Name: Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę specyficznej acetylacji lizyny w histonie H3 przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli. Technika umożliwia rekonstytucję modyfikowanych mononukleosomów do badań epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Wesleyowi Wangowi za stworzenie podstaw dla tego protokołu i jego cenne wsparcie. Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health (Granty R01GM127575 i R01GM121584) oraz Welch Foundation (Grant A-1715).

1. Budowa plazmidu
<ol>
	<li>Zacznij od podjęcia decyzji, które białko histonowe zostanie acetylowane i w którym miejscu lizyny. Zmutuj miejsce do bursztynowego kodonu stop (TAG) za pomocą mutagenezy skierowanej do miejsca. 
	UWAGA: Istnieją cztery wcześniej zaprojektowane plazmidy wykorzystywane do ekspresji białek histonowych. Wszystkie cztery białka histonowe sklonowano do wektora pETDuet-1 z N-końcowym znacznikiem histydyny. Histone H4 zawiera również znacznik SUMO, pochodzenie replikacji colE1 o liczbie kopii około 40, oporny na ampicylinę i promotor T7.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu, które zawierają mutację TAG w pożądanym miejscu (zastępując istniejący kodon lizyny bursztynowym kodonem stop) w jednym z czterech plazmidów białka histonowego.</li>
		<li>Użyj PCR z całym plazmidem, aby amplifikować TAG zawierający plazmid. Określ odpowiednią temperaturę wyżarzania dla podkładów. Ogólnie rzecz biorąc, temperatura topnienia (Tm) starterów minus 5 °C będzie wystarczająca. W przypadku wystąpienia trudności z uzyskaniem produktu PCR, można zastosować gradient temperatury około Tm - 5 °C w celu optymalizacji temperatury wyżarzania w celu amplifikacji. 
		UWAGA: W tym eksperymencie użyto polimerazy PFU wyrażanej we własnym zakresie przez 30 cykli w następujących warunkach: 94 °C przez 30 s (denaturacja), temperatura wyżarzania przez 30 s i 72 °C przez 6 minut (lub 1 min na kilopary zasad). Więcej informacji na temat tego typu metody PCR można znaleźć w Liu and Naismith7.</li>
		<li>Wyczyść produkt PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, postępując zgodnie z protokołem producenta. Analizować produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie barwienia bromkiem etydyny.</li>
		<li>Związać plazmid przez inkubację z ligazą T4 przez noc w temperaturze 16 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Najpierw przekształć plazmid zawierający TAG (AmpR) w chemicznie kompetentną Escherichia coli. Wybierz co najmniej 4 kolonie z transformacji i oczyść plazmid. Przygotować zapasy komórek każdego z nich za pomocą glicerolu przy użyciu standardowych metod i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wysłać do sekwencjonowania, aby potwierdzić pożądaną mutację TAG.</li>
	<li>Po potwierdzeniu sekwencji przekształć plazmid zawierający TAG (AmpR) z pEVOL-AckRS (ChlR) w chemicznie kompetentne komórki BL21 z delecją lizyny histonowej (jedyna znana w E. coli.) delecjonecie komórek BL21 przy użyciu metody szoku cieplnego. pEVOL to plazmid o pochodzeniu p15A od średniej do niskiej liczby kopii. 
UWAGA: Seria plazmidów pEVOL została skonstruowana na podstawie wcześniejszych badań, które wykazały, że zwiększona ekspresja ortogonalnej paryaaRS / tRNA Tyr była skuteczna w zmniejszaniu skracania białek i zwiększaniu ogólnej wydajności zmutowanych białek8. Jeśli komórki delecyjne CobB nie są dostępne, przejdź do chemicznie kompetentnych komórek BL21. CobB jest podobną do sirtuiny deacetylazą lizyny histonowej, a nikotynamid może być dodawany w końcowym stężeniu 5 mM podczas ekspresji białka histonowego, aby zahamować CobB jako alternatywne podejście9.</li>
	<li>Zrób zapas komórek i przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Ekspresja acetylowanego białka histonowego
<ol>
	<li>Przygotować 1 l autoklawizowanej pożywki 2YT (lub objętości do wyboru) w kolbie hodowlanej.</li>
	<li>Zaszczepić 20 ml pożywki 2YT zawierającej odpowiednie antybiotyki z kotransformowanym zapasem komórek, który ma plazmid zawierający TAG (AmpR) i pEVOL-AckRS (ChlR) i rosnąć w temperaturze 37 °C do OD = 0,6 (4-6 h).</li>
	<li>Dodać odpowiednie antybiotyki do 1 l autoklawowanej pożywki 2YT i zaszczepić 20 ml kultury starterowej. Rosnąć w temperaturze 37 °C do OD = 0,6-0,8 (2-3 h).</li>
	<li>Dodać środki indukujące i acetylolizynę (AcK) do końcowych stężeń IPTG 1 mM, 0,2% arabinozy i AcK 5 mM.</li>
