Name: Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym sygnałów wapniowych i glutaminianowych u Arabidopsis thaliana w odpowiedzi na uszkodzenia mechaniczne. Ta metoda pozwala badać dynamikę sygnalizacji systemicznej w roślinach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (17H05007 i 18H05491) dla MT, Narodowej Fundacji Nauki (IOS1557899 i MCB2016177) oraz Narodowej Agencji Aeronautyki i Przestrzeni Kosmicznej (NNX14AT25G i 80NSSC19K0126) dla SG.

1. Przygotowanie materiału roślinnego
<ol>
	<li>W mikroprobówce o pojemności 1,5 ml wysterylizuj powierzchniowo nasiona rośliny Arabidopsis thaliana (akcesja Col-0) wyrażającej GCaMP3 lub CHIB-iGluSnFR przez wstrząsanie 20% (v/v) NaClO przez 3 minuty, a następnie przemyj 5 razy sterylną wodą destylowaną. 
	UWAGA: Transgeniczne linie Arabidopsis wykazujące ekspresję GCaMP3 lub CHIB-iGluSnFR zostały opisane wcześniej6.</li>
	<li>W sterylnym kapturze wysiewaj 13 wysterylizowanych powierzchniowo nasion na 10 cm kwadratowej plastikowej szalce Petriego wypełnionej 30 ml sterylnego (autoklawowanego) podłoża Murashige i Skoog (MS) [1x sole MS, 1% (w/v) sacharozy, 0,01% (w/v) mioinozytol, 0,05% (w/v) MES i 0,5% (w/v) gumy gellan; pH 5,7 skorygowane za pomocą 1N KOH]. Załóż pokrywkę i owiń taśmą chirurgiczną.</li>
	<li>Po inkubacji w ciemności w temperaturze 4 °C przez 2 dni, umieścić płytki poziomo w temperaturze 22 °C w komorze wzrostowej w ciągłym świetle (90-100 μmol m-2 s-1) na około 2 tygodnie przed użyciem. Po 2 tygodniach policz liczbę liści Arabidopsis od najstarszego do najmłodszego44 (Rysunek 1). Reakcje na rany preferencyjnie przesuwają się z uszkodzonego liścia (n) na liście o numerach n ± 3 i n ± 56. 
	UWAGA: W tym protokole szalka Petriego zostanie otwarta w celu zobrazowania rany i efektów glutaminianu pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dlatego kolejne etapy tego eksperymentu powinny być przeprowadzane w warunkach pokojowych o kontrolowanej temperaturze i wilgotności. Dzieje się tak, ponieważ sygnały Ca2+ są również wywoływane przez zmiany w tych warunkach środowiskowych. Wiadomo również, że niebieskie światło, emitowane z mikroskopu podczas rejestracji w celu wzbudzenia fluorescencji białka biosensora, może wywołać wzrost stężenia cytozolowego Ca2+ 45 i dlatego roślina powinna być zaaklimatyzowana do naświetlania światłem niebieskim przez kilka minut przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie chemiczne
<ol>
	<li>Rozpuść L-glutaminian w płynnym podłożu wzrostowym [1/2x sole MS, 1% (w/v) sacharozy i 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 dostosowane za pomocą 1N KOH], aby uzyskać 100 mM roztwór roboczy. 
	UWAGA: Unikaj stosowania soli glutaminianu, takich jak glutaminian sodu, aby zapobiec potencjalnemu wpływowi kationów na dynamikę Ca2 +.</li>
</ol>
3. Ustawienie mikroskopu i przeprowadzanie obrazowania w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Włącz zmotoryzowany stereomikroskop fluorescencyjny wyposażony w soczewkę obiektywu 1x (NA = 0,156) i kamerę sCMOS (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) i skonfiguruj ustawienia urządzenia tak, aby naświetlać światłem wzbudzającym 470/40 nm i uzyskiwać światło emisyjne przechodzące przez filtr 535/50 nm. 
