty ruchu. Umieść ruchome segmenty na szalce Petriego z gazą zwilżoną roztworem Ringera.</li>
	<li>Zlokalizuj IVD i kręg za pomocą badania palpacyjnego i delikatnego przesuwania segmentów ruchu. Wykonaj dwa równoległe nacięcia piłą taśmową w płytce wzrostowej IVD, po jednym z każdej strony IVD. Określić położenie płytki wzrostowej, dotykając i znajdując wypukłe miejsce kostnej części płytki końcowej (twardej) przylegającej do dysku (miękkiej) w bezpiecznej odległości około 0,5-1 mm od IVD w kierunku kręgu. Upewnij się, że ostrze piły taśmowej jest chłodzone roztworem Ringera podczas przecinania kręgów.</li>
	<li>Przenieść IVD na czystą szalkę Petriego z czystą gazą zwilżoną roztworem Ringera. 
	UWAGA: Gaza powinna być zwilżona i niezbyt mokra, aby zapobiec pęcznieniu wyrobów do diagnostyki in vitro,</li>
	<li>Użyj ostrza skalpela, aby zeskrobać trzon kręgu (czerwona/różowa kość), płytkę wzrostową (biała chrząstka), pozostaw nienaruszoną płytkę końcową (żółto-różową). Ustaw dwie powierzchnie płasko i równolegle do procedury ładowania. Zeskrobane wyroby do diagnostyki in vitro przenieść na świeżą szalkę Petriego z gazą zwilżoną roztworem Ringera. 
	UWAGA: Załóż rękawicę kolczastą, aby chronić dłoń podczas trzymania IVD i skrobania.</li>
	<li>Zmierz wysokość i średnicę tarczy za pomocą suwmiarki. Oczyść skrzepy krwi w kości kręgów roztworem Ringera za pomocą systemu płukania strumieniowego.</li>
	<li>Przenieś IVD do plastikowych probówek o pojemności 50 ml, po jednej IVD na probówkę. Dodać 25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) + 10% penicyliny/streptomycyny (P/S) na IVD i pozostawić na 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać 10 ml PBS + 1% P/S na IVD przez 2 minuty, aby przepłukać IVD.</li>
</ol>
2. Kultura IVD i ładowanie
<ol>
	<li>Przenieść krążki do komór IVD i dodać pożywkę do hodowli IVD (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L DMEM o wysokiej zawartości glukozy dla grupy fizjologicznej i 2 g/L DMEM o niskiej zawartości glukozy dla grupy patologicznej) + 1% P/S + 2% surowicy cielęcej płodu + 1% ITS (zawiera 5 μg/ml insuliny, 6 μg/ml transferyny, i 5 ng/ml kwasu selenowego) + 50 μg/ml 2-fosforanu askorbinianu + 1% aminokwasu endogennego + 50 μg/ml środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek pierwotnych) i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, wilgotności 85% i 5% CO2 .</li>
	<li>Hoduj dyski przez 4 dni w systemie bioreaktora zgodnie z grupami eksperymentalnymi16. W grupie patologicznej utrzymuj warunki obciążenia zwyrodnieniowego na poziomie 0,32-0,5 MPa, 5 Hz przez 2 godziny/dobę. W fizjologicznej grupie kontrolnej należy zastosować protokół obciążenia 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz przez 2 godziny/dzień. 
	UWAGA: Podczas procedur ładowania należy umieścić IVD w komorach zawierających 5 ml pożywki IVD. Objętość zależy od wielkości komór załadowczych bioreaktora. Pomiędzy procedurami ładowania umieścić IVD w sześciodołkowych płytkach z 7 ml pożywki do IVD w celu odzyskania swobodnego pęcznienia.</li>
	<li>W celu analizy zmian wysokości krążka w okresie eksperymentalnym, należy zmierzyć wysokość dysku suwmiarką po rozwarstwieniu IVD (linia wyjściowa), a następnie codziennie po okresie swobodnego pęcznienia i po obciążeniu dynamicznym przez czas trwania eksperymentu.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie czynnika martwicy guza dodyskowego alfa (TNF-α)
<ol>
	<li>Bezpośrednio po pierwszym cyklu dynamicznego ładowania w dniu 1 umieść IVD na szalce Petriego w pozycji pionowej i ustabilizuj IVD za pomocą pęsety.</li>
	<li>Wstrzyknąć rekombinowany TNF-α (100 ng w 70 μl PBS na IVD) za pomocą igły insuliny o rozmiarze 30 do tkanki jądra miażdżystego grupy patologicznej17. Wstrzykiwać powoli, z prędkością około 70 μl, w ciągu 1 minuty.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy wciągnąć strzykawkę do połowy z powrotem w IVD i pociągnąć tłok strzykawki, aby wytworzyć podciśnienie, które zapobiegnie cofaniu się wstrzykniętego roztworu, przed całkowitym wyjęciem igły i strzykawki z IVD. 
	UWAGA: Przeprowadzić eksperyment pilotażowy, wstrzykując PBS zawierający barwnik błękitu trypanowego, aby ocenić rozkład wstrzykniętego roztworu po załadowaniu i hodowli przez noc.</li>
</ol>
4. Ekspresja genów
<ol>
	<li>Zbierz IVD w 4 dniu. Pobrać tkankę jądra miażdżystego (NP) (żelowa część w środku IVD) za pomocą stempla do biopsji. Zebrać zewnętrzny pierścień włóknisty (AF) za pomocą ostrza skalpela (nr 20). 
	UWAGA: W przypadku odniesienia wyjściowego w dniu 0 należy pobrać tkanki natychmiast po rozbiorze w celu ekstrakcji RNA.</li>
	<li>Należy użyć ilości tkanki NP lub AF potrzebnej do analizy ekspresji genów, w zależności od projektu doświadczalnego. 
	UWAGA: Do obecnych eksperymentów użyto około 150 mg tkanki. Stosunek roztworu do izolacji RNA do masy tkankowej powinien wynosić co najmniej 2 ml na 100-150 mg tkanki w celu skutecznej ekstrakcji.</li>