	<li>Hoduj kulturę w temperaturze 37 °C przez 6-8 godzin.</li>
	<li>Komórki w granulkach po 2 700 x g przez 15 min.</li>
	<li>Przechowywać osad komórkowy w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
	<li>Począwszy od tego etapu, próbkę należy cały czas utrzymywać na lodzie. Rozpuścić osad komórkowy w 50 ml buforu do lizy histonów na 1 l hodowli.</li>
	<li>Sonikacja według następującego cyklu: 1 s wł., 1 s wyłączona, całkowity czas włączenia: 3 min przy amplitudzie 60%.</li>
	<li>Korpusy wtrącające granulki przy 41 600 x g przez 45 min.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić ciała inkluzyjne w 30 ml buforu do lizy histonów. Inkluzja granulki wróży przy 41 600 x g przez 30 min.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić inkluzje w 30 ml buforu do przemywania osadów. Korpusy wtrącające granulki o wymiarach 41 600 x g przez 30 min.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i rozpuścić inkluzje w 25 ml 6 M buforu chlorowodorku guanidyny (GuHCl). Inkubować z mieszaniem w temperaturze 37 °C przez 1 h. 
	UWAGA: W razie potrzeby ciała inkluzyjne mogą być inkubowane z mieszaniem przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inkluzja osadu wróży przy 41 600 x g przez 45 min. Inkubować supernatant z 1 ml żywicy Ni-NTA w równowadze z 6 M buforem GuHCl przez 2 godziny.</li>
	<li>Kontynuuj oczyszczanie Ni-NTA w warunkach denaturacji. Przemyć kolumnę 3 objętościami kolumny buforu do przemywania kolumny. Elute acetylowane białko histonowe za pomocą 10 ml buforu elucyjnego. 
	UWAGA: Próba zagęszczenia białka tutaj jest opcją, ale acetylowane histony są bardzo nieprzewidywalne i mogą łatwo się wytrącić. Nie zaleca się zagęszczania większej objętości całkowitej niż 2 ml.</li>
	<li>Intensywnie dializuj acetylowane białko histonowe w stosunku do 5% buforu kwasu octowego w celu usunięcia soli. Dializować przez 3 godziny jednorazowo w temperaturze 4 °C, wymieniając bufor na świeży co najmniej 6 razy. 
	UWAGA: Aby poprawić czystość białka, istnieje możliwość dializacji przy użyciu czystej wody. Powoduje to jednak znaczne wytrącanie i zmniejszenie plonu, co może być niepożądane w przypadku acetylowanych białek histonowych o niskiej wydajności.</li>
	<li>Podwielokrotność i liofilizacja białka i przechowywanie w nieskończoność w temperaturze -80 °C. Białka histonowe typu dzikiego dają na ogół 10-50 mg/l, podczas gdy acetylowane białka histonowe dają mniej niż 10 mg/l, w zależności od konkretnego miejsca lizyny. Na przykład H3K79Ac wynosi średnio 5 mg/l.</li>
</ol>
3. Ekspresja białka histonowego typu dzikiego
<ol>
	<li>Aby złożyć pełne nukleosomy, ekspresję wszystkich 4 białek histonowych. Podczas wyrażania i oczyszczania histonów typu dzikiego protokół jest taki sam jak w przypadku histonów acetylowanych, z wyjątkiem następujących:
	<ol>
		<li>Nie wykonuj kotransformacji. Nie należy stosować pEVOL-AcKRS do ekspresji histonów typu dzikiego. Odpowiednio dostosuj antybiotyki.</li>
		<li>Nie używaj linii komórkowej delecji CobB ani nie dodawaj nikotynamidu, AcK lub arabinozy podczas indukcji ekspresji komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie DNA 601
UWAGA: Poprzednio zaprojektowana zoptymalizowana sekwencja DNA do kierowania pozycjonowaniem nukleosomów jest składana z oktamerów histonowych, aby wytworzyć mononukleosom z wysoką wydajnością. Ta sekwencja jest określana jako DNA 601 lub sekwencja Widoma. Sekwencja ta stała się standardową sekwencją DNA do badań in vitro nukleosomów od testów przebudowy chromatyny do pomiarów pojedynczych cząsteczek10.
<ol>
	<li>Aby przygotować znaczne ilości DNA 601 do złożenia nukleosomów, przekształć pGEM-3z / 601 w komórki Top 10 i wyhoduj 10 ml kultury do amplifikacji i ekstrakcji plazmidu. Użyj zestawu do ekstrakcji plazmidu i postępuj zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Do tego protokołu amplifikacji należy użyć polimerazy PFU wyrażanej we własnym zakresie (bardziej wydajnej). Przygotuj reakcję PCR: Do reakcji 250 μL użyj 207,5 μl autoklawizowanego MQH 2O, 25 μL 10x buforu PFU, 5 μl Starter do przodu: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL mieszanki dNTP, 2,5 μl enzymu PFU. Zwykle przeprowadzamy 60 reakcji jednocześnie, aby uzyskać wystarczającą ilość DNA do złożenia.</li>
