Barwienie całego wierzchu, wizualizacja i analiza grzybokształtnych, obwodowych i podniebienia kubków smakowych

Ten całościowy proces preparacji i analizy zapewnia nowatorskie podejście do analizy pełnej morfologii poszczególnych boborów nerwowych smakowych, przekształcania liczby typów komórek i fizycznych relacji między komórkami. Pobranie całego nabłonka językowego pozwala nam zmierzyć bezwzględną liczbę komórek i objętość unerwienia w obrębie całego kubka smakowego. Takie podejście jest dokładniejsze niż oszacowania struktury komórki na podstawie próbkowania z sekcji, co zmniejsza zmienność techniczną.

Jest to również pierwsza metoda zapewniająca szczegółową analizę komórek kubków smakowych w odniesieniu do ich unerwienia. Metoda ta może usprawnić badania nad potencjalnymi obwodami w kubkach smakowych, a także nad procesami chorobowymi i chemioterapią, które zakłócają normalne funkcje smaku. W większości tych przypadków nie jest jasne, która struktura lub relacja jest zaburzona, więc utrzymanie wszystkich tych czynników w stanie nienaruszonym pozwala na przeprowadzenie wszystkich analiz w ramach jednego preparatu.

Najczęstszym błędem jest próba uniknięcia uszkodzenia nabłonka poprzez niepreparowanie wystarczająco blisko spodu nabłonka. Konieczne jest usunięcie jak największej ilości tkanki znajdującej się pod spodem przed zamrożeniem tkanki w formie tkankowej. Ważne jest również, aby upewnić się, że nabłonek leży płasko na dnie formy tkankowej.

Rozpocznij od rozmrożenia i wypłukania języka w 0,1-molowym buforze fosforanowym. Następnie umieść 1/2 przedniego języka zawierającego brodawki grzybowe na szkiełku podstawowym pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj kleszczy z końcami i nożyczek preparacyjnych, aby usunąć mięsień i utrzymać tkankę otwartą, gdy nabłonek językowy jest zakrzywiony, zapewniając płaską orientację tkanki, utrzymując ostrza gruboziarnistych nożyczek preparacyjnych równolegle do nabłonka.

Wyrzuć brzuszny, niezrogowaciały nabłonek języka, ponieważ nie zawiera on kubków smakowych. Następnie użyj cienkich nożyczek preparacyjnych, aby dokładniej wypreparować spód zrogowaciałego nabłonka. Użyj kleszczyków z końcami, aby umieścić kawałek nabłonka w formie tkankowej i upewnij się, że leży płasko.

Następnie dodaj kroplę związku o optymalnej temperaturze cięcia lub OCT do tkanki. Umieść formę tkankową na wcześniej schłodzonej metalowej podstawie pod lunetą sekcyjną, a następnie kontynuuj lekkie stukanie w tkankę kleszczami, aż OCT zamarznie, upewniając się, że tkanka zamarznie tak płasko, jak to możliwe. Po zamrożeniu OCT szybko dodaj dodatkowe OCT i umieść formę w zlewce ze schłodzonym 2-metylobutanem do zamrożenia.

Zamontuj formę OCT na kriosacie i pokrój ją na sekcje o grubości 20 mikronów. Zbierz każdy fragment i obejrzyj go pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić jego bliskość do podstawy nabłonka. Po ogoleniu tkanki od spodu nabłonka należy rozmrozić nabłonek i przepłukać go dwukrotnie w 0,1 molowym PB na shakerze.

Przetnij podniebienie twarde przed połączeniem podniebienia miękkiego i twardego, a następnie oddziel podniebienie miękkie od tkanki leżącej pod spodem, upewniając się, że wszelkie pozostałe fragmenty kości zostały odcięte i usuwając dodatkowe mięśnie i tkankę łączną. Przytrzymaj podniebienie tępo zakończonymi kleszczami i usuń pozostałe gruczoły i usuń tkankę łączną, delikatnie zeskrobując je żyletką. Całe kubki smakowe i całe unerwienie kubków smakowych u myszy Phox2b-Cre TdTomato oznaczono poprzez zabarwienie nabłonka językowego przeciwciałami przeciwko DsRed i keratynie ósmej.

Objętość kubków smakowych została zmierzona i nie wykazała korelacji między objętością kubków smakowych a objętością unerwienia ani w obszarach pomiaru grzybotwórczego, ani obwodowego. Podanie małej dawki tamoksyfenu myszom TrkB CreER TdTomato powoduje rekombinację genów i znakowanie niewielkiej liczby neuronów. Pokazano tutaj całą filiżankę smakową poplamioną markerami komórkowymi transdukującymi smak, anhydrazą węglanową cztery i fosfolipazą C beta 2.

Ten kubek smakowy ma dwie oznaczone altany końcowe, które są pokazane z kubkiem smakowym usuniętym po zrekonstruowaniu włókien. Użycie oprogramowania do obrazowania opartego na pikselach komórkowych w celu określenia najbliższej bliskości między włóknami nerwowymi a komórkami transdukującymi smak ujawniło, że spośród 19 komórek transdukujących smak, niebieska altana końcowa znajdowała się w odległości 200 nanometrów od jasnoniebieskiej anhydrazy węglanowej cztery plus komórka. Końcowa altana, związana z zielonym śladem, jest pokazana w kolorze magenta i znajduje się w odległości 200 nanometrów zarówno od jasnoniebieskich, jak i ciemnoniebieskich komórek anhydrazy węglanowej cztery plus.

Barwienie pełnoziarnistą keratyną ósemką i 5-etynylo-2'deoksyurydyną lub EdU grzybowych kubków smakowych ujawniło, że komórki znakowane EdU były obecne zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz kubków smakowych. Purpurowe i fioletowe jądra obserwuje się poza keratyną osiem plus granica kubka smakowego. Żółte, turkusowe i niebieskie komórki znajdowały się w kubku smakowym.

Podczas prób stosowania tego protokołu kluczowe znaczenie mają etapy rozwarstwiania tkanek i zamrażania. Te metody preparacji tkanek można zastosować poprzez barwienie różnych komórek i struktur w celu przeanalizowania relacji zarówno w kubku smakowym, jak i na zewnątrz kubka smakowego, ale w obrębie brodawki. Jest to pierwsza analiza całych altanek smakowych w kubku smakowym, a także ich związków z komórkami transdukującymi smak.

Konserwacja i barwienie kilku z tych pierwiastków w jednym preparacie zarówno rozszerza możliwości analizy, jak i udoskonala możliwe pomiary.