	<li>Trawić tkankę NP lub AF roztworem do wytrawiania (0,2% pronazy w DMEM, sterylizowany filtrem) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z mieszaniem magnetycznym18.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrożenie próbek tkanek za pomocą ciekłego azotu i sproszkowanie na drobny proszek. Podzielić sproszkowaną tkankę w proszku równo na dwie probówki o pojemności 2 ml, z których każda zawiera 1 ml tiocyjanianu guanidyny i fenolu w roztworze jednofazowym (roztwór izolacyjny RNA).</li>
	<li>Przeprowadzić homogenizację w probówkach o pojemności 2 ml zawierających roztwór izolacyjny RNA i sproszkowaną tkankę w proszku. Homogenizować sproszkowaną tkankę 5x za pomocą kulki ze stali nierdzewnej o średnicy 8 mm i lizera tkankowego o częstotliwości 30 Hz przez 3 minuty. Odwirować w temperaturze 12 000 x g, 4 °C przez 10 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki. Supernatanty mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez co najmniej jeden miesiąc.</li>
	<li>Dodać 0,1 ml 1-bromo-3-chloropropanu (BCP) na 1 ml roztworu izolacyjnego RNA i energicznie wstrząsać przez 15 s. Otrzymaną mieszaninę przechowywać w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przez 15 minut i odwirowywać przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: RNA pozostaje wyłącznie w górnej fazie wodnej.</li>
	<li>Przenieś fazę wodną do świeżej probówki i wytrącić RNA za pomocą 0,25 ml izopropanolu i 0,25 ml roztworu do wytrącania o wysokiej zawartości soli na 1 ml roztworu izolacyjnego RNA użytego do wstępnej homogenizacji. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej i odwirowywać przy 12 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Alternatywnie należy zastosować metodę ekstrakcji RNA opartą na kolumnie, która zazwyczaj prowadzi do wyższej czystości RNA, ale niższej wydajności RNA.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć osad RNA 1 ml 75% etanolu na 1 ml roztworu izolacji RNA użytego do wstępnej homogenizacji. Wirować przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć płuczkę etanolem i krótko wysuszyć na powietrzu osad RNA przez 3-5 minut. Rozpuścić RNA w 20 μl wody uzdatnionej dietylowęglanem (DEPC), przepuszczając roztwór kilka razy przez końcówkę pipety i inkubując przez 10-15 minut w temperaturze 55-60 °C.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy 230 nm, 260 nm i 280 nm (odpowiednio A230, A260 i A280). A260 o stężeniu 1,0 odpowiada 40 μg/ml RNA. Oczekuje się, że stosunek A260/A280 wyniesie 1,6-1,9, podczas gdy zanieczyszczenie spowoduje stosunek A260/A280 <1,6.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną odwrotnej transkryptazy (RT) o objętości reakcyjnej 20 μl. Mieszanka zawiera mieszankę enzymów RT, inhibitor rybonukleazy, białko pomocnicze, startery, dNTP, MgCl2, wodę wolną od RNaz i 0,4 μg próbki RNA.</li>
	<li>Krótko odwirować probówki RT, aby wymieszać wszystkie składniki na dnie probówki.</li>
	<li>Umieścić próbki w przyrządzie termocyklerowym. Wybierz odpowiedni program dla RT. Uruchom RT na 10 minut w temperaturze 25 °C, następnie wykonaj etap odwrotnej transkrypcji na 120 minut w temperaturze 42 °C i dezaktywację odwrotnej transkryptazy na 5 minut w temperaturze 85 °C, schładzając ją do 4 °C na końcu.</li>
	<li>Rozcieńczyć otrzymany cDNA buforem kwasu tris(hydroksymetylo)aminometanowego (Tris)-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (TE) (TE) (10 mM Tris z 1 mM EDTA) do końcowego stężenia 0,4 μg RNA stosowanego do RT na 100 μl roztworu cDNA. Próbki cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym przy użyciu objętości reakcyjnej 10 μl. Objętość reakcyjna zawiera mieszaninę główną (zawierającą polimerazę DNA, glikozylazę uracylo-DNA, dNTP z dUTP, pasywne składniki odniesienia i zoptymalizowane składniki buforowe), starter do przodu 45 μM, starter odwrotny 45 μM, sondę 12,5 μM (zawierający barwnik reporterowy połączony z końcem 5' sondy, spoiwo z mniejszym rowkiem na końcu 3' sondy, i niefluorescencyjny wygaszacz na końcu 3' sondy), 2 μl cDNA i woda uzdatniona DEPC.</li>
	<li>Uruchom kontrolę endogeniczną (RPLP0) w celu względnego oznaczania ilościowego metodą 2-ΔΔCT 19.</li>
	<li>Dodaj próbki w duplikatach i uruchom kontrolę bez szablonu, dodając bufor TE zamiast cDNA. Uruchom PCR w standardowych warunkach (2 min w 50 °C, 10 min w 95 °C, 40 cykli po 15 s w 95 °C i 1 min w 60 °C).</li>
	<li>Przeprowadzić względną kwantyfikację celów mRNA zgodnie z porównawczą metodą CT. Ilość mRNA znormalizowanego do próbki wyjściowej oblicza się jako 2-ΔΔCT, podczas gdy ΔΔCT jest różnicą między ΔCT (CT target - kontrola endogenna CT) próbki a ΔCT (cel CT i kontrola endogenna CT) próbki wyjściowej.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja zawartości białka w pożywce IVD
<ol>
