Name: Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę dostarczania analogów kwasów tłuszczowych do komórek HEK-293T z wykorzystaniem zmydlonych kwasów i bezkwasowego BSA. Protokół zwiększa wykrywalność acylowanych białek tłuszczowych poprzez chemiczną detekcję typu click z fluorescencyjnymi azydami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Radę Badań Naukowych i Inżynieryjnych (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao została sfinansowana ze stypendium The Ram and Lekha Tumkur Memorial Scholarship za pośrednictwem Wydziału Biologii Uniwersytetu Waterloo oraz stypendium Lucy Morrison Memorial za pośrednictwem IODE Ontario, oprócz finansowania badań podyplomowych z University of Waterloo, obejmującego stypendium badawcze dla absolwentów (50503-11072), nagrodę dla absolwentów nauk ścisłych i asystenturę dla absolwentów. Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratorium Martina za ich wsparcie w przygotowaniu tego manuskryptu, w szczególności Stephanie Ryall, Harleen Gill i Sadii Khan, które pomogły początkowo założyć Laboratorium Martina w ramach przygotowań do tych badań. Autorzy pragną również podziękować dr. Lucowi Berthiaume'owi za uprzejmy dar w postaci konstruktów ctHTT-GFP oraz dr. Shaunowi Sandersowi za krytyczny wkład w przygotowanie manuskryptu. Rysunek 3 został stworzony przy użyciu BioRender.com.

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Aby uzupełnić DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) do hodowli komórkowych, dodaj 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1x penicylinę-streptomycynę, 2 mM L-glutaminę i 100 mM pirogronian sodu (1% obj./obj.).</li>
	<li>Umieść około 5 x 105 HEK293T komórek/studzienkę na 6-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowych i hoduj przez 18 godzin w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 do osiągnięcia 75% -80% zgrywy.</li>
	<li>Niedobór kwasów tłuszczowych w surowicy
	<ol>
		<li>Aby przygotować nośniki do etykietowania, przygotuj DMEM jak wyżej (krok 1.1) bez 10% FBS. Zastąp FBS 5% dekstranem i węglem drzewnym FBS (DCC-FBS). Przed użyciem podgrzać do 37 °C.</li>
		<li>Delikatnie umyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej i zastąp mediami do etykietowania. 
		UWAGA: HEK293T komórki łatwo odrywają się od płytek do hodowli tkankowych. Zachowaj ostrożność podczas mycia ogniw i wymiany mediów. Należy zminimalizować mieszanie podczas przenoszenia do i z inkubatora w jak największym stopniu.</li>
		<li>Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% stężeniem CO2 i inkubować przez około 45 minut (co najmniej 15 minut jest skuteczne), do 60 minut, przed przystąpieniem do znakowania metabolicznego kwasami tłuszczowymi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i zmydlenie analogów kwasów tłuszczowych
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe alkinylowych kwasów tłuszczowych z wyprzedzeniem przez solubilizację w DMSO w celu osiągnięcia następujących stężeń i przechowywać w temperaturze -20 °C. W razie potrzeby rozmrozić w temperaturze pokojowej. Preparaty do ich najlepszych osiągów należy przechowywać w N2 lub Ar. 
	Mirysynian alkinylu (kwas 13-tetradecynowy, 13-TDYA): 25 mM 
	Palmitynian alkinylu (kwas 15-heksadecynowy; 15-HDYA): 100 mM 
	Stearynian alkinylu (kwas 17-oktadecynowy; 17-ODYA): 100 mM</li>
	<li>Aby przygotować 20% BSA bez kwasów tłuszczowych (FAFBSA), zważ 2 g FAFBSA w jednorazowej tubie o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Uzupełnić do 10 ml wstępnie podgrzanym (37 °C) DMEM.</li>
		<li>Wymieszać przez obracanie od końca do końca lub przez wirowanie i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego rozpuszczenia FAFBSA.</li>
		<li>Użyj filtra 0,2 μm do przefiltrowania, wysterylizuj pożywkę.</li>
		<li>Podwielokrotność porcji w objętości około 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. W razie potrzeby rozmrozić i ogrzać do 37 °C w łaźni wodnej przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zwiększyć rozpuszczalność kwasów tłuszczowych i analogów kwasów tłuszczowych, zmydlaj się przez inkubację z 20% nadmiarem molowym wodorotlenku potasu (KOH) w 3 ml szklanych stożkowych fiolkach reakcyjnych. 
	UWAGA: Te fiolki pozwalają soli pozostać rozpuszczalną, jednocześnie zapewniając, że FAFBSA nie zastyga pod wpływem wysokiej temperatury. Zastosowanie szkła zapobiega również przywieraniu kwasów tłuszczowych do plastiku.
	<ol>
		<li>Odpipetować co najmniej 2 μl analogu alkinylowych kwasów tłuszczowych bezpośrednio na dno stożkowej fiolki reakcyjnej o pojemności 3 ml. Przygotować 2 μl lipidów na studzienkę użytej płytki 6-dołkowej (patrz Tabela 1). 
		UWAGA: Ze względu na hydrofobowość kwasów tłuszczowych, najlepiej jest pokryć końcówkę pipety, kilkakrotnie pobierając żądaną objętość przed dozowaniem jej do fiolki reakcyjnej.</li>
		<li>Rozcieńczyć 1 M KOH do stężeń równych 20% molowemu nadmiarowi znacznika alkinylowych kwasów tłuszczowych (30 mM dla 13-TDYA i 120 mM dla 15-HDYA i 17-ODYA).</li>
		<li>Odpipetować równą ilość rozcieńczonego KOH (1 μl : 1 μl kwasu tłuszczowego: KOH) blisko dna fiolki reakcyjnej na krawędzi szkła, tak aby dozowana objętość KOH zmieszała się z kwasem tłuszczowym.</li>
		<li>Zamknąć wieczko fiolki i delikatnie postukać, aby wymieszać roztwory. 
		UWAGA: Mieszanina może szybko krzepnąć, zwłaszcza przy zwiększaniu się długości łańcucha węglowodorowego kwasu tłuszczowego. Należy uważać, aby nie pipetować ciała stałego (tzn. nie mieszać przez pipetowanie).</li>
		<li>Podgrzewać fiolkę reakcyjną w temperaturze 65 °C przez około 5 minut lub gdy tylko kwas tłuszczowy zostanie włączony (roztwór stanie się klarowny). 
		UWAGA: Kwasy tłuszczowe o większej liczbie atomów węgla i zmniejszonej rozpuszczalności, takie jak stearynian (17-ODYA), mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji, aby w pełni włączyć je do KOH w temperaturze 65 °C. W razie potrzeby podnieść temperaturę do 70 °C. Najlepsza jest kąpiel wodna. Uważaj, aby płyn nie wyparował zbyt mocno.</li>
		<li>Gdy kwasy tłuszczowe trafią do roztworu i nie pozostaną żadne widoczne ciała stałe, pipetę wstępnie podgrzać 20% FAFBSA tak, aby stosunek objętości kwasów tłuszczowych: KOH: FAFBSA wynosił 1: 1: 50, aby osiągnąć końcowe stężenie 20x alkinylowe kwasy tłuszczowe związane z BSA.</li>
		<li>Mieszać, pipetując w górę i w dół. Roztwór zazwyczaj wydaje się klarowny, bez widocznych ciał stałych. 
		UWAGA: Zazwyczaj wszelkie małe ciała stałe przechodzą do roztworu po inkubacji w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Inkubować kwas tłuszczowy i FAFBSA przez 15 minut w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Zmydlona etykieta w tym momencie jest stabilna dłużej niż 15 min. 
		 
