Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli

Otrzymanie zmodyfikowanego mononukleosomu ma kluczowe znaczenie dla projektowania eksperymentów epigenetycznych. Nasz protokół zapewnia acetylowane, odtworzone mononukleosomy, które można stosować w testach biochemicznych i wiążących, określaniu struktury i nie tylko. Podstawową zaletą naszej techniki jest jej uniwersalność.

System ten można łatwo zmodyfikować w celu włączenia wielu rodzajów modyfikacji do mononukleosomów. Zacznij od przygotowania jednego litra autoklawizowanej pożywki 2YT w kolbie hodowlanej. Zaszczepić 20 mililitrów pożywki zawierającej odpowiednie antybiotyki z kotransformowanym zapasem komórek, który ma znacznik zawierający plazmid i pEVOL-AckRS i hodować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby uzyskać OD 0,6.

Dodaj odpowiednie antybiotyki do jednego litra autoklawizowanej pożywki 2YT i zaszczep ją 20 mililitrami kultury starterowej. Hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin, aby uzyskać OD 0,6, 2,8. Dodaj środki indukujące i AcK, aby uzyskać końcowe stężenie jednego milimolowego IPTG, 0,2% arabinozy i pięciu milimolowych AcK.

Uprawiaj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu godzin. Następnie granulować komórki w temperaturze 2 700 x g przez 15 minut i przechowywać je przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozpuść osad w 50 mililitrach buforu do lizy histonów na litr kultury i poddaj sonikacji komórki przy amplitudzie 60% przez trzy minuty z jednosekundowymi przerwami i jedną sekundą przerwy.

Korpusy wtrącające granulki po 41, 600 x g przez 45 minut. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić inkluzje w 30 mililitrach buforu do lizy histonów, a następnie ponownie odwirować przez 30 minut. Ponownie zawiesić ciała inkluzyjne w 30 mililitrach buforu do przemywania peletów i powtórzyć wirowanie.

Następnie rozpuść ciała inkluzyjne w 25 mililitrach sześciomolowego buforu chlorowodorku guanidyny. Inkubować z mieszaniem w temperaturze 37 stopni przez godzinę, a następnie wirować przez 45 minut. Inkubować supernatant z jednym mililitrem żywicy niklowo-NTA w równowadze z sześciomolowym buforem chlorowodorku guanidyny przez dwie godziny i kontynuować oczyszczanie niklu-NTA w warunkach denaturacji.

Przemyć kolumnę trzema objętościami buforu płuczącego, a następnie wymyć acetylowane białko histonowe za pomocą 10 mililitrów buforu elucyjnego. Dializować acetylowane białko histonowe w stosunku do 5% buforu kwasu octowego w celu usunięcia soli przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wymieniając bufor co najmniej sześć razy. Podwielokrotność i lipolizować białko i przechowywać w nieskończoność w temperaturze minus 80 stopni.

Rozpuść podwielokrotności granulek białka histonowego H2A, H2B, H3 i H4 tak, aby w buforze chlorowodorku guanidyny znajdował się oddzielny zapas każdego białka histonowego o łącznej objętości 100 mikrolitrów. Oblicz stężenie każdego białka histonowego, mierząc absorbenty w odległości 280 nanometrów. Jeśli absorbancja jest większa niż jeden dla któregokolwiek białka, rozcieńczyć buforem chlorowodorku guanidyny, aby uzyskać dokładniejsze stężenie.

Połączyć H2A z H2B i H3 z białkami H4 w stosunku molowym jeden do jednego i rozcieńczyć do całkowitego stężenia białka wynoszącego cztery mikrogramy na mikrolitr. Dializuj sekwencyjnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza w stosunku do dwóch molowych TE przez noc, jednego molowego buforu TE przez dwie godziny i 0,5 molowego buforu TE przez pięć godzin. Po zakończeniu odwirować w temperaturze 16 800 x g w czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć osad.

Oblicz stężenie dimerów i tetramerów histonów, mierząc absorbancję przy 280 nanometrach. Wymieszaj dimery i tetramery w stosunku molowym jeden do jednego i dostosuj stężenie chlorku sodu do 2M. Dostosuj 601 DNA do dwóch molowych TE za pomocą buforu 100X TE i stałego chlorku sodu.

Dodaj roztwór do oktamera histonów w stosunku molowym 0,85, 2,9 do jednego. Przenieś mieszaninę histonów DNA do worka dializacyjnego i umieść ją w około 200 mililitrach dwumolowego buforu TE, bardzo delikatnie mieszając w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ustaw pompę perystaltyczną tak, aby powoli kapała w buforze TE bez soli.

Gdy objętość mniej więcej się podwoi, wylej połowę objętości. Zrób to co najmniej cztery razy, co może zająć od czterech do ośmiu godzin, w zależności od początkowej głośności. Po zmniejszeniu stężenia soli do 150 milimolowców dializuj przez noc w 20-milimolowym buforze TE.

Usunąć osady przez odwirowanie i zmierzyć stężenie nukleosomów za pomocą czytnika płytkowego. Dodaj proteazę his-TEV i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć wszystkie znaczniki histydyny. Następnie usuń zanieczyszczenia znacznikiem histydyny z roztworu nukleosomu za pomocą żywicy niklowo-NTA w dół.

Inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę, aby ustawić nukleosom i homogenizować próbkę. Przechowuj nukleosomy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez krótki czas. W przypadku długotrwałego przechowywania należy dializować nukleosomy w buforze magazynowym i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Niektóre z acetylowanych tetramerów miały niższą wydajność niż inne, co oceniono za pomocą 12% żelu SDS-PAGE. Im bliżej obszaru rdzenia, tym niższy obserwowany plon. Było to najprawdopodobniej spowodowane acetylacją, zakłócającą montaż oktamera.

Po złożeniu oktamerów z sekwencją DNA 601, nukleosom można ocenić za pomocą żelu PAGE 5%1X natywnego dla TBE, a następnie wybarwić bromkiem etydyny. Przed pozycjonowaniem termicznym obserwowane pasma nukleosomów są bardzo szerokie i mogą tworzyć smugi. Wykonując ten protokół, utrzymuj białka na lodzie przez cały czas.

Kluczowe jest utrzymanie złożonych dimerów, tetramerów i nukleosomów. Procedura ta pozwoliła naukowcom zainstalować miejsca acetylolizyny, w szczególności w mononukleosomach, otwierając drzwi do badania modyfikacji potranslacyjnych w kontekście chromatyny. Można go łatwo dostosować do instalacji dowolnej liczby aminokwasów niekanonicznych.