	<li>Pobrać pożywkę kondycjonowaną przez próbki do diagnostyki in vitro w celu zmierzenia zawartości białka w pożywce. Wykonać test immunoenzymatyczny (ELISA) zgodnie z protokołem białka docelowego.</li>
	<li>Interleukina bydlęca-8 (IL-8) jest oznaczana ilościowo za pomocą zestawu ELISA przeciw bydlęcej IL8 zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+incidence%2C+prevalence%2C+and+years+lived+with+disability+for+328+diseases+and+injuries+for+195+countries%2C+1990-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).</li>
<li>Hoy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+global+burden+of+low+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Measuring the global burden of low back pain.</a> Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).</li>
<li>Thiese, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+low+back+pain+by+anatomic+location+and+intensity+in+an+occupational+population%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskeletal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283(2014).</li>
<li>Katz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+Disc+Disorders+and+Low-Back+Pain%3A+Socioeconomic+Factors+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+%28American%29%22%5BJournal%5D)">Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21(2006).</li>
<li>Vlaeyen, J. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Low back pain.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52(2018).</li>
<li>Khan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+biomarkers+of+low+back+pain+and+disc+degeneration%3A+a+review%3A+Biomarkers+of+disc+degeneration+and+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).</li>
<li>Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+Degenerative+Disease+Part+1%3A+Anatomy+and+Pathophysiology+of+Intervertebral+Discogenic+Pain+and+Radiofrequency+Ablation+of+Basivertebral+and+Sinuvertebral+Nerve+Treatment+for+Chronic+Discogenic+Back+Pain%3A+A+Prospective+Case+Series+and+Review+of+Literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483(2020).</li>
<li>Adams, M. A., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+Intervertebral+Disc+Degeneration%2C+and+What+Causes+It%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It.</a> Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).</li>
<li>Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+Disc+Diseases+Part+2%3A+A+Review+of+the+Current+Diagnostic+and+Treatment+Strategies+for+Intervertebral+Disc+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135(2020).</li>
<li>Lurie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+Versus+Nonoperative+Treatment+for+Lumbar+Disc+Herniation%3A+Eight-Year+Results+for+the+Spine+Patient+Outcomes+Research+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial.</a> Spine. 39 (1), 3-16 (2014).</li>
<li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration%3A+pain+and+disc+content%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li>
<li>Ponnappan, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organ+culture+system+to+model+early+degenerative+changes+of+the+intervertebral+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171(2011).</li>
<li>O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Animals+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc+Geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry.</a> Spine. 32 (3), 328-333 (2007).</li>
<li>Stannard, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+whole+organ+culture+model+for+intervertebral+disc+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Translation%22%5BJournal%5D)">Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+ex-vivo+Testing+of+Anti-inflammatory+Drugs+in+a+Bovine+Intervertebral+Degenerative+Disc+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ex+vivo+cavity+model+to+study+repair+strategies+in+loaded+intervertebral+discs%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs.</a> European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).</li>
<li>Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hyaluronic+acid+down-regulates+interferon+signaling+molecules%2C+IGFBP3+and+IFIT3+in+the+bovine+intervertebral+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc.</a> Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).</li>
<li>Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-quality+RNA+from+intervertebral+disc+tissue+via+pronase+predigestion+and+tissue+pulverization%5BTitle%5D)+AND+%22JOR+Spine%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization.</a> JOR Spine. 1 (2), 1017(2018).</li>
<li>Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+housekeeping+genes+in+human+intervertebral+disc%2C+endplate+and+articular+cartilage+cells+in+multiple+conditions+for+reliable+transcriptional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis.</a> European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).</li>