		 </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość podłoża (ml)</td>
			<td>Objętość kwasu tłuszczowego lub analogu kwasu tłuszczowego (μL)</td>
			<td>Objętość KOH (μL)</td>
			<td>Obj. 20% FAFBSA (μL)</td>
			<td>Całkowita objętość zmydlonej etykiety sprzężonej z BSA (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td> szt.
			<td>Rozdział 208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>100</td> szt.
			<td>Rozdział 104</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Proporcje oznaczania zmydlonych kwasów tłuszczowych. Eksperymentalne objętości kwasów tłuszczowych, KOH i FAFBSA do zmydlania etykiety kwasów tłuszczowych zgodnie z objętością użytych pożywek.
<ol start="4">
	<li>Jako kontrolę, powtórzyć krok 2.3. z kwasami tłuszczowymi bez etykiety alkinowej.</li>
	<li>Oznacz komórki 1/20 objętości 20-krotnego koniugatu kwasów tłuszczowych BSA bezpośrednio na pożywce głodowej (zazwyczaj 100 μl w 2 ml pożywki/komórki), aby uzyskać końcowe stężenie 1% BSA i 25 μM dla mirystynianu alkinylu lub 100 μM dla palmitynianu alkinylu i stearynianu alkinylu. 
	UWAGA: Aby zminimalizować ilość zakłóceń fizycznych w przyczepionych komórkach, należy utworzyć kroplę na końcu pipety blisko powierzchni pożywki, zamiast pipetować bezpośrednio do pożywki. Jeśli używasz inhibitorów acylacji, dodaj co najmniej 15 minut przed znakowanymi kwasami tłuszczowymi. Czas może się różnić w zależności od zastosowanych komórek lub inhibitora. Również na tym etapie zaleca się stosowanie zmydlania28.
	<ol>
		<li>Dla porównania, dodaj niezmydlone lipidy, pipetując 2 μl (lub równoważną objętości zmydlonego kwasu) nieznakowanego kwasu tłuszczowego bezpośrednio do pożywki głodowej.</li>
		<li>Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i inkubuj przez 3-6 godzin 
		UWAGA: Dla każdego typu komórki lub warunków eksperymentalnych może być konieczne określenie optymalnego czasu etykietowania. Dłuższy czas inkubacji może potencjalnie prowadzić do rozkładu kwasów tłuszczowych przez β-oksydację i/lub włączenie do innych grup lipidów, takich jak fosfolipidy28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie umyj komórki 1x PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zebrać i poddać komórki lizie za pomocą 500 μl wolnego od kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) buforu do zmodyfikowanego testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) (0,1% SDS, 50 mM Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-etanosulfonowy (HEPES) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% detergentu niedenaturującego, 0,5% deoksycholanu sodu, 2 mM MgCl2 ze świeżo dodanym 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 10 μg/μL pepstatyny A (lub koktajlu kompletnych inhibitorów proteazy bez EDTA)) poprzez kołysanie lizatami przez 15 min w 4 °C.
	<ol>
		<li>Odwirować lizaty przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać supernatant w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,7 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do wystąpienia reakcji kliknięcia. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Lizaty są stabilne w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca. Zaleca się jednak przeprowadzenie reakcji kliknięcia w odpowiednim czasie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo stężenia białek za pomocą odpowiedniego testu zgodnie z protokołem producenta, takiego jak test kompatybilny z detergentem (DC).</li>
</ol>
3. Kliknij reakcję na lizaty komórkowe
<ol>
	<li>Przygotuj odczynniki do chemii kliknięć.
	<ol>
		<li>Rozpuścić tris-(benzylotriazolylometylometylo)aminę (TBTA) w DMSO do 2 mM. Przechowywać w małych porcjach ze środkiem osuszającym w temperaturze -20 °C przez okres do 2-3 miesięcy. Najlepiej przechowywać w N2 lub Ar.</li>
		<li>Rozpuść CuSO4 w wodzie ddH2O do uzyskania 50 mM. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.</li>
		<li>Rozpuścić tris-karboksyetylofosfinę (TCEP) w wodzie ddH2O do 250 mM. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C i przygotować świeże rozcieńczenia do 50 mM tuż przed reakcją kliknięcia.</li>
		<li>Przygotować 2 mM azydku w DMSO. Przechowywać w małych porcjach ze środkiem osuszającym w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Najlepiej przechowywać w N2 lub Ar. 
		UWAGA: Zaobserwowano, że produkty z trzema lub więcej grupami glikoli polietylenowych działały najlepiej z biotyną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Doprowadzić 50-100 μg lizatów białkowych w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,7 ml do tej samej objętości, używając tego samego buforu do lizy, co powyżej. 
	UWAGA: Objętość reakcji powinna być jak najmniejsza (20-100 μL).
	<ol>
		<li>Dodaj dodecylosiarczan sodu (SDS) do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 1%.</li>
		<li>Przygotować główną mieszaninę odczynników klikowych tak, aby końcowe stężenia po dodaniu do lizatów wynosiły: 100 μM TBTA (zapas 2 mM), 1 mM CuSO4, (zapas 50 mM), 1 mM TCEP (zapas 50 mM) i sonda azydkowa 100 μM (zapas 2 mM). Odpowiednio połączyć roztwory podstawowe (patrz Tabela 2). 
		UWAGA: Kolejność jest ważna. Całkowicie wymieszaj po dodaniu każdego składnika.</li>
		<li>Dodać odpowiednie objętości mieszanki wzorcowej do lizatów. Mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w ciemności w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Od czasu do czasu mieszać/mieszać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość reakcji (μL)</td>
			<td>Białko obj. (μL)</td>
			<td>Objętość TBTA (2 mM) (μL)</td>
			<td>Objętość CuSO4 (50 mM) (μL)</td>
			<td>Objętość TCEP (50 mM) (μL)</td>
			<td>Objętość sondy azydonowej (2 mM) (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>Rozdział 43</td>
			<td>Rozdział 2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>Rozdział 2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td> szt.
			<td>Rozdział 86</td>
			<td>5</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Kliknij proporcje objętości odczynnika i białka. Eksperymentalne objętości odczynników chemicznych typu click i odpowiadające im stężenia podstawowe, oprócz objętości próbek białek.
4. Kliknij reakcję na białka immunoprecypitowane
<ol>
	<li>Alternatywnie możliwe jest przeprowadzenie reakcji kliknięcia na białkach immunoprecypitowanych (IP) na kulkach lub poza nimi. 
	UWAGA: Zazwyczaj wykonanie klikania koralików prowadzi do najmniejszego tła i jest najlepsze podczas testowania nowych białek, które są przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Komórki transfekcyjne dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, w tym przypadku mirystoilowana C-końcowa huntingtyna typu dzikiego (HTT) połączona z GFP (myr-ctHTT-GFP) i ctHTT-GFP z podstawieniem G2A, przy użyciu koprecypitacji DNA fosforanu wapnia, jak wcześniej opisano41.
		<ol>
			<li>Płytka 2,5 x 105 komórek/dołek w 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i wzrost przez noc do ~ 70-80% konfluencji.</li>
			<li>Przygotować mieszaninę DNA, dodając 2,5 μg DNA w 10 μl z 99,75 μl klasy cząsteczkowejH2Odo probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Następnie dodaj kroplami 15,25 μl CaCl2 do mieszanki DNA.</li>
			<li>Dodać mieszaninę DNA/CaCl2 do oddzielnej probówki zawierającej 125 μL 2x buforowana sól fizjologiczna HEPES (HBS, pH 7,0) w sposób kroplowy z mieszaniem.</li>
			<li>Powoli dodawaj mieszaninę DNA/CaCl2/HBS do komórek. Po 2-4 godzinach wymień pożywkę i inkubuj przez noc. Kontynuuj etykietowanie od kroków 1.3-2.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować równe objętości 500 μg białka w buforze do lizy.</li>
		<li>Przeprowadzić IP, inkubując z króliczym anty-GFP dla ctHTT-GFP, obracając się przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Do każdej probówki dodać 15-20 μl kulek białka G wstępnie zrównoważonych buforem do lizy i pozostawić do reakcji od końca do końca w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.</li>
		<li>Przemyć kulki buforem do lizy i ponownie zawiesić w 45 μl 1% SDS 50 mM buforze HEPES.</li>
		<li>Podgrzewać kulki w temperaturze 80 °C przez 15 minut i odwracać probówki lub mieszać mniej więcej co 5 minut. Krótko obrócić rurki i powrócić do temperatury 80 °C.</li>
		<li>Zebrać sklarowany nad osadem zawierający białka, gdy próbki są jeszcze ciepłe. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać, a próbki immunoprecypitowane mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C, jeśli nie zostaną od razu wykorzystane do chemii kliknięć.</li>
		<li>Pozwolić, aby 43 μl supernatantu zareagować z 7 μl mieszanki wzorcowej odczynników typu click.</li>
		<li>Postępować zgodnie z krokiem 3.2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. SDS-PAGE i western blotting
<ol>
	<li>Zatrzymać reakcję i denaturację, dodając 1x bufor ładujący próbkę zawierający 25 mM ditiotreitolu (DTT) i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 min. 
	UWAGA: Można użyć do 100 mM DTT28. Nie używaj β-merkaptoetanolu z białkami S-acylowanymi, ponieważ może on hydrolizować wiązania tioestrowe i usuwać kliknięty analog kwasu tłuszczowego.</li>
	<li>Krótko odwirować próbki.</li>
	<li>Oddzielić białka za pomocą SDS-PAGE na żelu poliakrylowamidowym, w dwóch egzemplarzach. 
	UWAGA: Do alkalicznego traktowania KOH potrzebne są dwa żele, aby potwierdzić obecność wiązań tioestrowych. W przypadku korzystania z fluorescencyjnej sondy azydkowej, acylację można wykryć w żelu lub po transferze za pomocą wskazanego kanału wzbudzenia.</li>
	<li>Przenieść do membran z polifluorku winylidenu (PVDF) (aktywowanych w metanolu i płukanych w ddH2O - 5 min każda) za pomocą półsuchego aparatu transferowego przy 25 V, 1,0 A (stałym) przez 30 min.</li>
	<li>Po krótkim przepłukaniu membran ddH2O, namocz jedną powtórzoną membranę w 0,1 M KOH w metanolu/wodzie (9:1 v/v), a drugą w 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 w metanolu/wodzie (9:1 v/v) jako niealkaliczną kontrolę przez 60 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.</li>
	<li>Krótko przepłukać membrany w wodzie ddH2O, a następnie 6 razy po 5 minut płukać w PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20). 
	UWAGA: Dokładnie umyć.</li>
	<li>Zablokuj błony na noc w 5% buforze blokującym mleko odtłuszczone (1x PBS, 0,1% Tween20).</li>
</ol>
6. Wykonaj western blot
<ol>
	<li>Tam, gdzie jest to wskazane, sondować fluorescencyjnie znakowaną streptawidyną (1:5000) i kontrolą obciążenia, rodaminą anty-GAPDH (1:5000) w 5% buforze blokującym BSA (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) w temperaturze pokojowej przez 45-60 minut z delikatnym kołysaniem, w ciemności.
	<ol>
		<li>Zbadaj immunoprecypitowany blot białkowy najpierw pierwszorzędowym przeciwciałem anty-GFP w 5% buforze blokującym mleko odtłuszczone, a następnie odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w 5% BSA, jak w kroku 6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myć membrany przez 5 minut w PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) w sumie cztery powtórzenia i spłukać wodą ddH2O przed obrazowaniem.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bezpośrednie dodanie kwasów tłuszczowych do komórek w hodowli może powodować nierozpuszczalność, wytrącanie się lipidów i lipotoksyczność40. W związku z tym dodawanie kwasów tłuszczowych bezpośrednio do komórek może nie tylko skutkować słabym wychwytem komórkowym i niską dostępnością znacznika kwasu tłuszczowego, ale także zmniejszeniem liczby żywotnych komórek do dalszej analizy, a także aktywacją szlaków niedocelowych. Jednak wiele protokołów znakowania metabolicznego do wykrywania chemii kliknięć obejmuje bezpośrednie dodawanie kwasów tłuszczowych, a duża liczba badań proteomu palmitoilowego wykorzystujących do tej pory detekcję chemiczną kliknięcia rzadko zmydlanie etykiet kwasów tłuszczowych lub inkubacja ich z BSA8,36. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę fakt, że skuteczność i czułość wykrywania chemicznego białek acylowanych za pomocą tłuszczów zależy od wystarczającego wychwytu komórkowego analogów kwasów tłuszczowych. Dlatego uzasadnione jest spekulowanie, że wiele białek acylowanych S mogło uniknąć wykrycia w badaniach proteomicznych ze względu na niską dostępność znaczników kwasów tłuszczowych z powodu słabego włączenia do komórek, zwłaszcza gdy zastosowano kwas tłuszczowy o dłuższym łańcuchu 17-ODYA. 17-ODYA, czyli stearynian alkinylu, jest powszechnie stosowaną etykietą z wyboru w kilku badaniach ze względu na jego dostępność komercyjną i wczesne zastosowanie 8,36. Jednak wyniki tego protokołu pokazują, że zmydlenie 17-ODYA powoduje największy wzrost wykrywalności białek S-acylowanych w porównaniu z krótsza łańcuchowa kwasowość tłuszczowa, taka jak palmitynian lub mirystynian. Dlatego powtórzenie tych eksperymentów ze zmydlonymi etykietami może dać dodatkowe substraty S-acylacji, które mogły być wcześniej przeoczone. Ponadto, podczas gdy większość acylotransferaz palmitoilowych preferuje palmitynian do S-acylacji, niektóre preferują inne długości kwasów tłuszczowych, takie jak stearynian 15,38,44. Ponadto niektóre białka, a nawet określone miejsca w białkach, preferują jeden kwas tłuszczowy nad innym15,45. W związku z tym badania z użyciem 17-ODYA mogą mieć tendencję do skłaniania się ku białkom S-acylowanym stearynianem, a nie palmitynianem, a jednocześnie niedostatecznie reprezentować te białka ze względu na niższą wykrywalność.
Zwiększona wydajność znakowania metabolicznego w chemii kliknięć opiera się na zmydlaniu lipidów i inkubacji z etapami FAFBSA, a także na zdelipidowanym FBS. Wszystkie kwasy tłuszczowe muszą zostać całkowicie zmydlone w KOH bez widocznych ciał stałych przed przystąpieniem do inkubacji z FAFBSA. Może to być trudny krok, a czas ma kluczowe znaczenie. Po tym, jak zmydlone kwasy tłuszczowe trafią do roztworu w temperaturze 65 °C, należy natychmiast dodać ciepłe BSA, ponieważ dalsze ogrzewanie spowoduje odparowanie DMSO z kwasów tłuszczowych. Ponadto zmydlona etykieta zacznie ponownie krzepnąć, gdy tylko zacznie się ochładzać. Dlatego FAFBSA musi być ciepła i szybko dodana po tym, jak sól stanie się rozpuszczalna. Szklane fiolki reakcyjne i ich kształt są ważne na tym etapie. Pozwalają one zmydlonemu lipidowi być wystarczająco ciepłym, aby pozostał rozpuszczalnym, a jednocześnie wystarczająco chłodnym, aby zapewnić, że FAFBSA nie zastygnie. Na tym etapie ważne jest również odpowiednie wymieszanie za pomocą pipetowania, aby zapewnić jednorodne rozwiązanie do etykietowania.
Odczynniki do chemii zatrzaskowej muszą być odpowiednio przechowywane, zwykle ze środkami osuszającymi lub w gazie N2 lub Ar w temperaturze od -20 °C do -80 °C. Brak sygnału acylacji lub słaby sygnał może być spowodowany niestabilnymi odczynnikami, szczególnie starszymi roztworami TBTA i podstawowymi azydkami. Ponadto należy zachować ostrożność w przypadku podstawowych roztworów azydku fluorescencyjnego, które należy w jak największym stopniu chronić przed światłem. Ponadto zmienne, takie jak metoda deprywacji lipidów i czas znakowania, mogą wymagać zbadania w celu określenia optymalnych warunków w zależności od rodzaju użytej komórki. Na przykład komórki neuronalne mogą potrzebować dłuższego czasu znakowania, ponieważ zmiany w pożywce i deprywacja lipidów są trudne (niepublikowane).
Korzyści płynące z tego protokołu są najbardziej dramatyczne, gdy są stosowane w przypadku długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. W przypadku krótszych łańcuchów wzrost intensywności sygnału staje się mniej dramatyczny, ale nadal prawdopodobnie chroni komórki. Podczas gdy sugerowane modyfikacje poprawią ogólne wykrywanie acylacji białek, chemia kliknięć jest nadal uważana za metodę skoncentrowaną na lipidach1 , która ogranicza się do wykrywania dynamicznych, a nie stabilnych białek acylowanych S1. Inne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę, obejmują wymóg deprywacji kwasów tłuszczowych w celu promowania etykietowania oraz stosunkowo ograniczony zakres kompatybilnych typów komórek w porównaniu z wykrywaniem S-acylacji16 za pomocą wymiany acylowo-biotynowej (ABE). Pomimo tych ograniczeń, wykrywanie chemiczne kliknięć jest szybsze niż większość testów wymiany acylowej i lepiej nadaje się do wykrywania białek, które nie tolerują powtarzających się etapów wytrącania białek wymaganych w testach wymiany acylowej. Ponadto podejście to można połączyć z jednoczesnym etykietowaniem przy użyciu innych testów kliknięć, takich jak analiza pościgu impulsowego38.
Zastosowanie tej modyfikacji do znakowania metabolicznego dla chemii kliknięć zwiększyło ogólne wykrywanie acylowanych białek, w szczególności S-acylowanych, za pomocą różnych technik proteomicznych, które są stosowane w połączeniu z chemią kliknięć. Jak pokazano, detekcja fluorogeniczna może być stosowana jako alternatywa dla biotyny (ryc. 1)28. Jest to szczególnie przydatne, ponieważ w lizatach komórkowych nie ma endogennych białek fluorescencyjnych. Ponadto można stosować fluorofory, które są aktywowane dopiero po chemii kliknięć46. Zmydlony i związany z FAFBSA kwas tłuszczowy do znakowania chemicznego może pomóc w trudnościach z wykrywaniem interesujących białek ze względu na ogólny wzrost ilości znacznika dostępnego w komórce i ograniczenie toksycznych skutków dodawania kwasów tłuszczowych bezpośrednio do pożywki. Może być również wykorzystany w połączeniu ze spektrometrią mas27 w celu zwiększenia wykrywania białek o niskiej liczebności, zwłaszcza w połączeniu z niedawnym postępem przy użyciu algorytmów uczenia maszynowego zapobiegających nadmiarowym pomiarom w celu zwiększenia czułości na białka o niskiej obfitości, w przeciwieństwie do istniejącego pozyskiwania zależnego od danych, które sprzyja wykrywaniu najliczniejszych białek47. Ponadto chemię kliknięć można połączyć z znakowaniem stabilnych izotopów za pomocą aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC) i metodami pościgu za impulsami w celu uzyskania wymiernych danych na temat dynamicznej acylacji Sbiałek 27. Wreszcie, grupa Hannoush połączyła chemię kliknięć z testem ligacji zbliżeniowej (PLA), aby umożliwić wizualizację pojedynczych komórek i badania subkomórkowej dystrybucji białek palmitoilowanych43,48.

