Name: Akumulacja i dystrybucja fluorescencyjnych mikrodrobin plastiku we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji akumulacji mikroplastików we wczesnych stadiach rozwoju Danio rerio. Technika fluorescencyjna pozwala określić dystrybucję cząstek w zarodkach i larwach ryb.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (21777145, 22076170) oraz Program dla Naukowców Changjiang i Innowacyjnego Zespołu Badawczego na Uniwersytecie (IRT_17R97).

Dorosłe rybki pręgowane pochodzą z China Danio Pręgowany (Wuhan, Chiny). Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z krajowym przewodnikiem "Wytyczne dotyczące zwierząt laboratoryjnych dotyczące etycznego przeglądu dobrostanu zwierząt (GB/T35892-2018).
1. Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Utrzymuj ryby w szklanych zbiornikach o pojemności 20 l z systemem wody wodociągowej z recyrkulacją węgla drzewnego (pH 7,0 ± 0,2) w stałej temperaturze (28 ± 0,5 °C) w fotoperiodzie 14:10 h jasno: ciemno.</li>
	<li>Karm ryby dwa razy dziennie naupliami artemii. Zaleca się, aby karma była podawana w maksymalnej ilości 3% masy ryb dziennie i powinna być spożywana w ciągu 5 minut za każdym razem14.</li>
	<li>Dobrze rozwinięte dorosłe rybo pręgowane (o długości ciała 3-4 cm) przenieść do zbiornika tarłowego w stosunku jeden samiec na dwie samice w noc poprzedzającą rozmnażanie. 
	UWAGA: Następnego ranka ryby zaczynają składać ikrę po nadejściu cyklu świetlnego.</li>
	<li>Zbierz jajka za pomocą pipety Pasteura. Kilkakrotnie spłucz 10% roztworem Hanka, a następnie sprawdź pod kątem zapłodnienia pod mikroskopem. Zapłodnione jaja przechodzą okres rozszczepienia po około 2 godzinach od zapłodnienia (HPF) i można je łatwo zidentyfikować15.</li>
	<li>Inkubować zapłodnione zarodki w zlewce o pojemności 500 ml zawierającej 200 ml 10% roztworu Hanka z 1% błękitem metylenowym w celu dezynfekcji w temperaturze 28 °C. Nie należy przekraczać dawki nasycania 1 zarodek/2 ml roztworu. 
	UWAGA: 10% roztwór Hanka składa się ze 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mMMgSO4 i 4,2 mM NaHCO3.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesin mikroplastiku
<ol>
	<li>Sonikować roztwór podstawowy zielonych, znakowanych fluorescencyjnie kulek polistyrenowych (10 mg/ml) o średnicy nominalnej 500 nm (wzbudzenie/emisja: 460/500 nm) przez 10 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10% roztworem Hanka, aby uzyskać pożądane roztwory ekspozycyjne (0,1, 1 i 10 mg/l).</li>
	<li>Zawsze przygotowuj roztwory ekspozycyjne mikroplastiku przed ekspozycją. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność przy ocenie toksycznego działania mikrodrobin plastiku, ponieważ obecność konserwantów, takich jak azydek sodu, w komercyjnych preparatach cząstek, może być toksyczna dla różnych organizmów 16. W związku z tym dodatki te powinny zostać usunięte lub uwzględnione w kontrolach przed przeprowadzeniem eksperymentu toksyczności.</li>
</ol>
3. Ekspozycja na mikroplastik
<ol>
	<li>Losowo wybierz 6 nowo zapłodnionych zarodków (4 hpf), a następnie przenieś do każdej studzienki 6-dołkowej płytki zawierającej 5 ml roztworów mikroplastiku o różnych stężeniach. Uwzględnij grupy kontrolne zawierające 10% roztwór Hanka.
	<ol>
		<li>Do każdego zabiegu należy użyć trzech studzienek (w sumie 18 zarodków).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować zarodki w tym samym cyklu światła: ciemności i temperatury, co dorosłe osobniki (patrz 1.2) i obserwować co 12 godzin. Natychmiast usuń zmarłych.</li>
	<li>Roztwory mikroplastiku należy odnawiać w 90% co 24 godziny. W okresie ekspozycji ryby nie są karmione. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wykluwanie się zarodka rozpoczyna się przy 48 hpf i kończy się przy około 72 hpf.</li>
</ol>
4. Ocena dystrybucji mikroplastiku
<ol>
	<li>Po 24, 48, 72, 96 i 120 godzinach od zapłodnienia losowo wybierz zarodki/larwy (po jednym z każdej z trzech kontrprób) i przepłucz 10% roztworem Hanka.</li>
	<li>Przenieś larwy na szalkę Petriego i poddaj działaniu 0,016% trikainy w celu znieczulenia.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy trikainy: 4 mg proszku tricainy rozpuszcza się w 100 ml podwójnie destylowanej wody i dostosować pH do 7,0 za pomocą Tris-HCl (pH 9,0). Roztwór podstawowy należy przechowywać w zamrażarce.</li>
		<li>Przygotuj roztwór roboczy. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do pożądanego stężenia (0,016%) 10% roztworem Hanka w temperaturze pokojowej14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ułóż zarodki/larwy i przygotuj się do obserwacji.</li>