	UWAGA: Każdy mikroskop fluorescencyjny wrażliwy na GFP może być używany do wykrywania sygnałów GCaMP3 i iGluSnFR w czasie rzeczywistym, ale do pozyskiwania sygnałów z całej instalacji zalecany jest obiektyw o małej mocy i bardzo czuła kamera z szerokim chipem sCMOS. Obiektyw o niskiej mocy pozwala na obrazowanie reakcji całej rośliny Arabidopsis, a użycie bardzo czułej kamery pozwala na szybkie pozyskiwanie danych potrzebnych do uchwycenia szybkiego przebiegu w czasie fali Ca2+ wyzwalanej przez ranę. Dla mikroskopu fluorescencyjnego użytego w tym badaniu maksymalne wartości pola widzenia i rozdzielczości czasowej wynoszą odpowiednio 3 cm x 3 cm i 30 klatek na sekundę (fps).</li>
	<li>Zdejmij pokrywkę i umieść naczynie pod soczewką obiektywu.</li>
	<li>Sprawdź sygnał fluorescencyjny z rośliny, a następnie odczekaj około 30 minut w ciemności, aż rośliny przystosują się do nowych warunków środowiskowych. Ten etap adaptacji jest wymagany, ponieważ zmiany wilgotności wywołują [Ca2 +] wzrost cyt u roślin, który może zakłócać wszelkie zdarzenia związane z ranami.</li>
	<li>Dostosuj ostrość i powiększenie, aby zobaczyć całą roślinę w polu view. W obecnym protokole zastosowano powiększenie 0,63x.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem obrazowania w czasie rzeczywistym należy skonfigurować parametry akwizycji, aby wykryć sygnały fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do obrazowania mikroskopowego. Ustawienia obrazowania w bieżącym protokole to: czasy ekspozycji i interwałów ustawione odpowiednio na 1,8 s i 2 s (tj. 0,5 kl./s). Ustaw czas nagrywania na 11 minut.</li>
	<li>Obraz przez 5 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, aby przyzwyczaić roślinę do napromieniowania światłem niebieskim z mikroskopu, a następnie rozpocznij nagrywanie, klikając Uruchom teraz lub równoważne polecenie w używanym oprogramowaniu mikroskopu. Aby określić średnią wyjściową fluorescencję, zapisz co najmniej 10 klatek (tj. co najmniej 20 s w obecnym protokole) przed zranieniem lub zastosowaniem glutaminianu (patrz sekcja 4).
	<ol>
		<li>Aby zobrazować w czasie rzeczywistym zmiany [Ca2 +] cyt i [Glu]apo, należy przeciąć ogonek liściowy lub środkową część liścia L1 nożyczkami (<silna klasa="xfig">Ryc. 3 i <silna klasa="xfig">Ryc. 4).</li>
		<li>Aby zobrazować w czasie rzeczywistym zmiany [Ca2 +] cyt wywołane glutaminianem, odetnij nożyczkami krawędź (około 1 mm od końca) liścia 1 w poprzek głównej żyły. Po co najmniej 20-minutowym okresie rekonwalescencji nałóż 10 μl 100 mM glutaminianu na powierzchnię cięcia liścia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5). 