Acylacja tłuszczu polega na kowalencyjnym dodawaniu kwasów tłuszczowych do białek i jest dobrze znana ze swojego znaczenia w promowaniu interakcji białko-błona, ale wykazano również, że promuje interakcje białko-białko, zmiany konformacyjne i reguluje katalityczne miejsca enzymów1,2,3,4,5,6,7. Acylacja tłuszczowa stała się potencjalnym celem leków w niezliczonych chorobach, w tym infekcjach, nowotworach, stanach zapalnych i neurodegeneracji, gdzie udokumentowano zakłócenia w palmitoilacji8,9,10,11,12,13. Było to przede wszystkim spowodowane opracowaniem nowych metod wykrywania substancji chemicznych, które umożliwiły identyfikację na dużą skalę celów białkowych S-acylowanych.
Acylacja tłuszczów może obejmować różne modyfikacje polegające na kowalencyjnym dodawaniu nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych, ale zazwyczaj odnosi się do N-mirystoylacji i S-acylacji. N-mirystoilacja odnosi się do dodawania kwasu mirystynowego do N-końcowych glicyn albo kotranslacyjnie na powstających polipeptydach, albo po translacji na nowo odsłoniętych N-końcowych glicynach po rozszczepieniu proteolitycznym 2,14. N-mirystoylacja zachodzi poprzez nieodwracalne wiązanie amidowe. Z drugiej strony, acylacja S zazwyczaj odnosi się do odwracalnego dodawania długołańcuchowych kwasów tłuszczowych do reszt cysteiny za pośrednictwem wiązania tioestrowego. Najczęstszą formą tej modyfikacji jest włączenie palmitynianu i dlatego jest powszechnie określana jako S-palmitoilacja lub po prostu palmitoilacja11,15. Pod wieloma względami S-palmitoilacja jest podobna do fosforylacji. Jest dynamiczny, regulowany enzymatycznie i okazuje się być bardzo elastyczny.
Aż do ostatniej dekady, badanie acylacji tłuszczowej było utrudnione przez ograniczone metody wykrywania, które wymagały radioaktywnie znakowanych kwasów tłuszczowych. Miało to kilka wad, w tym koszty, kwestie bezpieczeństwa i bardzo długi czas wykrywania. Zazwyczaj do wykrywania S-acylacji używano trójcytowanego lub jodowanego palmitynianu S16. Trójpierścieniowy palmitynian wymagał długich okresów wykrywania za pomocą filmu autoradiograficznego, co może trwać od tygodni do miesięcy. Podczas gdy analogi jodowo-tłuszczowych kwasów tłuszczowych skracały czas wykrywania, stanowiły znacznie większe ryzyko bezpieczeństwa i wymagały ścisłego monitorowania tarczycy przez eksperymentatorów. Ponadto metody te nie miały charakteru ilościowego, co ograniczało możliwość pomiaru dynamicznej palmitoilacji, a także czasochłonne było przygotowanie i czyszczenie ze względu na dodatkowe środki ochrony osobistej i monitorowanie radioaktywne. Wreszcie, znaczniki radioaktywne nie nadawały się dobrze do badań proteomicznych i zazwyczaj ograniczały się do niskoprzepustowego wykrywania określonych białek będących przedmiotem zainteresowania. W miarę jak wykrywano coraz więcej substratów i nieuchronnie identyfikowano enzymy, które pośredniczą w każdej modyfikacji, stało się jasne, że potrzebne są nowe metody wykrywania17,18,19,xref"20,21. Niemal równocześnie powstało kilka nowych metod wykrywania acylowanych białek tłuszczowych. Pierwszy z nich wykorzystuje odwracalność i reaktywność wiązania tioestrowego S-acylacji. Test wymiany acyl-biotyny (ABE) chemicznie zastępuje palmitynian biotyną w celu późniejszego usunięcia białek acylowanych S za pomocą kulek agarozy awidyny i bezpośredniego wykrywania za pomocą western blot22,23,24. Następnie opracowano bioortogonalne znakowanie kwasów tłuszczowych i chemoselektywne dodawanie do znaczników lub uchwytów, które obejmowały użycie ligacji Staudingera i chemii kliknięć25,26,27,28,29,30,31,32, 33. Wreszcie, podobnie jak ABE, wychwytywanie wspomagane żywicą acyylową (RAC) zasadniczo zastępuje miejsca acylowane S kulkami reagującymi z tiolem w celu wychwytywania i wykrywania białek acylowanych S34,35. Testy oparte na wymianie i chemii opartej na klikaniu zapewniły bardziej wydajne i czułe metody wykrywania acylacji i oczyszczania powinowactwa do dalszej analizy, a następnie doprowadziły do odkrycia tysięcy białek S-acylowanych8,36.
Termin "chemia kliknięć" obejmuje grupę reakcji chemicznych, ale najczęściej odnosi się do mechanizmu reakcji cykloaddycji katalizowanej przez Cu(I) azydoalkinową [3+2] pomiędzy grupą alkinylową a grupą azydo27,28,37. W szczególności, w przypadku acylacji tłuszczowej, chemia kliknięć obejmuje wykrywanie S-palmitoilacji lub N-miristylizacji poprzez włączenie bio-ortogonalnego 16-węglowego palmitynianu alkinylu (kwas 15-heksadecynowy; 15-HDYA) lub 14-węglowego mirystynianu alkinylu (kwas 13-tetradecynowy; 13-TDYA) do komórek w celu znakowania endogennie acylowanych białek28. Po lizie komórek i immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania, przeprowadza się reakcję chemiczną typu click (wiązanie kowalencyjne między alkinem a azydkiem) w celu związania sondy powinowactwa, zwykle biotyny, w celu wykrycia przez western blot28,37. Alternatywnie, chemię kliknięć można przeprowadzić na całkowitym lizacie komórkowym, a tłuszczowe acylowane białka można oczyścić z powinowactwa w celu identyfikacji za pomocą spektrometrii mas. Początkowa reakcja chemiczna z azydobiotyną zwiększyła selektywność i czułość wykrywania ponad milion razy w porównaniu z radioaktywnością2. Kolejną zaletą chemii kliknięć jest to, że można ją łączyć z innymi klasycznymi metodami znakowania, takimi jak analiza impulsowa obrotu białek przy użyciu azydohomoalaniny do analizy ilościowej38. Ponadto sondy fluorescencyjne mogą być używane zamiast biotyny lub innych sond biochemicznych, takich jak znaczniki FLAG lub Myc, w celu zbadania lokalizacji białek16,28,39.
Pomimo względnej łatwości użycia chemii kliknięć, wykrywanie może być ograniczone przez niską rozpuszczalność i potencjalną toksyczność stosowania długołańcuchowych wolnych kwasów tłuszczowych w hodowli komórkowej40. W szczególności, pomimo preferencji palmitynianu podczas acylacji S dla większości białek, w wielu badaniach stosowano stearynian 18-węgla (kwas 17-oktadecynowy - 17-ODYA) zamiast palmitynianu (15-HDYA) do wykrywania białek acylowanych S ze względu na jego dostępność komercyjną i stosunkowo niski koszt. Jednak 17-ODYA jest bardzo nierozpuszczalna i wymaga szczególnej uwagi podczas stosowania. Ponadto chemia kliknięć może wymagać pewnego zniuansowanego przygotowania i przechowywania chemikaliów. W niniejszym protokole opisano podejście do etykietowania, które optymalizuje dostarczanie za pomocą zmydlania kwasów tłuszczowych, dostarczania z BSA wolnego od kwasów tłuszczowych i delipidowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu zwiększenia rozpuszczalności i ominięcia potencjalnych toksycznych skutków dodawania wolnych kwasów tłuszczowych do komórek28. Ta metoda działa w różnych typach komórek i została nawet użyta u żywych zwierząt28.