<li>Lang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intervertebral+disc+whole+organ+culture+system+to+investigate+proinflammatory+and+degenerative+disc+disease+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+intervertebral+disc+cell+and+organ+culture+models+induced+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22JOR+Spine%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha.</a> JOR Spine. 3, 1104(2020).</li>
<li>Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TNF%CE%B1+in+intervertebral+disc+degeneration%3A+A+non-recoverable+catabolic+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).</li>
<li>Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+Transport+Induced+by+Dynamic+Loading+Alters+Biomechanics+of+Intact+Intervertebral+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs.</a> PLOS One. 10 (3), 0118358(2015).</li>
<li>Gullbrand, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+animal+model+that+recapitulates+the+spectrum+of+human+intervertebral+disc+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).</li>
<li>Willems, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+intradiscal+injection+and+biocompatibility+of+polyester+amide+microspheres+in+a+canine+model+predisposed+to+intervertebral+disc+degeneration%3A+intradiscal+application+of+pea+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).</li>
<li>Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+needle+puncture+injury+on+microscale+shear+strain+in+the+intervertebral+disc+annulus+fibrosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus.</a> The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).</li>
<li>Illien-Jünger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combined+effects+of+limited+nutrition+and+high-frequency+loading+on+intervertebral+discs+with+endplates%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates.</a> Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).</li>
<li>Gantenbein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+bioreactors--platforms+to+study+human+intervertebral+disc+degeneration+and+regenerative+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).</li>
<li>Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+regulating+viable+cell+density+in+the+intervertebral+disc%3A+blood+supply+in+relation+to+disc+height%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height.</a> Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).</li>
<li>Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+involved+in+the+nutrition+of+the+human+lumbar+intervertebral+disc%3A+cellularity+and+diffusion+of+glucose+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro.</a> Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).</li>
<li>Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Animal+Discs+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc%3A+Axial+Compression+Mechanics+and+Glycosaminoglycan+Content%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content.</a> Spine. 33 (6), 166-173 (2008).</li>
<li>Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+bioreactor+system+for+dynamic+loading+and+mechanical+characterization+of+whole+human+intervertebral+discs+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture.</a> Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).</li>
<li>Rajan, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-Like+Receptor+4+%28TLR4%29+Expression+and+Stimulation+in+a+Model+of+Intervertebral+Disc+Inflammation+and+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration.</a> Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).</li>
<li>vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+marker+genes+distinguish+inner+and+outer+annulus+fibrosus+from+nucleus+pulposus+tissue+in+the+bovine+intervertebral+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402(2017).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cell+phenotype+induction+with+TGF-%CE%B21+and+collagen-polyurethane+scaffold+for+annulus+fibrosus+rupture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair.</a> European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).</li>
<li>Risbud, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+phenotype+of+young+healthy+nucleus+pulposus+cells%3A+recommendations+of+the+Spine+Research+Interest+Group+at+the+2014+annual+ORS+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiliśmy tutaj szczegółowy protokół symulacji zwyrodnieniowego i zapalnego IVDD. Protokół ten może być stosowany do szczegółowych badań szlaków zapalnych prowadzących do destrukcyjnego wpływu na dysk. Co więcej, protokół może pomóc w określeniu obiecujących celów terapeutycznych zaangażowanych w postęp choroby.
Niedawno wykazaliśmy, że ludzki rekombinowany TNF-α może indukować stan zapalny zarówno w bydlęcych, jak i ludzkich komórkach NP21, co jest zgodne z innym...