	<li>Obserwuj ryby za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i obrazu za pomocą oprogramowania do obrazowania.</li>
	<li>Określ ilościowo intensywność fluorescencji u ryb za pomocą ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+Scientific+Perspective+on+Microplastics+in+Nature+and+Society%22">A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society</a>. , SAPEA. Berlin. (2019).</li>
<li>Plastics Europe. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plastics-the+facts+2019%22">Plastics-the facts 2019</a>. , Plastics Europe. Brussels. (2019).</li>
<li>Andrady, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastics+in+the+marine+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Pollution+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Microplastics in the marine environment.</a> Marine Pollution Bulletin. 62, 1596-1605 (2011).</li>
<li>Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proceedings+of+the+International+Research+Workshop+on+the+Occurrence%2C+Effects+and+Fate+of+Microplastic+Marine+Debris%5BTitle%5D)+AND+%22National+Oceanic+and+Atmospheric+Administration+Technical+Memorandum%22%5BJournal%5D)">Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris.</a> National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).</li>
<li>Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastic+in+aquatic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microplastic in aquatic ecosystems.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56, 1720-1739 (2017).</li>
<li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollutant+toxicology+with+respect+to+microalgae+and+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria.</a> Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).</li>
<li>Huang, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+microplastics+impairs+digestive+performance%2C+stimulates+immune+response+and+induces+microbiota+dysbiosis+in+the+gut+of+juvenile+guppy+%28Poecilia+reticulata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata).</a> Science of the Total Environment. 733, 138929(2020).</li>
<li>Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plastic+brain%3A+neurotoxicity+of+micro-+and+nanoplastics%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics.</a> Particle and Fibre Toxicology. 17, 24(2020).</li>
<li>Jakubowska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+exposure+to+microplastics+of+different+polymer+types+on+early+life+stages+of+sea+trout+Salmo+trutta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta.</a> Science of the Total Environment. 740, 139922(2020).</li>
<li>Qiang, L., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+polystyrene+microplastics+impairs+gonads+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio).</a> Chemosphere. 263, 128161(2021).</li>
<li>Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants+and+molecular+damage+in+Nile+Tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29+after+exposure+to+microplastics%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics.</a> Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).</li>
<li>Burns, E. E., Boxall, A. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastics+in+the+aquatic+environment%3A+Evidence+for+or+against+adverse+impacts+and+major+knowledge+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).</li>
<li>Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastics+in+aquatic+environments%3A+Toxicity+to+trigger+ecological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences.</a> Environmental Pollution. 261, 114089(2020).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+reio%29.+4th+ed%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+assessments+of+micro-+and+nanoplastics+can+be+confounded+by+preservatives+in+commercial+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations.</a> Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).</li>
<li>Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+survey+on+the+use+and+welfare+of+zebrafish+Danio+rerio+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Biology%22%5BJournal%5D)">International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research.</a> Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).</li>
<li>Pitt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+tissue+distribution%2C+and+toxicity+of+polystyrene+nanoparticles+in+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).</li>
<li>Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9, 1608-1618 (2013).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów lub interesów finansowych.

Zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych, takimi jak dyrektywa UE 2010/63/UE, zezwolenie na stosowanie zasad etyki zwierząt nie jest obowiązkowe w przypadku eksperymentu z wczesnymi etapami życia danio pręgowanego do momentu, gdy staną się one zdolne do samodzielnego żywienia (5 dni po zapłodnieniu)17. Dla optymalizacji wykorzystania danio pręgowanego ważne są jednak najlepsze praktyki w zakresie dobrostanu, a także na przykład humanitarne metody zniecz...

Od momentu pierwszej syntezy w 1900 roku, tworzywa sztuczne są szeroko stosowane w różnych dziedzinach, co spowodowało szybki wzrost globalnej produkcji1. W 2018 roku na całym świecie wyprodukowano około 360 milionów ton tworzyw sztucznych2. Tworzywa sztuczne w środowisku naturalnym ulegają degradacji do drobnych cząstek w wyniku procesów chemicznych, fizycznych lub biologicznych3. Ogólnie rzecz biorąc, drobne cząstki plastiku o wielkości <5 mm są definiowane jako mikroplastiki4. Mikroplastik jest również projektowany do konkretnych zastosowań, takich jak mikrogranulki z produktów kosmetycznych5. Jako niemal trwałe zanieczyszczenia, mikroplastiki gromadzą się w środowisku i przyciągają coraz większą uwagę naukowców, decydentów i opinii publicznej1,6. Wcześniejsze badania udokumentowały, że mikroplastiki mogą powodować niekorzystne skutki u ryb, takie jak uszkodzenie przewodu pokarmowego7, neurotoksyczność8, zaburzenia endokrynologiczne9, stres oksydacyjny10 i uszkodzenia DNA11. Jednak do tej pory toksyczność mikroplastiku nie została w pełni ujawniona12,13.
Zarodki zebry dają wiele korzyści eksperymentalnych, w tym małe rozmiary, zewnętrzne zapłodnienie, przezroczystość optyczną i duże lęgi, i są uważane za idealny organizm modelowy do badania in vivo wpływu zanieczyszczeń na ryby we wczesnych stadiach życia. Ponadto, tylko ograniczone ilości substancji badanych są potrzebne do oceny reakcji biologicznych. W tym przypadku zarodki danio pręgowanego są wystawione na działanie różnych stężeń mikrodrobin plastiku (0,1, 1, 10 mg/l) przez 5 dni, a także oceniana jest bioakumulacja i dystrybucja mikrodrobin plastiku w zarodkach/larwach danio pręgowanego. Wynik ten poszerzy naszą wiedzę na temat toksyczności mikroplastików dla ryb, a opisaną tutaj metodę można potencjalnie uogólnić w celu określenia akumulacji i dystrybucji innych rodzajów materiałów fluorescencyjnych we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon, Japonia</td><td>Eclipse Ti-S Zielony</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencyjnie znakowane kulki polistyrenowe</td><td>Phosphorex, USA</td><td>2103A</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

akumulacja i dystrybucja fluorescencyjnych mikrodrobin plastiku we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego

Accumulation and Distribution of Fluorescent Microplastics in the Early Life Stages of Zebrafish

Jako nowy rodzaj zanieczyszczenia środowiska, mikroplastik jest powszechnie stosowany w środowisku wodnym i stanowi duże zagrożenie dla organizmów wodnych. Bioakumulacja mikrodrobin plastiku odgrywa kluczową rolę w ich toksycznym skutkach; Jednak jako cząstki stałe, ich bioakumulacja różni się od wielu innych zanieczyszczeń. Opisano tutaj wykonalną metodę wizualnego określania akumulacji i dystrybucji mikroplastiku w zarodkach lub larwach danio pręgowanego przy użyciu fluorescencyjnych mikroplastików. Zarodki są poddawane działaniu różnych stężeń (0,1, 1 i 10 mg/l) fluorescencyjnych mikroplastików o średnicy 500 nm przez 120 godzin. Wyniki pokazują, że mikrodrobiny plastiku mogą ulegać bioakumulacji w zarodkach/larwach danio pręgowanego w sposób zależny od stężenia. Przed wykluciem stwierdza się silną fluorescencję wokół zarodkowej kosmówki; Natomiast w larwach danio pręgowanego głównymi miejscami nagromadzenia mikroplastików są woreczek żółtkowy, osierdzie i przewód pokarmowy. Wyniki wskazują na absorpcję i internalizację mikrodrobin plastiku u danio pręgowanego we wczesnych stadiach życia, co będzie stanowić podstawę do lepszego zrozumienia wpływu mikrodrobin plastiku na zwierzęta wodne.

Rozkład i akumulację fluorescencyjnych mikroplastików przedstawiono na Rysunku 1 oraz w Tabeli 1. W grupie nieeksponowanej (kontrolnej) nie obserwuje się widocznej fluorescencji. Jednakże, po ekspozycji na różne stężenia mikroplastików (24 hpf), stwierdza się akumulację fluorescencji wokół chorionu. Zielona fluorescencja jest również wykrywana w larwach, a poziomy fluorescencji zdają się wzrastać w sposób zależny od stężenia i czasu. Głównymi miejscami akumulacji mikroplasti...