<table><tbody><tr><td>Kwas 13-tetradecynowy (kwas alkinylomirystynowy) (25mM)</td><td>Click Narzędzia chemiczne</td><td>1164</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 15-heksadecynowy (kwas alkinylopalmitynowy) (100mM)</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>1165</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 17-oktadecynowy (kwas alkinylostearynowy) (100 mM)</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>90270</td><td></td></tr><tr><td>30% roztwór akrylamidu/bis 29:1</td><td>Biorad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek 96-dołkowych</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AFDye 647 azydek plus</td><td>Click Narzędzia chemiczne</td><td>1482</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Biorad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Anty-GAPDH hFAB Rodamina</td><td>Biorad</td><td>12004167</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królik Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Antytubulina hFAB Rodamina</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>12004166</tr><tr><td>Biotyna Azydek</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>1265</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris, ultraczysty</td><td>VWR</td><td>715</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>J.T. Baker</td><td>1332-1</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 16 000xg, 4&deg; C</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>A3382101</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imager</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (1 mM)</td><td>VWR</td><td>BDH9312</td><td></td></tr><tr><td>Kwas deoksycholowy sól sodowa jednowodna</td><td>MP Biomedicals</td><td>102906</td><td></td></tr><tr><td>Test kompatybilny z detergentem (DC)</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>VWR</td><td>0231-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1x</td><td>Bisent Inc</td><td>319015CL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>MP Biomedicals</td><td>219989950</td><td></td></tr><tr><td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTrans W PVDF (polifluorek winylidenu) membrana transferowa</td><td>Pall Life Sciences</td><td>BSP0161</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]-etanosulfonowy) VWR</td><td></td><td>5011</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator nawilżany przy 37&deg; C i 5% CO2</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61055</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Biorad</td><td>N/</td>A <td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td> supplement <td>solution Wisent Inc</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mirystynowy (25 mM)</td><td>VWR</td><td>M0476-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas palmitynowy (100 mM)</td><td>VWR</td><td>P0002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, 10x</td><td>Żubr Inc</td><td>450201EL</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A (syntetyczna)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-260-085-M005</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-184-G005</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10x, pH 7,4</td><td>VWR</td><td>75801-000</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało kozie przeciwko GFP (Affinity Purified)</td><td>Eusera</td><td>EU4</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTrans W PVDF (polifluorek winylidenu) membrana transferowa</td><td>Pall Life Sciences</td><td>BSP0161</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Nauka Warda</td><td>470302-100</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko GFP</td><td>Eusera</td><td>EU1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Bisent Inc</td><td>600-110-EL</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Alexa Fluor 680 koniugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S21378</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(benzylotriazolylo)amina (TBTA) (100 uM)</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(2-karboksetylo)fosfina HCl (TCEP) (1mM)</td><td>Soltec Ventures</td><td>M115</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsina/EDTA</td><td>Bisent Inc</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Odczynnik klasy 1L</td><td>VWR</td><td>97062-332</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki WHEATON NextGen V 3 ml</td><td>VWR</td><td>89085-424</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii click