Ból dolnego odcinka kręgosłupa (LBP) może dotyczyć osób w każdym wieku i jest główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie1,2,3. Całkowity koszt związany z LBP przekracza 100 miliardów dolarów rocznie4,5. Symptomatyczna degeneracja krążka międzykręgowego (IVD) (IDD), stan charakteryzujący się stanem zapalnym i degradacją tkanek, jest główną przyczyną LBP6,7. W szczególności IDD charakteryzuje się stopniowo postępującym rozpadem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) krążka międzykręgowego, indukowanym i wyzwalanym przez liczne czynniki, co prowadzi do przyspieszonej patologii, zaburzeń neurologicznych, a ostatecznie do niepełnosprawności. Ponadto IDD wiąże się z uwalnianiem cytokin prozapalnych, zmienioną biomechaniką kręgosłupa, angiogenezą oraz wrastaniem nerwów, co nasila odczuwanie bólu, prowadząc w całości do przewlekłego LBP (aktywnej dyskopatii)6,8. Do tej pory opcje terapeutyczne obejmowały dyscektomię i następczą fuzję sąsiednich kręgów, implantację protezy IVD lub metody nienastępowe, takie jak niesteroidowe leki przeciwzapalne, opioidy i leki rozluźniające mięśnie dla pacjentów z IDD9. Zarówno obecne standardowe opcje terapeutyczne, chirurgiczne, jak i zachowawcze, są jedynie częściowo skuteczne i nie rozwiązują podstawowego problemu biologicznego9,10. Wczesne stadium choroby zwyrodnieniowej krążka międzykręgowego charakteryzuje się początkową zapalną odpowiedzią tkankową, zwłaszcza zwiększoną ekspresją czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-alpha)11. Te wczesne zmiany w krążku występują głównie na poziomie komórkowym, nie naruszając architektury krążka, i mogły być wcześniej naśladowane przez niedobory żywieniowe w warunkach prozapalnych12. Dlatego kluczowe jest precyzyjne symulowanie sytuacji in vivo w celu zbadania tych mechanizmów degeneracji i znalezienia odpowiednich celów terapeutycznych. Dodatkowo do tych symulacji właściwości molekularnych, kluczową rolę w zmianach patologicznych i fizjologicznych IVD odgrywa środowisko obciążeń mechanicznych krążków. W konsekwencji połączenie tych podejść przybliżyłoby nas do odtworzenia złożonego mikrośrodowiska IVD in vivo. Według naszej wiedzy obecnie nie istnieją badania uwzględniające aspekt dynamicznego obciążania wraz z warunkami prozapalnymi i żywieniowymi.
Choć modele na dużych zwierzętach umożliwiają badanie potencjalnie istotnych oddziaływań in vivo, są one kosztowne i pracochłonne. Ponadto, ponieważ stosowanie modeli zwierzęcych w badaniach od dawna budzi kontrowersje, duże zainteresowanie budzi ograniczanie liczby zwierząt niezbędnych do odpowiedzi na istotne pytania badawcze. Wreszcie, obecnie nie istnieje idealny model zwierzęcy do odwzorowania IDD w badaniach nad IVD13,14. Dlatego konieczne jest opracowanie kosztowo efektywnej i niezawodnej alternatywy, takiej jak model hodowli organów, aby symulować IDD oraz związane z nim procesy zapalne i degeneracyjne. Niedawno zastosowanie niniejszego protokołu dotyczącego ustanowienia pro zapalnego i degeneracyjnego modelu hodowli organów w celu symulacji wczesnego stadium choroby krążka międzykręgowego pozwoliło nam zbadać wpływ leków przeciwzapalnych w modelu hodowli organów IDD15.
W niniejszej pracy opisujemy sposób pozyskiwania krążków międzykręgowych bydlęcych oraz indukowania stanu wczesnego etapu IDD poprzez stworzenie katabolicznego i prozapalnego mikrośrodowiska za pomocą bezpośredniego wstrzyknięcia do krążka czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α) oraz zastosowania obciążenia degeneracyjnego w bioreaktorze w warunkach niskiej podaży składników odżywczych w medium. Rysunek 1 ilustruje model eksperymentalny i przedstawia bioreaktor wykorzystany do symulacji degeneracyjnych oraz fizjologicznych warunków obciążenia.
<img alt="Schemat procesu degeneracji dysku międzykręgowego, przedstawiający degradację tkanek, stan zapalny i konfigurację hodowli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62100/62100fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja układu eksperymentalnego. A: ogon bydlęcy; B: wypreparowane bydlęce dyski międzykręgowe; C: przeniesienie dysku do płytki wielodołkowej z pożywką hodowlaną; D: ładowanie symulacji do bioreaktora; E: technika iniekcji wewnątrzdyskowej; F: IVD po wstrzyknięciu PBS/barwnika błękitu trypanowego w celu ukazania rozkładu. IDD: degeneracja dysku międzykręgowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62100/62100fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>1-bromo-3-chloropropan (BCP)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian-2-fosforan</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Piła taśmowa</td><td>Exakt Apparatebau, Norderstedt, Niemcy</td><td>model 30/833</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Munndipharma, Frankfurt, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bydło IL-8 Test ELISA</td> <td>zrób to samKingfisher Biotech, St. Paul, Stany Zjednoczone</td><td>DIY1028B-003</td><td></td></tr><tr><td>Corning ITS Premix</td><td>Corning Inc., Nowy Jork, USA</td><td>354350</td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoka glukoza</td><td>Gibco firmy life technologies, Carlsbad, USA</td><td>10741574</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o niskiej zawartości glukozy</td><td>Gibco firmy life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11564446</td><td></td></tr><tr><td>Etanol w biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>09-0851</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco firmy life technologies, Carlsbad, USA</td><td>A4766801</td><td></td></tr><tr><td>Nieistotny roztwór aminokwasów</td><td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna(P/S)</td><td>gibco firmy life technologies, Karlowe Wary, USA</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy, tabletka</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Sandiego, Stany Zjednoczone</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Pulsavac Jet Lavage System</td><td>Zimmer, IN, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen, Venlo, Holandia</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidinn-HRP</td><td>Kingfisher Biotech, St. Paul, Stany Zjednoczone</td><td>AR0068-001</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny VILO</td><td>Invitrogen firmy life Technologies, Carlsbad, USA</td><td>10704274</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>10400745</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa, rekombinowane białko ludzkie</td><td>R& D systems, Minnesota, USA</td><td>210-TA-005</td><td></td></tr><tr><td>TRI Odczynnik</td><td>Centrum Badań Molekularnych, Cincinnati, USA</td><td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy Tris-EDTA</td><td>sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Gen bIL-6</td><td>Stosowane biosystemy według technologii życiowych</td><td>Sondy</td> <td>wykonane na zamówieniePodkład fw (5&prime; &ndash; 3&prime;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5&prime; &ndash; 3&prime;) Sonda TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT (5&prime; FAM/3&prime; TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT</td></tr><tr><td>Gen bIL8</td><td>Biosystemy stosowane według technologii życia</td><td>Bt03211906_m1</td><td></td></tr><tr><td>Gen bTNF-alpha</td><td>Biosystemy stosowane według technologii życia</td><td>Sondy wykonane na zamówienie</td><td>Primer fw (5&prime; &ndash; 3&prime;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5&prime; &ndash; 3&prime;) Sonda GAG CTG CCC CGG AGA GTT (5&prime; FAM/3&prime; TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G</td></tr><tr><td>GEN bIL1beta</td><td>Biosystemy stosowane przez technologie życia</td><td>Sondy wykonane na zamówienie Podkład</td><td>fw (5&prime; &ndash; 3&prime;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA GCT GTT Primer rev (5&prime; &ndash; 3&prime;) Sonda GGT CCA GGT GTT GGA TGC A (5&prime; FAM/3&prime; TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A</td></tr><tr><td>RPLP0</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>Bt03218086_m1</td><td></td></tr></tbody></table>