		UWAGA: To wstępne cięcie było konieczne, aby umożliwić dostęp glutaminianu do apoplastu liściowego w celu wywołania reakcji. Ponadto stwierdzono, że nałożenie kropli wody destylowanej na powierzchnię cięcia liścia L1 ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia wysuszeniu próbek podczas odzyskiwania przed zastosowaniem glutaminianu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu 11-minutowego nagrywania zapisz dane.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Do analizy intensywności fluorescencji w czasie zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) w miejscu, w którym ma być analizowana intensywność fluorescencji (<silna klasa="xfig">Rysunek 6 i <silna klasa="xfig">Rysunek 7). Aby obliczyć prędkość fali Ca2+, zdefiniuj 2 ROI (ROI1 i ROI2) do analizy. W oprogramowaniu do obrazowania kliknij Pomiar czasu | Definiowanie | Okrąg. Zmierz odległość między ROI1 i ROI2, klikając Adnotacje i pomiar | Długość | Prosta linia (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
	<li>Zmierz surowe wartości fluorescencji (F) w każdym ROI w czasie, klikając Zmierz. Eksportuj surowe dane do arkusza kalkulacyjnego, aby przekonwertować sygnał fluorescencji na liczby w każdym punkcie czasu, klikając Wszystko do Excela | Eksport.</li>
	<li>Określ wyjściową wartość fluorescencji, która jest zdefiniowana jako F0, obliczając średnią F z pierwszych 10 klatek (tj. przed leczeniem) w zarejestrowanych danych.</li>
	<li>Znormalizuj dane F (obliczając ΔF/F) za pomocą równania ΔF/F = (F−F0)/F0, gdzie ΔF jest zależną od czasu zmianą fluorescencji.</li>
	<li>W przypadku analizy fali prędkości fali Ca2+ należy zdefiniować znaczący punkt narastania sygnału powyżej wstępnie stymulowanych wartości jako reprezentujący wykrycie wzrostu Ca2+ w każdym ROI (t1 i t 2) przy użyciu kryterium wzrostu do 2× odchylenia standardowego (2x SD) obliczonego na podstawie danych F0 za pomocą oprogramowania statystycznego. 95% F0 dane mieszczą się w granicach 2x SD od średniej, co wskazuje, że przypadkowy wzrost sygnału powyżej tego poziomu wynosi ≤5%. Oblicz różnicę czasu wzrostu Ca2+ między ROI1 i ROI2 [t2- t1 opóźnienie czasowe (Δt)] i zmierz odległość między ROI1 a ROI2, a następnie określ prędkości dowolnej fali Ca2+.</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Sygnalizacja ogólnoustrojowa jest ważna, aby rośliny reagowały na zlokalizowane zewnętrzne bodźce środowiskowe, a następnie utrzymywały homeostazę na poziomie całej rośliny. Chociaż nie są wyposażone w zaawansowany układ nerwowy jak zwierzęta, wykorzystują szybką komunikację zarówno wewnątrz, jak i między narządami, w oparciu o takie czynniki, jak ruchome sygnały elektryczne (i ewentualnie hydrauliczne) oraz rozchodzące się fale ROS i Ca2 + 46,47. Opis...

Rośliny nie mogą uciec przed stresami biotycznymi, np. owadami żywiącymi się nimi, dlatego rozwinęły zaawansowane systemy wykrywania stresu i transdukcji sygnału, aby wykrywać, a następnie chronić się przed wyzwaniami, takimi jak roślinożerność1. Po zranieniu lub ataku roślinożercy rośliny inicjują szybkie reakcje obronne, w tym akumulację fitohormonu kwasu jasmonowego (JA) nie tylko w miejscu zranienia, ale także w nieuszkodzonych narządach dystalnych2. Ten JA następnie zarówno wyzwala reakcje obronne w bezpośrednio uszkodzonych tkankach, jak i prewencyjnie indukuje obronę w nieuszkodzonych częściach rośliny. U rzodkiewnika nagromadzenie JA wywołane zranieniem wykryto w dystalnych, nienaruszonych liściach w ciągu zaledwie kilku minut od uszkodzenia w innym miejscu rośliny, co sugeruje, że z uszkodzonego liścia przesyłany jest szybki i długodystansowy sygnał3. Zaproponowano kilka kandydatów, takich jak Ca2+, reaktywne formy tlenu (ROS) i sygnały elektryczne, które mogą służyć jako te długodystansowe sygnały nawijane w roślinach4,5.