	<li>Stosować temperaturę wyżarzania 52 °C przez 30 s i czas przedłużenia 30 s w przypadku stosowania polimerazy PFU. W przeciwnym razie postępuj zgodnie z warunkami zalecanymi przez producenta.</li>
	<li>Po zakończeniu PCR użyj wybranego zestawu do czyszczenia PCR, aby oczyścić produkt PCR.</li>
</ol>
5. Montaż oktamera histonu
<ol>
	<li>Rozpuścić podwielokrotności granulek białka histonowego H2A, H2B, H3 i H4 tak, aby w buforze GuHCl znajdował się oddzielny zapas każdego białka histonowego o całkowitej objętości 100 μl.</li>
	<li>Obliczyć stężenie każdego białka histonowego, mierząc absorbancję A280.</li>
	<li>Jeśli absorbancja jest większa niż 1 dla dowolnego białka, rozcieńczyć buforem GuHCl, aby uzyskać dokładniejsze stężenie.</li>
	<li>Połączyć białka H2A i H2B w stosunku molowym 1:1 i rozcieńczyć do całkowitego stężenia białka 4 μg/μL. Powtórzyć dla H3 i H4.</li>
	<li>Dializować sekwencyjnie w temperaturze 4 °C w stosunku do buforu 2 M TE przez noc, buforu 1 M TE przez 2 godziny i buforu 0,5 M TE przez 5 godzin</>
	UWAGA: Drugi i trzeci etap dializy powoduje wytrącanie się niestabilnych konformacji białka. Na tych etapach spodziewane są obfite opady.</li>
	<li>Usunąć osady przez odwirowanie w temperaturze 16 800 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie oblicz stężenie dimerów histonowych (mieszanina H2A/H2B) i tetramerów (mieszanina H3/H4) mierzących absorbancję A280.</li>
	<li>Wymieszaj dimery i tetramery w stosunku molowym 1:1 i dostosuj NaCl do 2 M przez dodanie stałego NaCl.</li>
	<li>Oktamer histonowy może być przechowywany w temperaturze 4 °C i jest bardziej stabilny niż dimery i tetramery. Nigdy nie zamrażaj oktamera histonowego, ponieważ może to spowodować demontaż.</li>
	<li>W przypadku składania z acetylowanymi histonami, po prostu zastąp białko typu dzikiego białkiem acetylowanym w procedurze.</li>
</ol>
6. Montaż nukleosomów
<ol>
	<li>Użyj 100-krotnego buforu TE i stałego NaCl, aby dostosować 601 DNA do buforu 2M TE. Dodaj 601 DNA w buforze 2M TE do oktamera histonowego w stosunku molowym od 0,85:1 do 0,90:1. Niższy stosunek DNA może zostać dodany, jeśli wolne DNA jest obecne w analizie przesunięcia żelu.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę DNA-histon do worka do dializy i umieścić w około 200 ml buforu 2M TE (lub więcej w przypadku składania wielu próbek) i bardzo delikatnie wymieszać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ustaw pompę perystaltyczną na przedmuchiwanie, aby powoli kapała w buforze TE bez soli. Gdy objętość mniej więcej się podwoi, wylej połowę objętości. Zrób to w sumie co najmniej 4 razy. Przy użyciu pompy może to zająć 4-8 godzin, w zależności od objętości początkowej. Nukleosomy powstają, gdy stężenie soli zmniejsza się do 150 mM (mierzone miernikiem zasolenia).</li>
	<li>Po zmniejszeniu stężenia soli do 150 mM, dializuj przez noc w buforze 20 mM TE.</li>
	<li>Usunąć osady przez odwirowanie i zmierzyć stężenie nukleosomów przez odczyt A260 za pomocą czytnika płytek.</li>
	<li>Dodać proteazę His-TEV (TEV: nukleosom 1:30, w:w) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszystkich znaczników histydyny. Usuń zanieczyszczenia znacznikiem histydyny z roztworu nukleosomu za pomocą żywicy Ni-NTA w dół.</li>
	<li>Aby ustawić nukleosom i homogenizować próbkę, inkubować w temperaturze 60 °C przez 1 h. 
	UWAGA: W przypadku miejsc acetylowanych, które są szczególnie niestabilne, ten krok może nie być wskazany.</li>
	<li>Przechowywać nukleosomy przez krótki okres (kilka tygodni) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W przypadku długotrwałego przechowywania należy dializować nukleosomy w buforze magazynowym i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea%3A+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li>
<li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysyl-tRNA+synthetase%3A+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li>
<li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li>
<li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+DNA+sensing+pathways%3A+STING%2C+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li>
<li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGAS+produces+a+2%27-5%27-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+%5BG%282%27%2C5%27%29pA%283%27%2C5%27%29p%5D+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+PLPLRT%2FSD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów finansowych, które mógłby zadeklarować.

Niezbędne jest przestrzeganie tego protokołu w każdym szczególe podczas eksperymentu. Nukleosomy nie są zbyt stabilne i wiele prób i błędów włożono w określenie tego protokołu. Kluczowe jest usuwanie osadów na każdym etapie (lub zawsze, gdy jest obserwowane), ponieważ cząstki stałe mogą łatwo zakłócać procesy montażu. Próbki histonów należy zawsze przechowywać na lodzie. Jeśli nukleosomy są przechowywane w temperaturze 4 °C zbyt długo, mogą ulec spontanicznemu rozkładowi. Pamiętaj, aby sprawdzić wszystkie próbki za pomoc...

WykorzystaliśmyPylRS i tRNA Pyl do syntezy i montażu odtworzonych mononukleosomów z acetylowanymi histonami specyficznymi dla danego miejsca. PylRS okazał się nieoceniony jako narzędzie do rozszerzania kodu genetycznego do produkcji białek z modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM) i został genetycznie wyewoluowany w celu włączenia około 200 różnych ncAA. PylRS zawiera bursztynowy kodon stop, usuwając konkurencję z innymi aminokwasami podczas translacji. PylRS został po raz pierwszy odkryty w archeonach metanogennych i od tego czasu jest wykorzystywany w biologii chemicznej do włączania nowych reaktywnych grup chemicznych do białek1,2.
MmAcKRS1 powstał z Methanosarcina mazei PylRS i jest często używany w naszym laboratorium do syntezy acetylowanych białek3,4,5,6. MmAcKRS1 dostarcza AcK do bursztynowego miejsca mutacji w wybranym mRNA podczas translacji w Escherichia coli. Technika ta była wcześniej stosowana do włączania AcK w miejscach lizyny histonu H3 K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 i K79 w celu zbadania aktywności sirtuiny 1, 2, 6 i 7 na acetylowanych mononukleosomach sup<="xref">4,5,6. Tutaj szczegółowo opisujemy tę metodę ekspresji acetylowanych histonów i odtwarzania acetylowanych nukleosomów.