prozapalny, zwyrodnieniowy model hodowli narządów symulujący wczesne stadium choroby krążka międzykręgowego.

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Objawowe zwyrodnienie krążka międzykręgowego (IVD) (IDD) jest głównym obciążeniem społeczno-ekonomicznym i charakteryzuje się stanem zapalnym i degradacją tkanek. Ze względu na brak terapii przyczynowych istnieje pilna potrzeba opracowania innowacyjnych eksperymentalnych modeli hodowli narządów, aby zbadać mechanizmy związane z postępem choroby, znaleźć cele terapeutyczne i zmniejszyć zapotrzebowanie na modele zwierzęce. Przedstawiamy nowatorski, trójwymiarowy protokół modelu hodowli narządów naśladujący mikrośrodowisko prozapalne i kataboliczne, które występuje podczas IDD. 
Początkowo, bydlęce doogonowe IVD były preparowane, czyszczone i hodowane w pożywce do hodowli tkankowej. Dynamiczne obciążenie fizjologiczne lub patologiczne stosowano w specjalnie przygotowanym bioreaktorze przez 2 godziny dziennie. Diagnostykę in vitro przydzielono do grupy kontrolnej (podłoże o wysokim poziomie glukozy, obciążenie fizjologiczne, wstrzyknięcie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) i grupy patologicznej (podłoże o niskiej zawartości glukozy, obciążenie patologiczne, wstrzyknięcie czynnika martwicy nowotworu alfa) przez cztery dni. Przeprowadzono analizę ekspresji genów z pobranych komórek jądra miażdżystego IVD oraz test immunoenzymatyczny kondycjonowanych pożywek do hodowli narządów. 
Nasze dane wykazały wyższą ekspresję markerów stanu zapalnego i zmniejszoną wysokość dysku po obciążeniu w grupie patologicznej w porównaniu do grupy kontrolnej. Protokół ten jest niezawodny w symulacji zapalenia i zwyrodnienia IVD i może być dalej rozszerzany w celu poszerzenia jego zakresu zastosowania.

