Akumulacja i dystrybucja fluorescencyjnych mikrodrobin plastiku we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego

Akumulacja i dystrybucja fluorescencyjnych mikroplastików we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego. Wprowadzenie. Bioakumulacja mikrodrobin plastiku odgrywa kluczową rolę w ich toksycznym działaniu. Jednak podobnie jak w przypadku cząstek stałych, ich bioakumulacja różni się od wielu innych zanieczyszczeń.

Opisano tutaj wykonalną metodę wizualnego określania akumulacji i dystrybucji mikroplastiku w zarodkach lub larwach danio pręgowanego przy użyciu fluorescencyjnych mikroplastików. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z krajowym przewodnikiem Wytyczne dla zwierząt laboratoryjnych dotyczące etycznego przeglądu dobrostanu zwierząt. Po pierwsze, pobranie zarodków.

Dorosłe rybo pręgowane pochodzą z China Danio Zebra Resource Center. Ryby są trzymane w 20-litrowych szklanych zbiornikach z systemem wody wodociągowej z recyrkulacją węgla drzewnego w stałej temperaturze, a mianowicie 28 stopni Celsjusza, w fotoperiodzie 14 i 10 godzin, jasno: ciemno. Ryby są karmione dwa razy dziennie naupliami artemii.

Zaleca się, aby pokarm był podawany w maksymalnej ilości 3% masy ryb dziennie i powinien być spożywany za każdym razem w ciągu pięciu minut. Dobrze rozwinięte dorosłe danio pręgowane są przenoszone do zbiornika tarłowego w stosunku jeden samiec na dwie samice w noc poprzedzającą rozmnażanie. Następnego ranka ryby zaczynają składać ikrę po nadejściu cyklu świetlnego.

Jaja są zbierane za pomocą pipety Pasteura, kilkakrotnie płukane 10% roztworem Hanka, a następnie sprawdzane pod kątem zapłodnienia za pomocą mikroskopu. Zapłodnione jaja przechodzą okres rozszczepienia po około dwóch godzinach od zapłodnienia i można je wyraźnie zidentyfikować. Zapłodnione zarodki inkubuje się w 500-mililitrowej zlewce zawierającej 200 mililitrów 10% roztworu Hanka z 1% błękitem metylenowym do dezynfekcji w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Szybkość ładowania nie przekracza jednego zarodka w każdym 2-mililitrowym roztworze. Po drugie, przygotowanie zawiesin do mikroplastiku. Roztwór podstawowy zielonych, znakowanych fluorescencyjnie kulek polistyrenowych o średnicy nominalnej 500 nanometrów poddaje się sonikacji przez 10 minut.

Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10% roztworem Hanka, aby uzyskać pożądane roztwory ekspozycyjne, a mianowicie 0,1, 1 i 10 miligramów na litr. Roztwory ekspozycyjne mikroplastików są zawsze świeżo przygotowywane przed ekspozycją. Po trzecie, ekspozycja na mikroplastik.

Sześć nowo zapłodnionych zarodków jest losowo wybieranych, a następnie przenoszonych do każdej studzienki z sześciodołkową płytką zawierającą pięć mililitrów roztworów mikroplastiku o różnych stężeniach. Uwzględniono grupy kontrolne zawierające 10% roztwór Hanka. Do każdego zabiegu wykorzystuje się trzy dołki, z łącznie 18 zarodkami.

Zarodki są inkubowane w tym samym cyklu jasno-ciemnym i w tej samej temperaturze, co dorosłe osobniki, i obserwuje się je co 12 godzin. Zmarli są natychmiast usuwani. Roztwory mikroplastiku są odnawiane w 90% co 24 godziny.

W okresie ekspozycji ryby nie są karmione. Ogólnie rzecz biorąc, wylęganie się zarodka rozpoczyna się po 48 godzinach od zapłodnienia i kończy się około 72 godzin po zapłodnieniu. Po czwarte, ocena dystrybucji mikroplastiku.

Po 24-48-72-96 i 120 godzinach od zapłodnienia, zarodki i larwy, po jednym z każdej z trzech kontrprób, są losowo wybierane i płukane 10% roztworem Hanka. Zarodki i larwy są ułożone i przygotowane do obserwacji. Wcześniej larwy są przenoszone na szalkę Petriego i poddawane działaniu 0,016% trikainy w celu znieczulenia.

Ryby są obserwowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i obrazowane za pomocą oprogramowania do obrazowania. Intensywność fluorescencji u ryb jest dalej oznaczana ilościowo za pomocą ImageJ NIH. Reprezentatywne wyniki.

Wyniki pokazują, że mikrodrobiny plastiku mogą ulegać bioakumulacji w zarodkach i larwach danio pręgowanego w sposób zależny od stężenia. Przed wykluciem stwierdza się silną fluorescencję wokół zarodkowej kosmówki; Natomiast w larwach danio pręgowanego głównymi miejscami nagromadzenia mikroplastików są woreczek żółtkowy, osierdzie i przewód pokarmowy. Dyskusja. Wynik ten poszerzy naszą wiedzę na temat toksyczności mikroplastików dla ryb, a opisaną tutaj metodę można potencjalnie uogólnić w celu określenia akumulacji i dystrybucji innych rodzajów materiałów fluorescencyjnych we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego.

Ponieważ kosmówka będzie działać jako skuteczna bariera przeciwko cząstkom o dużych rozmiarach, może być potrzebny proces dechorionacji przed ekspozycją. Jednak zarodek z nienaruszoną kosmówką jest bardziej zalecany do oceny ekotoksyczności zanieczyszczeń, biorąc pod uwagę warunki narażenia w świecie rzeczywistym. Zachowanie mikrodrobin plastiku w roztworze ma również kluczowe znaczenie dla biodostępności.

Charakterystyki fizykochemiczne mikrodrobin plastiku należy śledzić w czasie narażenia.