Ca2+ jest jednym z najbardziej wszechstronnych i wszechobecnych elementów drugiego posłańca w organizmach eukariotycznych. U roślin żucie gąsienic i mechaniczne zranienia powodują drastyczny wzrost stężenia cytozolowego Ca2+ ([Ca2+]cyt) zarówno w zranionym liściu, jak i w nieuszkodzonych odległych liściach6,7. Ten ogólnoustrojowy sygnał Ca2 + jest odbierany przez wewnątrzkomórkowe białka wykrywające Ca2 +, co prowadzi do aktywacji dalszych szlaków sygnalizacji obronnej, w tym biosyntezy JA8,9. Pomimo licznych doniesień potwierdzających znaczenie sygnałów Ca2+ w reakcjach na rany roślin, informacje na temat przestrzennej i czasowej charakterystyki sygnałów Ca2+ wywołanych zranieniem są ograniczone.
Obrazowanie w czasie rzeczywistym za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ jest potężnym narzędziem do monitorowania i ilościowego określania przestrzennej i czasowej dynamiki sygnałów Ca2+. Do tej pory opracowano wersje takich czujników, które umożliwiają wizualizację sygnałów Ca2+ na poziomie pojedynczej komórki, do tkanek, organów, a nawet całych roślin10. Pierwszym genetycznie kodowanym biosensorem Ca2+ zastosowanym w roślinach było bioluminescencyjne białko aequorin pochodzące z meduzy Aequorea victoria11. Chociaż to chemiluminescencyjne białko było używane do wykrywania zmian Ca2+ w odpowiedzi na różne stresy u roślin12,13,14,15,16,17,18, nie nadaje się do obrazowania w czasie rzeczywistym ze względu na wytwarzany przez niego wyjątkowo niski sygnał luminescencyjny. Wskaźniki Ca2+ oparte na transferze energii rezonansu (FRET) Förster, takie jak żółte cameleony, zostały również z powodzeniem wykorzystane do zbadania dynamiki szeregu zdarzeń sygnalizacyjnych Ca2+ w roślinach19,20,21,22,23,24. Czujniki te są kompatybilne z podejściami do obrazowania i najczęściej składają się z białka wiążącego Ca2+ kalmoduliny (CaM) i peptydu wiążącego CaM (M13) z kinazy łańcucha lekkiego miozyny, wszystkie połączone między dwoma białkami fluoroforowymi, zwykle cyjanem fluorescencyjnym białkiem (CFP) i wariantem żółtego białka fluorescencyjnego (YFP)10. Wiązanie Ca2+ z CaM sprzyja interakcji między CaM i M13, prowadząc do zmiany konformacyjnej czujnika. Zmiana ta sprzyja transferowi energii między CFP a YFP, co zwiększa intensywność fluorescencji YFP przy jednoczesnym zmniejszeniu emisji fluorescencji z CFP. Monitorowanie tego przejścia od fluorescencji CFP do fluorescencji YFP zapewnia następnie miarę wzrostu poziomu Ca2+. Oprócz tych czujników FRET, biosensory Ca2+ oparte na pojedynczym białku fluorescencyjnym (FP), takie jak GCaMP i R-GECO, są również kompatybilne z metodami obrazowania roślin i są szeroko stosowane do badania zmian [Ca2+]cyt ze względu na ich wysoką czułość i łatwość użycia25,26,27,28,29,30. GCaMPs zawierają pojedynczy kołowo permutowany (cp) GFP, ponownie połączony z CaM i peptydem M13. Zależna od Ca2+ interakcja między CaM i M13 powoduje zmianę konformacyjną w czujniku, która sprzyja zmianie stanu protonacji cpGFP, wzmacniając jego sygnał fluorescencyjny. Tak więc, wraz ze wzrostem poziomu Ca2+, sygnał cpGFP wzrasta.