Obciążenie degeneracyjne w medium z niską zawartością glukozy w połączeniu z iniekcją TNF-α spowodowało istotny wzrost ekspresji genów markerów prozapalnych interleukiny 6 (IL-6) i interleukiny 8 (IL-8) w komórkach NP po 4 dniach hodowli w porównaniu z fizjologiczną grupą kontrolną (Rycina 2). W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano istotnych zmian w ekspresji genów prozapalnych interleukiny 1β (IL-1β) oraz TNF-α w komórkach NP (dane nie pokazano). Ponadto warunki hodowli degeneracyjnej...

Ten protokół przedstawia nowatorski eksperymentalny model prozapalnej, zwyrodnieniowej hodowli narządów bydlęcych do symulacji wczesnego stadium zwyrodnienia krążka międzykręgowego.

Prozapalny, zwyrodnieniowy model hodowli narządów symulujący wczesne stadium choroby krążka międzykręgowego.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Protokół ma na celu symulację warunków in vivo zwyrodnienia krążka międzykręgowego w celu zbadania jego patofizjologii bez konieczności stosowania modeli zwierzęcych. W porównaniu z hodowlą komórkową in vitro, technika hodowli narządowej w bioreaktorze utrzymuje komórki w ich naturalnym biologicznym i biomechanicznym mikrośrodowisku, a także zapewnia kontrolowane i powtarzalne warunki hodowli. Zacznij od dokładnego spłukania całego ogona bydlęcego wodą z kranu, aby usunąć brud i sierść z powierzchni, a następnie zanurz ogon w 1% roztworze betadyny na 10 minut, aby zdezynfekować powierzchnię.Użyj skalpela numer 20, aby usunąć tkankę miękką z kręgosłupa ogonowego, aby ułatwić identyfikację krążków międzykręgowych lub IVD. Usuń wyrostki kolczyste i poprzeczne kręgów za pomocą szczypiec do usuwania kości. Przeciąć poprzecznie szczypcami do kości przez środek każdego trzonu kręgu, aby uzyskać poszczególne segmenty ruchu, a następnie umieścić zebrane segmenty ruchu na szalce Petriego z gazą zwilżoną roztworem Ringera.Zlokalizuj IVD w kręgach, delikatnie przesuwając segmenty ruchu, a następnie zidentyfikuj położenie płytki wzrostowej, dotykając i znajdując wypukłą stronę kostnej płytki końcowej. Schłodzić ostrze piły taśmowej roztworem Ringera i użyć go do wykonania dwóch równoległych nacięć w płytce wzrostowej IVD, po jednym z każdej strony. Przenieść IVD na czystą płytkę Petriego z czystą gazą zwilżoną roztworem Ringera.Zeskrob trzon kręgu i płytkę wzrostową za pomocą ostrza skalpela, pozostawiając nienaruszoną płytkę końcową. Ustawić dwie powierzchnie płasko i równolegle do procedury załadunku i przenieść zeskrobane IVD na świeżą płytkę Petriego z gazą zwilżoną roztworem Ringera. Zmierz wysokość i średnicę krążka za pomocą suwmiarki, a następnie oczyść skrzepy krwi w kości kręgów roztworem Ringera za pomocą systemu płukania strumieniowego.Dezynfekować IVD w PBS i 10% penicylinie streptomycynie, wstrząsając przez 15 minut. Spłucz antybiotyki o wysokim stężeniu PBS i 1% penicyliny streptomycyny. Przenieś krążki do komór IVD zawierających pięć mililitrów pożywki hodowlanej IVD i umieść je w systemie bioreaktora z inkubatorem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 85% i 5% dwutlenku węgla.Hoduj dyski przez cztery dni w systemie bioreaktora, utrzymując różne warunki obciążenia zgodnie z grupami eksperymentalnymi. W fizjologicznej grupie kontrolnej posiewaj IVD z podłożem o wysokim poziomie glukozy, stosując protokół ładowania od 0,02 do 0,2 megapaskali i 0,2 herca przez dwie godziny dziennie. W grupie patologicznej należy hodować IVD z pożywką o niskim poziomie glukozy, stosując protokół ładowania od 0,32 do 0,5 megapaskali i pięciu herców przez dwie godziny dziennie.Pomiędzy procedurami ładowania należy umieścić IVD na sześciodołkowych płytkach z siedmioma mililitrami pożywki hodowlanej IVD, aby zapewnić swobodną regenerację pęcznienia. Codziennie mierzyć wysokość tarczy za pomocą suwmiarki po okresie swobodnego pęcznienia i po obciążeniu dynamicznym przez czas trwania doświadczenia. Po pierwszym cyklu dynamicznego ładowania pierwszego dnia, należy bezpośrednio umieścić IVD na szalce Petriego w pozycji pionowej i ustabilizować je pęsetą.Wstrzyknąć rekombinowany TNF-alfa za pomocą igły insulinowej o rozmiarze 30 powoli z prędkością około 70 mikrolitrów na minutę do IVD grupy patologicznej. Po wstrzyknięciu należy odciągnąć strzykawkę do połowy i pociągnąć tłok, aby wytworzyć podciśnienie, które zapobiegnie wyciekaniu wstrzykniętego roztworu, a następnie całkowicie wyjąć strzykawkę z systemu IVD. Obciążenie zwyrodnieniowe w połączeniu z ograniczoną podażą składników odżywczych i wstrzyknięciem TNF-alfa spowodowało znaczny wzrost ekspresji genów markerów prozapalnych interleukiny szóstej i interleukiny ósmej w tkance NP po czterech dniach hodowli.Uwalnianie białka interleukiny ósmej do kondycjonowanej pożywki wykazało wyraźny wzrost w grupie patologicznej w drugim i czwartym dniu. Zmniejszenie wysokości dysku po obciążeniu było większe w grupie patologicznej w porównaniu z grupą fizjologiczną, a różnice były wyraźniejsze po drugim i trzecim dniu w porównaniu z pierwszym dniem, co wskazuje na postępujący efekt stanów zwyrodnieniowych i zapalnych. Ustandaryzowana technika preparacji jest ważna dla odtwarzalnych modeli hodowli całych narządów IVD.Bioreaktor jest niezbędny do nakładania obciążeń fizjologicznych i zwyrodnieniowych na IVD w celu symulacji różnych warunków biomechanicznych in vivo. Technika ta może być stosowana na eksplantatach IVD u ludzi, co ma duże znaczenie kliniczne. Jest to nowatorski model przedkliniczny do opracowywania skutecznych metod leczenia zwyrodnienia dysku we wczesnym stadium.

a-proinflammatory-degenerative-organ-culture-model-to-simulate-early

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół przedstawia technikę pobierania kręgów szyjnych z krążków międzykręgowych bydła do hodowli organów in vitro.