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Acylacja tłuszczów, kowalencyjne dodawanie nasyconych kwasów tłuszczowych do substratów białkowych, jest ważna w regulacji niezliczonych funkcji komórkowych, a także ma wpływ na raka i choroby neurodegeneracyjne. Ostatnie osiągnięcia w metodach wykrywania acylacji tłuszczowej umożliwiły skuteczne i bezpieczne wykrywanie acylowanych białek tłuszczowych, w szczególności dzięki zastosowaniu chemii kliknięć z bioortogonalnym znakowaniem. Jednak wykrywanie chemii kliknięć może być ograniczone przez słabą rozpuszczalność i potencjalne toksyczne skutki dodawania długołańcuchowych kwasów tłuszczowych do hodowli komórkowej. Opisano tutaj podejście do etykietowania ze zoptymalizowanym dostarczaniem przy użyciu zmydlonych kwasów tłuszczowych w połączeniu z BSA wolnym od kwasów tłuszczowych, a także pożywkami odlipidowanymi, które mogą poprawić wykrywanie trudnych do wykrycia acylowanych białek tłuszczowych. Efekt ten był najbardziej wyraźny w przypadku analogu stearynianu alkinylu, 17-ODYA, który był najczęściej stosowanym analogiem kwasów tłuszczowych w wykrywaniu chemii kliknięć acylowanych białek. Modyfikacja ta poprawi inkorporację komórkową i zwiększy czułość na wykrywanie białek acylowanych. Ponadto podejście to może być stosowane w różnych typach komórek i łączone z innymi testami, takimi jak analiza pościgu impulsowego, znakowanie stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej oraz spektrometria mas do ilościowego profilowania acylowanych białek tłuszczowych.

Różnicę w wydajności znakowania między zmydlonymi a niezmydlonymi (non-sap) alkinowymi kwasami tłuszczowymi w detekcji metodą click chemistry można zwizualizować i porównać, analizując intensywność sygnału białeky acylowanych kwasami tłuszczowymi za pomocą western blot (Rysunek 1). Zauważalny efekt zaobserwowano wraz ze wzrostem długości łańcuchów acylowych. W komórkach znakowanych alkinianem stearynianu (alk-stear), zmydlenie kwasu tłuszczowego i dostarczenie go z BSA w celu znakowania metabolicznego drastycznie zwiększyło detekcję sygnału białek S-acylowanych metodą click chemistry i detekcji za pomocą fluorescencyjnej sondy azydowej (Rysunek 1, prawa strona), co sugeruje ogólny wzrost wbudowy alkinowego znacznika kwasu tłuszczowego do komórek. Odwrotnie, nie zaobserwowano żadnej zauważalnej różnicy w komórkach traktowanych najkrótszym i najbardziej rozpuszczalnym kwasem tłuszczowym, alkinianem mirystynianu (alk-myr; kwas 13-tetradecynowy lub 13-TDYA). Komórki znakowane alkinianem palmitynianu (Rysunek 1, środek) wykazały umiarkowany wzrost poziomu znacznika w porównaniu z alkinianem mirystynianu (13-TDYA), ale mniejszy niż w przypadku alkinianu stearynianu.
Co istotne, traktowanie membran PVDF 0,1 M KOH w znacznym stopniu usunęło znaczniki kwasów tłuszczowych z komórek inkubowanych z alkynylopalmitianem i alkynylstearynianem, co potwierdza, że większość sygnału pochodziła z wiązania estrowego lub tioestrowego (Rysunek 1, środkowy i prawy panel dolny). Zgodnie z oczekiwaniami, wbudowanie alkynylmirystynianu było w większości odporne na działanie alkaliów (Rysunek 1, lewy panel dolny), co wynika z przyłączenia mirystynianu do białek poprzez wiązanie amidowe.
Rysunek 2 demonstruje wszechstronność i czułość chemii klik w wykrywaniu acylacji tłuszczowej białek po immunoprecypitacji. Komórki HEK293T przetransfekowano mirystoilowanym końcem C-terminalnym huntingtyny (HTT) połączonym z GFP (myr-ctHTT-GFP) i oznakowano mirystonianem alkynylowym, zgodnie z wcześniejszym opisem18. Po immunoprecypitacji ctHTT-GFP uwolniono z kulek i poddano reakcji chemii klik wraz z lizatami. Mirystoilacja dzikiego typu (WT) myr-ctHTT-GFP została wykryta nie tylko w immunoprecypitatach, ale była silnie widoczna również w lizatach, podczas gdy mutacja G2A całkowicie zablokowała mirystoilację ctHTT-GFP (Rysunek 2).
<img alt="Elektroforeza białek w żelu SDS-PAGE przedstawiająca wyniki znakowania alkiniowym FA, kontrolę GAPDH, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Wykrywanie białek acylowanych kwasami tłuszczowymi z wykorzystaniem chemii klik. Komórki HEK293T inkubowano bezpośrednio z wskazanymi kwasami tłuszczowymi (non-sap) lub po ich zmydleniu (sap) i inkubacji z białkiem nośnikowym BSA, zgodnie z opisem w protokole 2.1-2.7. Kwasy tłuszczowe alkiniowe powiązano z fluorescencyjnym azydkiem poprzez poddanie 100 µg lizatów białkowych do chemii klikowej, rozdzielonych za pomocą SDS-PAGE i przeniesionych na membrany PVDF. Po traktowaniu 0,1 M Tris pH 7,0 lub 0,1 M KOH w celu odwrócenia wiązań tioestrowych, acylację tłuszczową wykryto przy użyciu fluorescencyjnego azotku. GAPDH wykorzystano jako kontrolę ładunku; przeciwciało anty-GAPDH rhodamine (1:5 000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza żelu SDS-PAGE wykazująca lizaty białkowe i wyniki immunoprecypitacji dla WT i G2A." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Detekcja N-mirystoilowanego ctHTT-GFP z wykorzystaniem chemii klikowej. Komórki HEK293T przetransfekowano skróconą z końca C (ct), zdolną do mirystoilacji formą HTT (myr-ctHTT-GFP) i znakowano alkynylomirystonianem. Uwzględniono również formę niezdolną do mirystoilacji, w której kluczowa glicyna została zastąpiona alaniną (G2A). Po zbiorze i lizie, ctHTT-GFP poddano immunoprecypitacji z użyciem przeciwciał kozich anty-GFP. Reakcji chemii klikowej poddano zarówno lizaty (po lewej), jak i immunoprecypitaty po uwolnieniu z kulek. Mirystoilację wykryto za pomocą Streptawidyny Alexa 680 (SA680). GFP wykryto za pomocą przeciwciał króliczych anty-GFP w połączeniu z anty-króliczymi Alexa 488. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu znakowania metabolicznego, reakcja click, kwantyfikacja białek, SDS-PAGE, western blot." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat przebiegu protokołu eksperymentalnego. Zarys głównych etapów eksperymentalnych zawartych w protokole. Zaznaczono kilka punktów, w których prace zgodnie z protokołem można przerwać. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Badanie acylacji tłuszczów ma ważne implikacje w interakcjach i chorobach białek komórkowych. Przedstawiono tutaj zmodyfikowany protokół mający na celu poprawę wykrywania chemicznego acylowanych białek tłuszczowych, który może być stosowany w różnych typach komórek i łączony z innymi testami, w tym pościgiem impulsowym i spektrometrią mas.