Aby zbadać dynamikę sygnałów Ca2+ generowanych w odpowiedzi na mechaniczne zranienie lub żerowanie roślinożerców, użyliśmy transgenicznych roślin Arabidopsis thaliana wyrażających wariant GCaMP, GCaMP3, oraz mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia6. W ramach tego podejścia udało się zobrazować szybką transmisję sygnału Ca2+ na duże odległości z miejsca rany na liściu do całej rośliny. W ten sposób natychmiast wykryto wzrost [Ca2 +] cyt w miejscu rany, ale ten sygnał Ca2 + był następnie propagowany do sąsiednich liści przez naczynia krwionośne w ciągu kilku minut od zranienia. Co więcej, odkryliśmy, że transmisja tego szybkiego ogólnoustrojowego sygnału rany jest zniesiona u roślin Arabidopsis z mutacjami w dwóch genach podobnych do receptora glutaminianu, Glutaminian Receptor Like (GLR), GLR3.3 i GLR3.66. Wydaje się, że GLR funkcjonują jako kanały Ca2+ bramkowane aminokwasami, zaangażowane w różne procesy fizjologiczne, w tym reakcję na ranę3, wzrost łagiewki pyłkowej31, rozwój korzeni32, cold response33 i odporność wrodzona34. Pomimo tej dobrze poznanej, szerokiej funkcji fizjologicznej GLR, informacje na temat ich właściwości funkcjonalnych, takich jak specyficzność dla ligandów, selektywność jonowa i lokalizacja subkomórkowa, są ograniczone35. Jednak ostatnie badania wykazały, że GLR3.3 i GLR3.6 są zlokalizowane odpowiednio w łyku i ksylemie. Roślinne GLR są podobne do jonotropowych receptorów glutaminianu (iGluRs)36 u ssaków, które są aktywowane przez aminokwasy, takie jak glutaminian, glicyna i D-seryna w układzie nerwowym ssaków37. Rzeczywiście, wykazaliśmy, że zastosowanie 100 mM glutaminianu, ale nie innych aminokwasów, w miejscu rany indukuje szybki, długodystansowy sygnał Ca2 + u Arabidopsis, co wskazuje, że glutaminian zewnątrzkomórkowy prawdopodobnie działa jako sygnał rany u roślin6. Odpowiedź ta została zniesiona w mutancie glr3.3/glr3.6, co sugeruje, że glutaminian może działać przez jeden lub oba te kanały podobne do receptorów i rzeczywiście, ostatnio wykazano, że AtGLR3.6 jest bramkowany przez te poziomy glutaminianu38.
W roślinach, oprócz swojej roli jako aminokwasu strukturalnego, glutaminian został również zaproponowany jako kluczowy regulator rozwoju39; jednak jego przestrzenna i czasowa dynamika jest słabo poznana. Podobnie jak w przypadkuCa2+, opracowano kilka genetycznie kodowanych wskaźników glutaminianu w celu monitorowania dynamiki tego aminokwasu w żywych komórkach40,41. iGluSnFR to oparty na GFP bioczujnik glutaminianu z pojedynczym FP, składający się z cpGFP i białka wiążącego glutaminian (GltI) z Escherichia coli42,43. Zmiana konformacyjna iGluSnFR, która jest indukowana przez wiązanie glutaminianu z GltI, powoduje zwiększoną emisję fluorescencji GFP. Aby zbadać, czy zewnątrzkomórkowy glutaminian działa jako cząsteczka sygnałowa w odpowiedzi na rany roślinne, połączyliśmy sekwencję iGluSnFR z podstawową sekwencją wydzielania peptydu sygnału chitynazy (CHIB-iGluSnFR), aby zlokalizować ten bioczujnik w przestrzeni apoplastycznej6. Podejście to umożliwiło zobrazowanie wszelkich zmian w stężeniu glutaminianu apoplastycznego ([Glu]apo) przy użyciu transgenicznych roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję tego czujnika. Wykryliśmy gwałtowny wzrost sygnału iGluSnFR w miejscu zranienia. Dane te potwierdzają ideę, że glutaminian wycieka z uszkodzonych komórek/tkanek do apoplastu po zranieniu i działa jako sygnał uszkodzenia, aktywując GLR i prowadząc do długodystansowego sygnału Ca2+ w roślinach6.