Przygotowanie nienaruszonych krążków międzykręgowych z ogona bydlęcego do hodowli organowej

Ten film demonstruje technikę hodowli krążków międzykręgowych bydła w bioreaktorach w celu opracowania trójwymiarowego modelu hodowli narządów. Do krążków międzykręgowych stosuje się określone pożywki pozbawione składników odżywczych i zwyrodnieniowe warunki ciśnienia, naśladując prozapalne i zwyrodnieniowe mikrośrodowisko obserwowane we wczesnym stadium choroby krążka międzykręgowego. Wysokość tarczy jest mierzona po zabiegu w celu przeanalizowania skutków niedoboru składników odżywczych i...

Generowanie modelu hodowli narządów prozapalnych w celu symulacji wczesnej choroby krążka międzykręgowego

Ten film pokazuje rozwój prozapalnego i zwyrodnieniowego modelu hodowli narządów we wczesnym stadium choroby krążka międzykręgowego (IVD) przy użyciu TNF-α. Przedstawiono w nim procedurę wstrzykiwania TNF-α do krążka międzykręgowego i wyjaśniono mechanizmy, za pomocą których TNF-α indukuje stan zapalny i degradację IVD.

Generowanie modelu hodowli narządów w celu symulacji wczesnego stadium choroby krążka międzykręgowego

Hodowla całego narządu krążka międzykręgowego (IVD) zachowuje natywną macierz zewnątrzkomórkową, fenotypy komórkowe i interakcje między komórką a macierzą. W tym miejscu opisujemy system hodowli IVD z wykorzystaniem mysich lędźwiowych i ogonowych IVD w ich funkcjonalnych jednostkach kręgosłupa oraz kilka zastosowań wykorzystujących ten system.

Model hodowli narządowej in vitro mysiego krążka międzykręgowego

Zwyrodnienie krążka międzykręgowego jest znaczącym czynnikiem przyczyniającym się do bólu pleców i główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie. Istnieje wiele zwierzęcych modeli zwyrodnienia krążka międzykręgowego. Demonstrujemy owczy model zwyrodnienia krążka międzykręgowego, wykorzystując wiertło, które osiąga stały uraz dysku i powtarzalny poziom zwyrodnienia dysku.

Model zwyrodnienia krążka międzykręgowego odcinka lędźwiowego owiec z wykorzystaniem bocznego urazu wiertła zaotrzewnowego

Opracowaliśmy model zwyrodnienia krążka międzykręgowego w odcinku lędźwiowym myszy poprzez resekcję wyrostków kolczystych L3–L5 wraz z więzadłami nad- i międzykolcowymi oraz odłączeniem mięśni przykolcowych.

Mysi model niestabilności odcinka lędźwiowego kręgosłupa

Prezentujemy metodę badania przestrzennej organizacji chondrocytów w pierścieniu włóknistym krążka międzykręgowego za pomocą metody optycznego przekroju.

Przekrój optyczny i wizualizacja krążka międzykręgowego od rozwoju embrionalnego do zwyrodnienia

System pomiaru dotyku palca określa ilościowo nacisk dotykowy na palec za pomocą bardzo czułego elektrochirurgicznego czujnika nacisku, z oprogramowaniem wyświetlającym i dokładnie rejestrującym dane dotyczące nacisku i wideo w czasie rzeczywistym. Dwa moduły analityczne ujednolicają przetwarzanie danych na potrzeby śledzenia kciuka i kondycjonowania podczas Tuina.

Efekty operacyjne i interwencyjne celowanej tuiny u królików z modelem zwyrodnienia krążka międzykręgowego w odcinku lędźwiowym

Myszy były używane jako model do badania wielu form transplantacji, w tym przeszczepu rogówki.  W niniejszym raporcie opisujemy mysi model zarówno do ostrego, jak i późnego przeszczepu rogówki.

Przeszczep rogówki u myszy: model do badania najczęstszej formy przeszczepu narządów litych

Perfuzja płuc Ex-Vivo (EVLP) umożliwiła przeszczep płuc u ludzi dzięki umożliwieniu oceny narządów i rozszerzeniu puli dawców. W tym miejscu opisujemy rozwój programu EVLP dla szczurów i udoskonalenia, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu do przyszłej rozbudowy.

Metoda izolowanej perfuzji płuc ex vivo w modelu szczurzym: wnioski wyciągnięte z opracowania programu EVLP dla szczurów

Poznaj trójwymiarowy model hodowli narządów krążków międzykręgowych wołowych, symulujący prozapalne środowisko zwyrodnienia. Ta metoda umożliwia badanie patofizjologii choroby i testowanie terapii bez użycia zwierząt.

Prozapalny, zwyrodnieniowy model hodowli narządów symulujący wczesne stadium choroby krążka międzykręgowego.

Przeglądaj więcej filmów