Zarodki/larwy danio pręgowanego rozwijają się zewnętrznie i są optycznie przezroczyste. Bioakumulację mikrodrobin plastiku u ryb we wczesnych stadiach życia można łatwo ocenić za pomocą znakowanych fluorescencyjnie mikrogranulek.

Akumulacja i dystrybucja fluorescencyjnych mikrodrobin plastiku we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego

As a new type of environmental pollutant, microplastic has been widely found in the aquatic environment and poses a high threat to aquatic organisms. The ...

Akumulacja i dystrybucja fluorescencyjnych mikroplastików we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego. Wprowadzenie. Bioakumulacja mikrodrobin plastiku odgrywa kluczową rolę w ich toksycznym działaniu. Jednak podobnie jak w przypadku cząstek stałych, ich bioakumulacja różni się od wielu innych zanieczyszczeń.Opisano tutaj wykonalną metodę wizualnego określania akumulacji i dystrybucji mikroplastiku w zarodkach lub larwach danio pręgowanego przy użyciu fluorescencyjnych mikroplastików. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z krajowym przewodnikiem Wytyczne dla zwierząt laboratoryjnych dotyczące etycznego przeglądu dobrostanu zwierząt. Po pierwsze, pobranie zarodków.Dorosłe rybo pręgowane pochodzą z China Danio Zebra Resource Center. Ryby są trzymane w 20-litrowych szklanych zbiornikach z systemem wody wodociągowej z recyrkulacją węgla drzewnego w stałej temperaturze, a mianowicie 28 stopni Celsjusza, w fotoperiodzie 14 i 10 godzin, jasno: ciemno. Ryby są karmione dwa razy dziennie naupliami artemii.Zaleca się, aby pokarm był podawany w maksymalnej ilości 3% masy ryb dziennie i powinien być spożywany za każdym razem w ciągu pięciu minut. Dobrze rozwinięte dorosłe danio pręgowane są przenoszone do zbiornika tarłowego w stosunku jeden samiec na dwie samice w noc poprzedzającą rozmnażanie. Następnego ranka ryby zaczynają składać ikrę po nadejściu cyklu świetlnego.Jaja są zbierane za pomocą pipety Pasteura, kilkakrotnie płukane 10% roztworem Hanka, a następnie sprawdzane pod kątem zapłodnienia za pomocą mikroskopu. Zapłodnione jaja przechodzą okres rozszczepienia po około dwóch godzinach od zapłodnienia i można je wyraźnie zidentyfikować. Zapłodnione zarodki inkubuje się w 500-mililitrowej zlewce zawierającej 200 mililitrów 10% roztworu Hanka z 1% błękitem metylenowym do dezynfekcji w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Szybkość ładowania nie przekracza jednego zarodka w każdym 2-mililitrowym roztworze. Po drugie, przygotowanie zawiesin do mikroplastiku. Roztwór podstawowy zielonych, znakowanych fluorescencyjnie kulek polistyrenowych o średnicy nominalnej 500 nanometrów poddaje się sonikacji przez 10 minut.Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10% roztworem Hanka, aby uzyskać pożądane roztwory ekspozycyjne, a mianowicie 0,1, 1 i 10 miligramów na litr. Roztwory ekspozycyjne mikroplastików są zawsze świeżo przygotowywane przed ekspozycją. Po trzecie, ekspozycja na mikroplastik.Sześć nowo zapłodnionych zarodków jest losowo wybieranych, a następnie przenoszonych do każdej studzienki z sześciodołkową płytką zawierającą pięć mililitrów roztworów mikroplastiku o różnych stężeniach. Uwzględniono grupy kontrolne zawierające 10% roztwór Hanka. Do każdego zabiegu wykorzystuje się trzy dołki, z łącznie 18 zarodkami.Zarodki są inkubowane w tym samym cyklu jasno-ciemnym i w tej samej temperaturze, co dorosłe osobniki, i obserwuje się je co 12 godzin. Zmarli są natychmiast usuwani. Roztwory mikroplastiku są odnawiane w 90% co 24 godziny.W okresie ekspozycji ryby nie są karmione. Ogólnie rzecz biorąc, wylęganie się zarodka rozpoczyna się po 48 godzinach od zapłodnienia i kończy się około 72 godzin po zapłodnieniu. Po czwarte, ocena dystrybucji mikroplastiku.Po 24-48-72-96 i 120 godzinach od zapłodnienia, zarodki i larwy, po jednym z każdej z trzech kontrprób, są losowo wybierane i płukane 10% roztworem Hanka. Zarodki i larwy są ułożone i przygotowane do obserwacji. Wcześniej larwy są przenoszone na szalkę Petriego i poddawane działaniu 0,016% trikainy w celu znieczulenia.Ryby są obserwowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i obrazowane za pomocą oprogramowania do obrazowania. Intensywność fluorescencji u ryb jest dalej oznaczana ilościowo za pomocą ImageJ NIH. Reprezentatywne wyniki.Wyniki pokazują, że mikrodrobiny plastiku mogą ulegać bioakumulacji w zarodkach i larwach danio pręgowanego w sposób zależny od stężenia. Przed wykluciem stwierdza się silną fluorescencję wokół zarodkowej kosmówki; Natomiast w larwach danio pręgowanego głównymi miejscami nagromadzenia mikroplastików są woreczek żółtkowy, osierdzie i przewód pokarmowy. Dyskusja. Wynik ten poszerzy naszą wiedzę na temat toksyczności mikroplastików dla ryb, a opisaną tutaj metodę można potencjalnie uogólnić w celu określenia akumulacji i dystrybucji innych rodzajów materiałów fluorescencyjnych we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego.Ponieważ kosmówka będzie działać jako skuteczna bariera przeciwko cząstkom o dużych rozmiarach, może być potrzebny proces dechorionacji przed ekspozycją. Jednak zarodek z nienaruszoną kosmówką jest bardziej zalecany do oceny ekotoksyczności zanieczyszczeń, biorąc pod uwagę warunki narażenia w świecie rzeczywistym. Zachowanie mikrodrobin plastiku w roztworze ma również kluczowe znaczenie dla biodostępności.Charakterystyki fizykochemiczne mikrodrobin plastiku należy śledzić w czasie narażenia.

accumulation-distribution-fluorescent-microplastics-early-life-stages

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Przedstawiamy nowatorską metodę mikrozgavage u larw danio pręgowanego, wykorzystującą standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię. Wykazujemy, że mikrozgavage jest bezpieczną i wydajną techniką, przydatną do dostarczania kontrolowanych ilości różnorodnych materiałów bezpośrednio do światła jelita larw danio pręgowanego.

Mikrogaważ larw danio pręgowanego

Źródło: Zhang, X., et al. Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne zarodków danio pręgowanego, którym wstrzyknięto Staphylococcus aureus, umożliwiając ilościowe określenie progresji infekcji i rozmieszczenia bakterii w celu oceny wpływu mikrosfer biomateriału na interakcje gospodarz-patogen in vivo.

 Obrazowanie fluorescencyjne infekcji bakteryjnej związanej z biomateriałem w zarodkach danio pręgowanego

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest popularnym narzędziem do modelowania przewlekłej choroby nerek (PChN). Jednak ich niewielkie rozmiary uniemożliwiają ocenę funkcji nerek tradycyjnymi metodami. Opisujemy fluorescencyjny test usuwania nerekbarwnika 1, który umożliwia analizę ilościową funkcji nerek danio pręgowanego w PChN.

Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Celem tego protokołu jest zmierzenie czasu przejścia fluorescencyjnie znakowanego pokarmu przez jelita larw danio pręgowanego w sposób wysokoprzepustowy.

Wysokoprzepustowy pomiar czasu pasażu jelitowego przy użyciu larw danio pręgowanego

Obecny jest tutaj szczegółowy protokół użycia zarodków danio pręgowanego Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych. Protokół obejmuje rozmnażanie ryb i leczenie zarodków, a także kładzie nacisk na wykrywanie, dokumentowanie i ocenę sygnałów fluorescencyjnych indukowanych przez związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC).

Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu modelu larw danio pręgowanego, w tym procesu ekspozycji i testów wskaźników neurobehawioralnych.

Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj metodę wizualizacji akumulacji mikroplastików we wczesnych stadiach rozwoju Danio rerio. Technika fluorescencyjna pozwala określić dystrybucję cząstek w zarodkach i larwach ryb.

Akumulacja i dystrybucja fluorescencyjnych mikrodrobin plastiku we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów