Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia metodę oddzielania od siebie czterech przedziałów komórkowych, cytoplazmy, jądra, mitochondriów i błony. Nie tylko to, ale jest to skalowalna, powtarzalna procedura, która daje wiarygodne wyniki. Główną zaletą tej techniki jest oddzielenie czterech komór komórkowych przy minimalnym użyciu detergentów, co pozwala na znacznie bardziej powtarzalną i niezawodną procedurę frakcjonowania.

W celu izolacji białka cytozolowego hoduj komórki U937 w RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenkiem węgla do końcowej sumy sześć na 10 do ósmych komórek. Odwirować kulturę i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS o temperaturze pokojowej do końcowego stężenia czterech na 10 do szóstych komórek na mililitr, delikatnie pipetując w celu rozbicia grudek. Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić osad w lodowatym buforze do lizy A w końcowym stężeniu dwa na 10 do siódmych komórek na mililitr.

Dodaj 7,5 mililitra komórek do stożkowej rurki na lodzie w celu ekstrakcji białka jądrowego i zdegranuluj pozostałe komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w cytoplazmatycznym buforze izolacyjnym o końcowym stężeniu dwa na 10 do siódmych komórek na mililitr, delikatnie pipetując w celu rozbicia grudek, a następnie inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z obrotem koniec nad końcem. Pod koniec inkubacji odwirować zawiesinę komórkową i przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej.

Odwirować supernatant w celu osadzenia resztek komórkowych. Po odwirowaniu przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej i powtarzać sekwencję wirowania, aż nie będzie można zaobserwować osadu. Gdy próbka jest wolna od zanieczyszczeń, supernatant zawierający frakcję cytozolową należy przechowywać przez okres do jednego miesiąca w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie ponownie zawiesić przechowywaną osadkę komórkową w buforze do lizy A do końcowego stężenia cztery na 10 do szóstych komórek na mililitr. W celu homogenizacji komórek odwirować zawiesinę komórek i wyrzucić supernatant w celu usunięcia nadmiaru digitoniny i zanieczyszczeń skurczowych. Zawiesić osad w lodowatym buforze homogenizacyjnym o końcowym stężeniu czterech na 10 do szóstych komórek na mililitr na 30-minutową inkubację na lodzie.

W międzyczasie, w przypadku lizy mechanicznej na bazie kulek, dodaj 30 gramów wstępnie umytych kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 3,2 milimetra do 15 mililitrów buforu do lizy B w 50-mililitrowej tubie z listwą na lodzie do schłodzenia. Pod koniec inkubacji zastąpić bufor w probówce z rurką z rurką zawieszoną komórek i mieszać komórki przez pięć minut z prędkością osiem. Po lizie przenieść homogenat do czystej probówki.

Odwirować homogenat, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki. Aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia z próbki, należy odwirować homogenat trzy razy, jak wskazano, przenosząc supernatant do nowej probówki po każdym odwirowaniu. Po ostatnim odwirowaniu, w celu wyizolowania surowej frakcji mitochondrialnej, przenieś supernatant do nowej probówki w celu odwirowania.

Po odwirowaniu przenieść supernatant do nowej probówki i umieścić surowy osad zawierający frakcję mitochondrialną na lodzie. Aby wyizolować frakcję membranową, należy odwirować zebrany supernatant, a po odrzuceniu supernatantu umieścić surowy osad zawierający frakcję membranową na lodzie. W celu oczyszczenia gradientu gęstości izopiknowej należy ponownie zawiesić surowe granulki frakcji mitochondrialnej i membranowej w 200 mikrolitrach buforu do lizy B i 1,8 mililitra jodiksanolu.

Aby utworzyć nieciągły gradient jodiksanolu dla każdej próbki, najpierw dodaj jeden mililitr 15% jodiksanolu na dno jednej ośmiomililitrowej, cienkościennej probówki ultrawirówki o otwartych ściankach na próbkę. Następnie kolejno ułóż jeden mililitr 20% jodiksanolu, jeden mililitr 25% jodiksanolu, jeden mililitr 30% jodiksanolu i jeden mililitr 35% jodiksanolu poniżej warstwy 15% jodiksanolu w każdej probówce. Dodaj dwa mililitry surowej zawiesiny granulek mitochondrialnych pod dolną warstwą jednego gradientu i dwa mililitry surowej zawiesiny granulek membranowych pod dolną warstwą drugiego gradientu.

Ostrożnie ułóż jeden mililitr 10% jodiksanolu na wierzchu każdego gradientu i zrównoważ probówki w odległości 10 mikrogramów od siebie przez dodanie 10% jodu, jeśli to konieczne, przed oczyszczeniem frakcji mitochondrialnej i błonowej przez wirowanie w gradionym spadku gęstości. Pod koniec rozdzielania należy użyć igły, aby przekłuć bok cienkościennych probówek, aby zebrać widoczne pasma z każdej próbki. W celu izolacji białek jądrowych odwirować 7,5 mililitra podwielokrotności komórek zawieszonych w buforze do lizy A i ponownie zawiesić osad w 800 mikrolitrach lodowatego buforu do rozpuszczania komórek z pipetowaniem i wirowaniem.

Inkubuj zawiesinę na lodzie przez 30 minut, aby rozerwać błony plazmy i organelli, jednocześnie chroniąc białka jądrowe. Pod koniec inkubacji odwirować zawiesinę komórek i ponownie zawiesić osad, delikatnie pipetując 800 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy jądrowej uzupełnionego jedną jednostką na mikrolitr benzonazy. Inkubować mieszaninę na rotatorze koniec nad końcem w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby rozerwać błonę jądrową.

Po 30 minutach poddaj mieszaninę sonikacji trzy razy przez pięć sekund z mocą 20% z pięciosekundową przerwą między impulsami w celu ścinania kwasów nukleinowych. Po ostatniej sonikacji odwirować homogenat i zebrać supernatant jako frakcję jądrową bez naruszania osadu. Western blot każdej z frakcji po oczyszczeniu w gradiencie gęstości wykazuje lokalizację frakcji mitochondrialnej do warstw 25 i 30% jodiksanolu oraz lokalizację frakcji błonowej do warstw 10 i 15% joduksanolu.

Zachodnia analiza krwi potwierdza również, że każda wyizolowana próbka jest czysta i wolna od zanieczyszczeń białkami z innych części komórki. Ponadto analiza densytometryczna intensywności pasma każdej próbki potwierdza odtwarzalność i istotność statystyczną danych. Niewłaściwe wykonanie frakcjonowania może spowodować zanieczyszczenie krzyżowe składników komórkowych.

Na przykład wysokie stężenie histonu H3 we frakcji cytozolowej może być spowodowane niewłaściwym klarowaniem frakcji cytozolowej. Awaria podczas oczyszczania gęstości izopiknowej może spowodować zanieczyszczenie frakcji membranowej. Przydatne może być przeprowadzenie testu ilościowego białka przed zachodnią analizą krwi w celu potwierdzenia, że frakcje rzeczywiście zawierają białko, aby umożliwić ładowanie żelem w oparciu o ilość białka i potwierdzić, że procedura została prawidłowo wykonana.

Bardzo ważne jest, aby frakcja cytoplazmatyczna nie zawierała osadu. Western Bits lub ELISA mogą być wykonywane zgodnie z tą procedurą, aby umożliwić analizę subkomórkowej lokalizacji różnych białek w określonych warunkach. Technika ta pozwoliła nam przeanalizować transport różnych czynników śmierci komórek w warunkach hiperglikemii.

Pomogło nam to rzucić światło na mechanizm hiperglikemicznego przejścia od apoptozy do martwicy.