Tutaj opisujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym całej rośliny, wykorzystującą genetycznie kodowane biosensory do monitorowania i analizowania dynamiki długodystansowych sygnałów Ca2+ i zewnątrzkomórkowego glutaminianu w odpowiedzi na zranienie6. Dostępność szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej i biosensorów wykazujących ekspresję genetycznie kodowanych roślin transgenicznych zapewnia potężne, a jednocześnie łatwe do wdrożenia podejście do wykrywania szybko przesyłanych sygnałów na duże odległości, takich jak faleCa2+.

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis wyrażający GCaMP3</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis wyrażający CHIB-iGluSnFR</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td>GraphPad</tr><tr><td>L-glutaminian</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00501</td><td>Rozpuszczony w płynnym pożywce wzrostowej [1/2x sole MS, 1% (w/v) sacharozy i 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 skorygowane za pomocą 1N KOH].</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) medium</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>392-00591</td><td>skład: 1x sole MS, 1% (w/v) sacharoza, 0,01% (w/v) mioinozytol, 0,05% (w/v) MES i 0,5% (w/v) guma gellan; pH 5,7 skorygowane za pomocą 1N KOH.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ25</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Analiza AR</td><td>Obiektyw Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x (P2-SHR PLAN APO)Aparat</td> <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowa plastikowa szalka Petriego</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td></td></tr></tbody></table>

szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Rośliny reagują na mechaniczne obciążenia, takie jak zranienia i roślinożerność, wywołując reakcje obronne zarówno w uszkodzonych, jak i nieuszkodzonych dystalnych częściach. Po zranieniu liścia w miejscu rany następuje wzrost stężenia cytozolowych jonów wapnia (sygnałCa2+). Sygnał ten jest szybko przesyłany do nieuszkodzonych liści, gdzie aktywowane są reakcje obronne. Nasze ostatnie badania wykazały, że glutaminian wyciekający z uszkodzonych komórek liścia do otaczającego je apoplastu służy jako sygnał rany. Ten glutaminian aktywuje kanały przepuszczalne Ca2+ podobne do receptora glutaminianu, co następnie prowadzi do propagacji sygnału Ca2+ na duże odległości w całej roślinie. Przestrzenną i czasową charakterystykę tych zdarzeń można uchwycić za pomocą obrazowania w czasie rzeczywistym żywych roślin wykazujących ekspresję genetycznie kodowanych bioczujników fluorescencyjnych. W tym miejscu wprowadzamy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym w całej roślinie w celu monitorowania dynamiki zarówno sygnałów Ca2+, jak i zmian w glutaminianu apoplastu, które zachodzą w odpowiedzi na zranienie. Podejście to wykorzystuje szerokokątny mikroskop fluorescencyjny i transgeniczne rośliny Arabidopsis wykazujące ekspresję biosensorów Ca2+ i glutaminianu opartych na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP). Ponadto przedstawiamy metodologię łatwego wywoływania indukowanej ranami, wyzwalanej glutaminianem szybkiej i długodystansowej propagacji sygnału Ca2+. Protokół ten można również zastosować do badań nad innymi stresami roślinnymi, aby pomóc w zbadaniach, w jaki sposób sygnalizacja systemowa roślin może być zaangażowana w ich sieci sygnalizacyjne i reagowania.

Propagacja sygnału [Ca2+]cyt oraz [Glu]apo w odpowiedzi na uszkodzenie została przedstawiona na Rysunku 3, Rysunku 4, w Filmie S1 oraz Filmie S2. Przecięcie ogonka liścia 1 u roślin wykazujących ekspresję GCaMP3 (w 0 s) doprowadziło do znaczącego wzrostu poziomu [Ca2+]cyt, który został szybko indukowany lokalnie w tkankach przewodzących (w 40...