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Metoda ta poprawia dostarczanie kwasów tłuszczowych do komórek i chroni je przed toksycznymi skutkami dostarczania wolnych kwasów tłuszczowych, zapewniając w ten sposób bardziej spójne etykietowanie. Czułość i skuteczność wykrywania chemii kliknięć zależy od skutecznego wchłaniania etykiety kwasu tłuszczowego. Wykazaliśmy, że można to znacznie poprawić.Kilka kroków protokołu jest bardzo specyficznych i należy ich ściśle przestrzegać. Demonstracja wizualna może wyjaśnić i pokazać na przykład, jak uniknąć tworzenia się ciał stałych w mieszance do etykietowania. Aby przygotować podłoże do etykietowania, uzupełnij DMEM 5% dekstranem/węglem drzewnym FBS, 1X penicyliną streptomycyną, dwiema milimolowymi L-glutaminą i 100 milimolowym pirogronianem sodu, a następnie podgrzej go do 37 stopni Celsjusza przed użyciem.Delikatnie umyj limfocyty T HEK-293 posiane dzień wcześniej w sześciodołkowym naczyniu do hodowli tkankowej za pomocą PBS, a następnie zastąp PBS pożywką do etykietowania. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez około 45 minut przed przystąpieniem do znakowania metabolicznego kwasami tłuszczowymi. Aby zmydlić analogi kwasów tłuszczowych, należy odpipetować co najmniej dwa mikrolitry analogu alkinylowego kwasu tłuszczowego bezpośrednio na dno trzymililitrowej stożkowej fiolki reakcyjnej.Odpipetować równą ilość rozcieńczonego wodorotlenku potasu blisko dna fiolki reakcyjnej na krawędzi szklanki, tak aby dozowana objętość wodorotlenku potasu zmieszała się z kwasem tłuszczowym. Zamknąć pokrywkę fiolki i delikatnie postukać, aby wymieszać roztwory. Podgrzewać fiolkę reakcyjną w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez około pięć minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się klarowny, co wskazuje, że kwas tłuszczowy został włączony.Należy jednak uważać, aby płyn nie wyparował zbyt mocno. Następnie pipetą wstępnie podgrzaną 20% BSA wolną od kwasów tłuszczowych tak, aby stosunek objętościowy kwasów tłuszczowych do wodorotlenku potasu do BSA wolnego od kwasów tłuszczowych wynosił 1-1-50, osiągając końcowe stężenie 20X alkinylowych kwasów tłuszczowych związanych z BSA. Wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubuj go przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Oznacz limfocyty T HEK-293, dodając koniugat 20X kwasu tłuszczowego BSA bezpośrednio do pożywki głodowej, aby osiągnąć końcowe stężenie 1% BSA w 25 mikromolowym mirystynianu alkinylu lub 100 mikromolowym palmitynianu alkinylu i stearynianu alkinylu. Dla porównania, dodaj niezmydlone płyny, pipetując dwa mikrolitry nieznakowanego kwasu tłuszczowego bezpośrednio do pożywki głodowej, a następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze na trzy do sześciu godzin. Po zakończeniu inkubacji delikatnie umyj komórki PBS w temperaturze pokojowej, a następnie zbierz i poddaj komórki lizie, dodając 500 mikrolitrów zmodyfikowanego buforu RIPA wolnego od EDTA i obracając lizaty przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odwirować lizaty w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie zebrać supernatant w 1,7 mililitrowych probówkach do mikrowirówek i przechowywać je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Doprowadzić od 50 do 100 mikrogramów lizatów białkowych w 1,7 mililitrowych probówkach wirówkowych do równej objętości za pomocą zmodyfikowanego buforu RIPA wolnego od EDTA. Utrzymuj objętość reakcji tak małą, jak to możliwe.Dodaj STS do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 1%Przygotuj główną mieszankę odczynników klik i dodaj odpowiednie objętości do lizatów, a następnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubuj lizaty w ciemności przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu mieszając. W celu immunoprecypitacji wymieszać lizaty z króliczym anty-GFP i inkubować przez noc z rotacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Dodaj 15 do 20 mikrolitrów kulek magnetycznych wstępnie zrównoważonych 0,1% SDS RIPA do każdej probówki i pozwól jej reagować od końca do końca w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Przemyć kulki buforem do lizy i ponownie zawiesić w 45 mikrolitrach 50-milimolowego buforu HEPES zawierającego 1% SDS. Podgrzej koraliki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut.Podczas inkubacji należy odwracać lub mieszać probówki mniej więcej co pięć minut, a następnie krótko obrócić wszystkie probówki. Gdy próbki są jeszcze ciepłe, zebrać supernatant zawierający białka. Połączyć 43 mikrolitry supernatantu z siedmioma mikrolitrami odczynników do mieszania odczynników typu click i pozwolić im reagować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Na poletku zachodnim zaobserwowano zauważalny efekt w skuteczności znakowania w wykrywaniu chemii kliknięć między zmydlonymi i niezmydlonymi alkinylowymi kwasami tłuszczowymi wraz ze wzrostem długości łańcuchów acylowych. W komórkach znakowanych stearynianem alkinylu, zmydlenie kwasu tłuszczowego i dostarczenie BSA do znakowania metabolicznego drastycznie zwiększyło wykrywanie sygnału białka S-acylowanego poprzez chemię kliknięć i wykrywanie przez fluorescencyjną azytosondę, co sugeruje ogólny wzrost komórkowego włączania etykiety alkinylowych kwasów tłuszczowych. I odwrotnie, nie zaobserwowano zauważalnej różnicy w komórkach traktowanych najkrótszym i najbardziej rozpuszczalnym mirystynianem alkinylu kwasu tłuszczowego.Komórki znakowane palmitynianem alkinylu wykazały pośredni wzrost znacznika w porównaniu z mirystynianem alkinylu, ale mniejszy niż stearynian alkinylu. Co ważne, traktowanie membran PVDF 0,1-molowym wodorotlenkiem potasu w dużej mierze usunęło znaczniki kwasów tłuszczowych z komórek inkubowanych z palmitynianem alkinylu i stearynianem alkinylu, potwierdzając, że większość sygnału pochodziła przez wiązanie estrowe lub tioestrowe. Zgodnie z oczekiwaniami, włączenie mirysianu alkinylu było w większości odporne na alkalia ze względu na przyłączenie mirysianu do białek poprzez wiązanie amidowe.Po chemii kliknięć wykryto mirystoylację mirystoylowanego C-końcowego Huntingtona GFP typu dzikiego w immunoprecypitatach, a także w lizatach, podczas gdy mutacja G2A całkowicie zablokowała mirystoylację C-końcowego GFP Huntingtona. Podążając za chemią kliknięć, możemy przeprowadzić oczyszczanie powinowactwa acylowanych białek tłuszczowych do spektrometrii mas. Może to prowadzić do uzyskania innego profilu acylowanych białek tłuszczowych poprzez ochronę komórek przed toksycznością.

optimized-incorporation-alkynyl-fatty-acid-analogs-for-detection

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

DNA i białka są specjalnie znakowane sekwencyjnie grupami reporterowymi o powinowactwie lub fluorescencyjnym za pomocą metylotransferaz DNA lub białek oraz analogów syntetycznych kofaktorów. W zależności od specyficzności kofaktora enzymów, do jedno- lub dwuetapowego znakowania stosuje się azyrydynę lub podwójnie aktywowane analogi kofaktorów.

Specyficzne sekwencyjnie znakowanie kwasów nukleinowych i białek za pomocą metylotransferaz i analogów kofaktorów

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Tutaj opisujemy przygotowanie i użycie sondy opartej na aktywności (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu), która pozwala na wykrycie i ilościowe określenie aktywnej formy prozapalnego enzymu amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA), zarówno in vitro, jak i ex vivo.

Przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Proliferacja jest kluczowym elementem funkcji komórkowej i powszechnym odczytem używanym do oceny potencjalnej toksyczności nowych leków. Pomiar proliferacji jest zatem często stosowanym testem w biologii komórki. Poniżej przedstawiamy prostą, wszechstronną metodę pomiaru proliferacji, którą można zastosować w komórkach adherentnych i nieadherentnych.

Pomiar proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii Click

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) to wysoce czuła, niezawodna i łatwa do wykonania metoda wykrywania odwracalnej modyfikacji lipidów reszt cysteiny (S-acylacji) w różnych próbkach biologicznych.

Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić znakowanie białek specyficznych dla typu komórki za pomocą azydonorleucyny (ANL) przy użyciu linii myszy wyrażającej zmutowaną syntetazę tRNA L274G-metioniny (MetRS*) oraz niezbędne kroki do izolacji białek specyficznych dla znakowanego typu komórki. Przedstawiamy dwie możliwe drogi podawania ANL żywym myszom poprzez (1) picie wody i (2) wstrzyknięcia dootrzewnowe.

Oczyszczanie i identyfikacja białek specyficznych dla typu komórki ze złożonych tkanek przy użyciu zmutowanej linii myszy syntetazy tRNA metioniny

Szybkie i dokładne testy chemiczne do badań przesiewowych pod kątem określonych inhibitorów są ważnym narzędziem w arsenale rozwoju leków. Tutaj przedstawiamy skalowalny test chemiczny acetylu do pomiaru hamowania aktywności acetylacji HAT1.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

Poznaj zoptymalizowaną metodę dostarczania analogów kwasów tłuszczowych do komórek HEK-293T z wykorzystaniem zmydlonych kwasów i bezkwasowego BSA. Protokół zwiększa wykrywalność acylowanych białek tłuszczowych poprzez chemiczną detekcję typu click z fluorescencyjnymi azydami.

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click

Przeglądaj więcej filmów