<table><tbody><tr><td>0,5 M TE Bufor</td><td>NA</td><td></td><td>NA 0,5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>1 M TE Bufor</td><td>NA</td><td></td><td>NA 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>100x TE</td><td></td><td></td> Bufor NA NA <td></td></tr><tr><td>2 M TE Bufor</td><td>NA</td><td>NA</td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>20 mM TE Bufor</td><td>NA</td><td></td><td>NA 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M chlorek guanidyny, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0</td></tr><tr><td>Bufor do płukania kolumny</td><td></td> acetylolizyny <td>NA NA NA</td><td>6 M mocznik, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazol pH 7,8</td></tr><tr><td>Bufor elucyjny</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td> Fisherbrand&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pompa do transportu chemikaliów o zmiennym przepływie</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza</td><td></td><td></td><td></td>His-TEV</tr><tr><td>Bufor do lizy histonów</td><td>NA</td><td>NA 60</td><td>mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8,0</td></tr><tr><td>Ni-NTA Żywica</td><td></td><td></td><td>6 M mocznik, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazol, pH 7,8</td></tr><tr><td>PCR Zestaw do czyszczenia</td><td>Epokowe godziny życia</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do przemywania peletów</td><td>NA</td><td>NA 60</td><td>mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Bufor magazynujący</td><td>NA</td><td>NA 20</td><td>mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerolu, pH 7,8</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Acetylowane białka histonowe mogą być łatwo wyrażane w Escherichia coli, kodując zmutowaną, specyficzną dla N ε-acetylo-lizyny (AcK) syntetazę tRNA (MmAcKRS1) i jej pokrewne tRNA (tRNAPyl) do łączenia odtworzonych mononukleosomów z specyficznymi dla miejsca acetylowanymi histonami. MmAcKRS1 itRNA Pyl dostarczają AcK do bursztynowego miejsca mutacji w wybranym mRNA podczas translacji w Escherichia coli. Technika ta była szeroko stosowana do włączania AcK w miejscach lizyny H3. Syntetaza pirolizylo-tRNA (PylRS) może być również łatwo ewoluowana w celu włączenia innych niekanonicznych aminokwasów (ncAA) w celu modyfikacji lub funkcjonalizacji białek specyficznych dla miejsca. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę włączania AcK przy użyciu systemu MmAcKRS1 do histonu H3 i integracji acetylowanych białek H3 z odtworzonymi mononukleosomami. Acetylowane odtworzone mononukleosomy mogą być stosowane w testach biochemicznych i wiążących, określaniu struktury i nie tylko. Otrzymywanie zmodyfikowanych mononukleosomów ma kluczowe znaczenie dla projektowania eksperymentów związanych z odkrywaniem nowych oddziaływań i zrozumieniem epigenetyki.

Dimery, tetramery i oktamery można ocenić, przeprowadzając elektroforezę na żelu SDS PAGE 12% (Rysunek 1 oraz Rysunek 2). Tutaj widać, że niektóre acetylowane tetramery mają niższą wydajność niż inne (Rysunek 1). W rzeczywistości, im bliżej regionu rdzeniowego, tym niższa obserwowana wydajność. Najprawdopodobniej wynika to z faktu, że acetylacja utrudnia składanie tetrameru w miarę zbliżania się do r...