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Protokół ten umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym aktywności systemu sygnalizacji systemowej rośliny w całym zakładzie poprzez monitorowanie dynamiki glutaminianu wapnia i apoplastu w odpowiedzi na zranienie. Ta metoda obrazowania w czasie rzeczywistym w całej roślinie zapewnia solidne narzędzie do zrozumienia dynamiki sygnałów szybkich i długodystansowych w roślinach, łącząc wysoką rozdzielczość przestrzenną i łatwość użycia. Protokół ten może dostarczyć nowych informacji na temat przestrzennej i czasowej charakterystyki systemu sygnalizacji wapniowej zarówno w biotycznych, jak i abiotycznych reakcjach na stres u innych gatunków roślin.Procedurę zademonstruje Takuya Uemura, adiunkt z mojego laboratorium. Zacznij od włączenia zmotoryzowanego fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, wyposażonego w obiektyw 1X i kamerę sCMOS. Skonfiguruj ustawienia urządzenia tak, aby naświetlało światłem wzbudzenia wyśrodkowanym na 470 nanometrach, wybranym za pomocą filtra, który przepuszcza światło w zakresie od 450 do 490 nanometrów.Pozyskuj światło emisyjne za pomocą filtra, który przepuszcza od 510 do 560 nanometrów. Zdejmij pokrywkę z naczynia zawierającego roślinę i umieść ją pod soczewką obiektywu. Sprawdź sygnał fluorescencyjny z instalacji.Następnie odczekaj około 30 minut w ciemności, aż rośliny przystosują się do nowych warunków środowiskowych. Dostosuj ostrość i powiększenie, aby zobaczyć całą roślinę w polu view. Następnie ustaw parametry akwizycji, aby wykryć sygnały fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do obrazowania mikroskopów.Ustaw czas nagrywania na 11 minut. Obraz przez pięć minut przed rozpoczęciem eksperymentu, aby przyzwyczaić roślinę do naświetlania światłem niebieskim z mikroskopu, a następnie rozpocznij nagrywanie. Aby określić średnią wyjściową fluorescencję, zapisz co najmniej 10 klatek przed zranieniem lub zastosowaniem glutaminianu.Aby zobrazować w czasie rzeczywistym indukowane przez ranę cytozolowe zmiany stężenia jonów wapnia i glutaminianu apoplastu, odetnij ogonek liściowy lub środkowy obszar liścia L1 nożyczkami. Aby zobrazować w czasie rzeczywistym cytozolowe zmiany wapnia wywołane glutaminianem, wytnij nożyczkami około jednego milimetra od czubka liścia L1 w poprzek głównej żyły. Po co najmniej 20 minutach nałóż 10 mikrolitrów 100-milimolowego glutaminianu na powierzchnię cięcia liścia.W przypadku analizy intensywności fluorescencji w czasie należy zdefiniować obszar zainteresowania w miejscu, w którym ma być analizowana intensywność fluorescencji. Zdefiniuj dwa ROI do obliczenia prędkości fali wapniowej. W oprogramowaniu do obrazowania kliknij pomiar czasu, zdefiniuj i zakreśl.Zmierz odległość między dwoma regionami, klikając adnotacje i pomiar, długość i prostą linię. Zmierz surowe wartości kwiatostanu w każdym ROI w czasie, klikając pomiar, a następnie wyeksportuj surowe dane do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, aby przekonwertować sygnał fluorescencyjny na liczby w każdym punkcie czasowym. Określ podstawową wartość fluorescencji, która jest określona jako F zero, obliczając średnią F w pierwszych 10 klatkach zarejestrowanych danych, a następnie znormalizuj dane F zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.W przypadku analizy fali prędkości wapnia należy zdefiniować znaczący punkt narastania sygnału powyżej wstępnie stymulowanych wartości jako reprezentujący wykrycie wzrostu stężenia wapnia w każdym ROI. Oblicz różnicę czasu we wzroście wapnia między dwoma ROI i odległość między nimi, aby określić prędkości dowolnej fali wapniowej. Pokazano tutaj propagację wywołanej raną zmiany stężeń cytozolowego jonu wapnia i glutaminianu apoplastycznego.Odcięcie ogonka liściowego u roślin wykazujących ekspresję GCaMP-3 doprowadziło