Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Protokół ten umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym aktywności systemu sygnalizacji systemowej rośliny w całym zakładzie poprzez monitorowanie dynamiki glutaminianu wapnia i apoplastu w odpowiedzi na zranienie. Ta metoda obrazowania w czasie rzeczywistym w całej roślinie zapewnia solidne narzędzie do zrozumienia dynamiki sygnałów szybkich i długodystansowych w roślinach, łącząc wysoką rozdzielczość przestrzenną i łatwość użycia. Protokół ten może dostarczyć nowych informacji na temat przestrzennej i czasowej charakterystyki systemu sygnalizacji wapniowej zarówno w biotycznych, jak i abiotycznych reakcjach na stres u innych gatunków roślin.

Procedurę zademonstruje Takuya Uemura, adiunkt z mojego laboratorium. Zacznij od włączenia zmotoryzowanego fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, wyposażonego w obiektyw 1X i kamerę sCMOS. Skonfiguruj ustawienia urządzenia tak, aby naświetlało światłem wzbudzenia wyśrodkowanym na 470 nanometrach, wybranym za pomocą filtra, który przepuszcza światło w zakresie od 450 do 490 nanometrów.

Pozyskuj światło emisyjne za pomocą filtra, który przepuszcza od 510 do 560 nanometrów. Zdejmij pokrywkę z naczynia zawierającego roślinę i umieść ją pod soczewką obiektywu. Sprawdź sygnał fluorescencyjny z instalacji.

Następnie odczekaj około 30 minut w ciemności, aż rośliny przystosują się do nowych warunków środowiskowych. Dostosuj ostrość i powiększenie, aby zobaczyć całą roślinę w polu view. Następnie ustaw parametry akwizycji, aby wykryć sygnały fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do obrazowania mikroskopów.

Ustaw czas nagrywania na 11 minut. Obraz przez pięć minut przed rozpoczęciem eksperymentu, aby przyzwyczaić roślinę do naświetlania światłem niebieskim z mikroskopu, a następnie rozpocznij nagrywanie. Aby określić średnią wyjściową fluorescencję, zapisz co najmniej 10 klatek przed zranieniem lub zastosowaniem glutaminianu.

Aby zobrazować w czasie rzeczywistym indukowane przez ranę cytozolowe zmiany stężenia jonów wapnia i glutaminianu apoplastu, odetnij ogonek liściowy lub środkowy obszar liścia L1 nożyczkami. Aby zobrazować w czasie rzeczywistym cytozolowe zmiany wapnia wywołane glutaminianem, wytnij nożyczkami około jednego milimetra od czubka liścia L1 w poprzek głównej żyły. Po co najmniej 20 minutach nałóż 10 mikrolitrów 100-milimolowego glutaminianu na powierzchnię cięcia liścia.

W przypadku analizy intensywności fluorescencji w czasie należy zdefiniować obszar zainteresowania w miejscu, w którym ma być analizowana intensywność fluorescencji. Zdefiniuj dwa ROI do obliczenia prędkości fali wapniowej. W oprogramowaniu do obrazowania kliknij pomiar czasu, zdefiniuj i zakreśl.

Zmierz odległość między dwoma regionami, klikając adnotacje i pomiar, długość i prostą linię. Zmierz surowe wartości kwiatostanu w każdym ROI w czasie, klikając pomiar, a następnie wyeksportuj surowe dane do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, aby przekonwertować sygnał fluorescencyjny na liczby w każdym punkcie czasowym. Określ podstawową wartość fluorescencji, która jest określona jako F zero, obliczając średnią F w pierwszych 10 klatkach zarejestrowanych danych, a następnie znormalizuj dane F zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.

W przypadku analizy fali prędkości wapnia należy zdefiniować znaczący punkt narastania sygnału powyżej wstępnie stymulowanych wartości jako reprezentujący wykrycie wzrostu stężenia wapnia w każdym ROI. Oblicz różnicę czasu we wzroście wapnia między dwoma ROI i odległość między nimi, aby określić prędkości dowolnej fali wapniowej. Pokazano tutaj propagację wywołanej raną zmiany stężeń cytozolowego jonu wapnia i glutaminianu apoplastycznego.

Odcięcie ogonka liściowego u roślin wykazujących ekspresję GCaMP-3 doprowadziło do znacznego wzrostu stężenia wapnia. Został wywołany miejscowo, a następnie rozprzestrzenił się po całym układzie krwionośnym. W ciągu kilku minut sygnał został szybko rozchodzony do sąsiednich liści.

Po przecięciu liścia i roślin wyrażających zasadową chitynazę I klej sniffer zaobserwowano szybki wzrost glutaminianu apoplastu wokół wyciętego obszaru. W ciągu kilku minut sygnał rozchodził się również przez układ krwionośny. W celu obrazowania w czasie rzeczywistym propagacji sygnału wapnia wywołanej zastosowaniem glutaminianu, przecięto krawędź liścia u roślin wykazujących ekspresję CCaMP-3.

Spowodowało to lokalny wzrost stężenia cytozolowych jonów wapnia, ale sygnał zniknął w ciągu kilku minut. Po około 10 minutach glutaminian został nałożony na powierzchnię cięcia, powodując szybki miejscowy wzrost stężenia cytozolowego wapnia, a następnie rozpropagowanie tego sygnału do dystalnych liści. Aby zmierzyć zmiany wewnątrz stężenia wapnia w stanie stałym wywołane zranieniem w liściu układowym, zmierzono zmianę natężenia sygnału GCaMP-3 w czasie w dwóch obszarach zainteresowania.

Mierzono również zmiany stężenia glutaminianu apoplastycznego w odpowiedzi na uszkodzenia mechaniczne. Sygnatura glutaminianu wykazywała pojedynczy pik po około 100 sekundach od zranienia. Eksperyment ten powinien być przeprowadzony w warunkach kontrolowanej temperatury i wilgotności, ponieważ są one podwyższone przez zmiany w tych warunkach środowiskowych.

Protokół ten oferuje potencjał do zapewnienia wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw sygnalizacji na duże odległości poprzez wykorzystanie mutantów, które są wadliwymi i domniemanymi elementami laboratoryjnego systemu sygnalizacji.