Tutaj prezentujemy metodę ekspresji acetylowanych białek histonowych za pomocą ekspansji kodu genetycznego i składania odtworzonych nukleosomów in vitro.

Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Otrzymanie zmodyfikowanego mononukleosomu ma kluczowe znaczenie dla projektowania eksperymentów epigenetycznych. Nasz protokół zapewnia acetylowane, odtworzone mononukleosomy, które można stosować w testach biochemicznych i wiążących, określaniu struktury i nie tylko. Podstawową zaletą naszej techniki jest jej uniwersalność.System ten można łatwo zmodyfikować w celu włączenia wielu rodzajów modyfikacji do mononukleosomów. Zacznij od przygotowania jednego litra autoklawizowanej pożywki 2YT w kolbie hodowlanej. Zaszczepić 20 mililitrów pożywki zawierającej odpowiednie antybiotyki z kotransformowanym zapasem komórek, który ma znacznik zawierający plazmid i pEVOL-AckRS i hodować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby uzyskać OD 0,6.Dodaj odpowiednie antybiotyki do jednego litra autoklawizowanej pożywki 2YT i zaszczep ją 20 mililitrami kultury starterowej. Hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin, aby uzyskać OD 0,6, 2,8. Dodaj środki indukujące i AcK, aby uzyskać końcowe stężenie jednego milimolowego IPTG, 0,2% arabinozy i pięciu milimolowych AcK.Uprawiaj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu godzin. Następnie granulować komórki w temperaturze 2 700 x g przez 15 minut i przechowywać je przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozpuść osad w 50 mililitrach buforu do lizy histonów na litr kultury i poddaj sonikacji komórki przy amplitudzie 60% przez trzy minuty z jednosekundowymi przerwami i jedną sekundą przerwy.Korpusy wtrącające granulki po 41, 600 x g przez 45 minut. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić inkluzje w 30 mililitrach buforu do lizy histonów, a następnie ponownie odwirować przez 30 minut. Ponownie zawiesić ciała inkluzyjne w 30 mililitrach buforu do przemywania peletów i powtórzyć wirowanie.Następnie rozpuść ciała inkluzyjne w 25 mililitrach sześciomolowego buforu chlorowodorku guanidyny. Inkubować z mieszaniem w temperaturze 37 stopni przez godzinę, a następnie wirować przez 45 minut. Inkubować supernatant z jednym mililitrem żywicy niklowo-NTA w równowadze z sześciomolowym buforem chlorowodorku guanidyny przez dwie godziny i kontynuować oczyszczanie niklu-NTA w warunkach denaturacji.Przemyć kolumnę trzema objętościami buforu płuczącego, a następnie wymyć acetylowane białko histonowe za pomocą 10 mililitrów buforu elucyjnego. Dializować acetylowane białko histonowe w stosunku do 5% buforu kwasu octowego w celu usunięcia soli przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wymieniając bufor co najmniej sześć razy. Podwielokrotność i lipolizować białko i przechowywać w nieskończoność w temperaturze minus 80 stopni.Rozpuść podwielokrotności granulek białka histonowego H2A, H2B, H3 i H4 tak, aby w buforze chlorowodorku guanidyny znajdował się oddzielny zapas każdego białka histonowego o łącznej objętości 100 mikrolitrów. Oblicz stężenie każdego białka histonowego, mierząc absorbenty w odległości 280 nanometrów. Jeśli absorbancja jest większa niż jeden dla któregokolwiek białka, rozcieńczyć buforem chlorowodorku guanidyny, aby uzyskać dokładniejsze stężenie.Połączyć H2A z H2B i H3 z białkami H4 w stosunku molowym jeden do jednego i rozcieńczyć do całkowitego stężenia białka wynoszącego cztery mikrogramy na mikrolitr. Dializuj sekwencyjnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza w stosunku do dwóch molowych TE przez noc, jednego molowego buforu TE przez dwie godziny i 0,5 molowego buforu TE przez pięć godzin. Po zakończeniu odwirować w temperaturze 16 800 x g w czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć osad.Oblicz stężenie dimerów i tetramerów histonów, mierząc absorbancję przy 280 nanometrach. Wymieszaj dimery i tetramery