do znacznego wzrostu stężenia wapnia. Został wywołany miejscowo, a następnie rozprzestrzenił się po całym układzie krwionośnym. W ciągu kilku minut sygnał został szybko rozchodzony do sąsiednich liści.Po przecięciu liścia i roślin wyrażających zasadową chitynazę I klej sniffer zaobserwowano szybki wzrost glutaminianu apoplastu wokół wyciętego obszaru. W ciągu kilku minut sygnał rozchodził się również przez układ krwionośny. W celu obrazowania w czasie rzeczywistym propagacji sygnału wapnia wywołanej zastosowaniem glutaminianu, przecięto krawędź liścia u roślin wykazujących ekspresję CCaMP-3.Spowodowało to lokalny wzrost stężenia cytozolowych jonów wapnia, ale sygnał zniknął w ciągu kilku minut. Po około 10 minutach glutaminian został nałożony na powierzchnię cięcia, powodując szybki miejscowy wzrost stężenia cytozolowego wapnia, a następnie rozpropagowanie tego sygnału do dystalnych liści. Aby zmierzyć zmiany wewnątrz stężenia wapnia w stanie stałym wywołane zranieniem w liściu układowym, zmierzono zmianę natężenia sygnału GCaMP-3 w czasie w dwóch obszarach zainteresowania.Mierzono również zmiany stężenia glutaminianu apoplastycznego w odpowiedzi na uszkodzenia mechaniczne. Sygnatura glutaminianu wykazywała pojedynczy pik po około 100 sekundach od zranienia. Eksperyment ten powinien być przeprowadzony w warunkach kontrolowanej temperatury i wilgotności, ponieważ są one podwyższone przez zmiany w tych warunkach środowiskowych.Protokół ten oferuje potencjał do zapewnienia wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw sygnalizacji na duże odległości poprzez wykorzystanie mutantów, które są wadliwymi i domniemanymi elementami laboratoryjnego systemu sygnalizacji.

wide-field-real-time-imaging-local-systemic-wound-signals

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Embrionalny naskórek zarodków Drosophila w bardzo późnym stadium dostarcza systemu in vivo do szybkiej analizy reakcji na nakłucie rany i może być łączony z manipulacjami genetycznymi lub chemicznymi zabiegami mikroiniekcji w celu przyspieszenia badań nad gojeniem się ran w celu translacji na modele ssaków.

Test mikroiniekcji rany i lokalizacja in vivo reporterów odpowiedzi naskórka na ranę w zarodkach Drosophila.

Ten protokół opisuje proces szybkiego zbierania obrazów sadzonek rzodkiewnika reagujących na bodziec grawitacyjny za pomocą dostępnych na rynku skanerów płaskich.  Metoda ta pozwala na niedrogie, wysokonakładowe przechwytywanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, które można poddać dalszym algorytmom analizy.

Używanie skanerów płaskich do zbierania poklatkowych obrazów o wysokiej rozdzielczości odpowiedzi grawitropowej korzenia rzodkiewnika

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak monitorować dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie, pokazując kropki PATROL1 oznaczonej GFP, białka transportującego błonę, w korze komórkowej kompleksu szparkowego u Arabidopsis thaliana.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Ten protokół przedstawia prostą metodę analizy sygnałów wapniowych w roślinach, generowanych przez karmienie owadów pluskwiaków, takich jak mszyce. Arabidopsis thaliana przekształcony za pomocą biosensora wapnia GCaMP3 GFP pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym in vivo z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Rejestrowanie w czasie rzeczywistym sygnałów wapniowych Arabidopsis podczas żerowania owadów za pomocą biosensora fluorescencyjnego

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Poznaj szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym sygnałów wapniowych i glutaminianowych u Arabidopsis thaliana w odpowiedzi na uszkodzenia mechaniczne. Ta metoda pozwala badać dynamikę sygnalizacji systemicznej w roślinach.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Przeglądaj więcej filmów