w stosunku molowym jeden do jednego i dostosuj stężenie chlorku sodu do 2M. Dostosuj 601 DNA do dwóch molowych TE za pomocą buforu 100X TE i stałego chlorku sodu.Dodaj roztwór do oktamera histonów w stosunku molowym 0,85, 2,9 do jednego. Przenieś mieszaninę histonów DNA do worka dializacyjnego i umieść ją w około 200 mililitrach dwumolowego buforu TE, bardzo delikatnie mieszając w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ustaw pompę perystaltyczną tak, aby powoli kapała w buforze TE bez soli.Gdy objętość mniej więcej się podwoi, wylej połowę objętości. Zrób to co najmniej cztery razy, co może zająć od czterech do ośmiu godzin, w zależności od początkowej głośności. Po zmniejszeniu stężenia soli do 150 milimolowców dializuj przez noc w 20-milimolowym buforze TE.Usunąć osady przez odwirowanie i zmierzyć stężenie nukleosomów za pomocą czytnika płytkowego. Dodaj proteazę his-TEV i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć wszystkie znaczniki histydyny. Następnie usuń zanieczyszczenia znacznikiem histydyny z roztworu nukleosomu za pomocą żywicy niklowo-NTA w dół.Inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę, aby ustawić nukleosom i homogenizować próbkę. Przechowuj nukleosomy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez krótki czas. W przypadku długotrwałego przechowywania należy dializować nukleosomy w buforze magazynowym i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Niektóre z acetylowanych tetramerów miały niższą wydajność niż inne, co oceniono za pomocą 12% żelu SDS-PAGE. Im bliżej obszaru rdzenia, tym niższy obserwowany plon. Było to najprawdopodobniej spowodowane acetylacją, zakłócającą montaż oktamera.Po złożeniu oktamerów z sekwencją DNA 601, nukleosom można ocenić za pomocą żelu PAGE 5%1X natywnego dla TBE, a następnie wybarwić bromkiem etydyny. Przed pozycjonowaniem termicznym obserwowane pasma nukleosomów są bardzo szerokie i mogą tworzyć smugi. Wykonując ten protokół, utrzymuj białka na lodzie przez cały czas.Kluczowe jest utrzymanie złożonych dimerów, tetramerów i nukleosomów. Procedura ta pozwoliła naukowcom zainstalować miejsca acetylolizyny, w szczególności w mononukleosomach, otwierając drzwi do badania modyfikacji potranslacyjnych w kontekście chromatyny. Można go łatwo dostosować do instalacji dowolnej liczby aminokwasów niekanonicznych.

site-specific-lysine-acetylation-histones-for-nucleosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy metodę wykorzystującą spektrometrię mas MALDI oraz chemię redukcyjnego metylowania do ilościowego określania zmian w metylowaniu lizyny.

Zastosowanie metody MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizyny

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Ten manuskrypt opisuje metody zastosowania technologii mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających histony i ich potranslacyjne modyfikacje.

Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Rozszerzenie kodu genetycznego służy jako potężne narzędzie do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym acetylacji białek. Tutaj demonstrujemy prosty protokół wykorzystania tej techniki do generowania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach w komórkach Escherichia coli.

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Badanie to ustanowiło metodę wykorzystującą rozszerzenie kodu genetycznego do skutecznej inkorporacji laktylizyny (Klac) w określonych miejscach ludzkiej enolazy-1 (hENO1) i superfolderu GFP (sfGFP) w komórkach Escherichia coli i ssaków.

Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków

Poznaj metodę specyficznej acetylacji lizyny w histonie H3 przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli. Technika umożliwia rekonstytucję modyfikowanych mononukleosomów do badań epigenetycznych.

Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal

Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów