Name: Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Naucz się mierzyć endogenne uwalnianie monoamin w ostrych wycinkach mózgu szczura przy użyciu płytki 48-well i HPLC-ECD. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów uwalniania neuroprzekaźników w warunkach farmakologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Fondecyt Initiation Fund N 11191049 dla J.A.P. oraz granty NIH DA038598 dla G.E.T.

Wszystkie eksperymenty, w tym postępowanie ze zwierzętami i pobieranie tkanek, były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnych Komitetów ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) University of Florida oraz City College of New York, zgodnie z zatwierdzonymi protokołami 201508873 (UF) i 1071 (CCNY). W kwestii odczynników i buforów należy zapoznać się z plikiem uzupełniającym.
1. Przygotowanie świeżych skrawków mózgu szczura
UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano dorosłe samce szczurów (250-350 g). Układ ten jest jednak funkcjonalny dla różnych etapów rozwojowych, samic szczurów oraz innych gatunków. W przypadku użycia mniejszych zwierząt, np. myszy, eksperymentator może dostosować i zoptymalizować protokół, stosując inną liczbę skrawków mózgu lub wycinków (punches) na warunek. Bufor do sekcji będzie określany jako Bufor 1; bufor do wypływu będzie określany jako Bufor 2.
<ol>
	<li>Przygotować Bufor 1 zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym (Supplementary File). Nasycić Bufor 1 tlenem, przepuszczając przez niego mieszaninę 95%/5% (O2/CO2) przez 20 min w temperaturze 0°C. Odlać 50 mL Buforu 1 i schłodzić na lodzie w małym zlewce lub czarszce Petriego. Bufor ten służy do przechowywania świeżo pobranego całego mózgu.</li>
	<li>Zanurzyć jedną lub dwie dorosłe szczury (250-350 g) w 1%-2% izofluranie, zdekapitować je za pomocą gilotyny i szybko usunąć mózgi. Natychmiast umieścić mózg w lodowatym, natlenionym Buforze 1 w pojemniku z kroku 1.1. 
	UWAGA: Należy zapewnić bezpieczne użytkowanie izofluranu i gilotyny. Otwierać izofluran pod wyciągiem 화학icznym.</li>
	<li>Za pomocą wibratomu lub compresstomu wykonać koronalne przekroje mózgu o grubości 300 µm z każdego obszaru zainteresowania (Rysunek 1). Podczas wykonywania przekrojów musi być obecny napowietrzany Bufor 1. Używając stalowej szpatułki, ostrożnie i niezwłocznie przenieść plastry mózgu do nowej czarszki Petriego wypełnionej lodowatym, natlenionym Buforem 1 (Rysunek 2).</li>
	<li>Dalszą dyssekcję plastrów mózgu (np. wycinanie fragmentów/punchy) przeprowadzić, ostrożnie przenosząc plastry na szkiełka przedmiotowe (Rysunek 1G), korzystając z atlasu mózgu szczura57. Na przykład: zidentyfikować prążkowie grzbietowe na podstawie jego ciemnej, prążkowanej struktury oraz hipokamp na podstawie jego bliskości do kory i charakterystycznej struktury spiralnej. Półkule prawa i lewa mogą zostać rozdzielone, aby służyć odpowiednio jako plastry kontrolne i eksperymentalne (Rysunki 2G - H). W tym przypadku prążkowie grzbietowe zostało dalej wycięte w formie fragmentów o średnicy 2 mm (Rysunek 1G).</li>
	<li>Używając plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką, przenieść plastry lub wycinki mózgu do małych pojemników zanurzonych w natlenionym, lodowatym Buforze 1 z przepływem tlenu. Pojemniki te mogą stanowić stalowa siatka lub małe czarszki Petriego wypełnione buforem (Rysunek 1H).</li>
</ol>
2. Uwalnianie endogennych monoamin ex vivo z przekrojów lub wycinków mózgu
UWAGA: Urządzenie wykorzystane w tej sekcji składa się z płytki 48-dołkowej oraz uchwytu do tkanek wykonanego z sześciu jednostek filtracyjnych do mikrocentryfugi (bez wkładów filtrujących) podłączonych do linii z karbogenem (Rycina 2). Aby wykonać uchwyt, należy użyć wytrzymałego plastikowego pręta (np. z zeskrobaka do komórek) i przykleić do niego jednostki filtracyjne do mikrocentryfugi (bez wkładów filtrujących) za pomocą superglue. Pozostawić do wyschnięcia na 1-2 dni. Czas wymagany dla eksperymentu uwalniania endogennych monoamin oraz stężenia amfetaminy, fluoksetyny i kokainy oparto na aktualnej literaturze oraz poprzednich protokołach13,20,58.
<ol>
	<li>Aktywacja tkanki
	<ol>
		<li>Przenieść tkankę mózgową z etapu 1.1.5 do każdej studzienki komory odpływu i pozostawić do regeneracji na 30-50 min w temperaturze 37 °C na podgrzewaczu do szkiełek w 0,5-1 mL napowietrzonego Buforu 2, przy stałym, łagodnym bąbelkowaniu (Rysunek 2B1).</li>
		<li>Podczas tej inkubacji rozcieńczyć leki do pożądanego stężenia dla danego eksperymentu. Wszystkie leki muszą być rozpuszczone w Buforze 2, a stężenia powinny być zgodne z aktualną literaturą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwsza inkubacja
	<ol>
		<li>Przenieść uchwyt z tkanką mózgową do studzienek zawierających 500 µL napowietrzonego Buforu 2 i inkubować przez 20 min w temperaturze 37 °C. Należy upewnić się, że przeniesiono minimalną ilość lub żadną ilość buforu, opukując uchwyt o krawędź studzienki, aż do usunięcia nadmiaru buforu z uchwytu.</li>
		<li>W eksperymentach z zastosowaniem czynników farmakologicznych, takich jak inhibitory transporterów monoamin, inkubować próbki tkanki z lekami rozcieńczonymi w napowietrzeniu Buforze 2 (np. 10 µM fluoksetyny, 40 µM kokainy; patrz Rysunek 2B2). Końcowa objętość w każdej studience powinna wynosić 500 µL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Druga inkubacja
	<ol>
		<li>Przenieść uchwyt z tkanką do nowego zestawu studzienek zawierających łącznie 500 µL Buforu 2 z pożądanym stężeniem każdego leku lub bez niego. Upewnić się, że nie pozostał nadmiar buforu. Każda studzieńka stanowi n = 1 dla warunków eksperymentalnych. Każdy warunek eksperymentalny wykonuje się w trzech powtórzeniach.</li>
		<li>Jedna studzieńka zawiera napowietrzony Bufor 2, kolejna 10-30 µM AMPH, a ostatnia studzieńka zawiera 10-30 µM AMPH oraz inhibitory transporterów monoamin. Każdy lek jest rozpuszczony w napowietrzonym Buforze 2.</li>
		<li>Inkubować tkankę przez 20 min w temperaturze 37 °C w 500 µL roztworu leku dla danego warunku. 
		UWAGA: Dodatkowe studzienki mogą zawierać napowietrzony Bufor 2 z wysokim stężeniem K+ z inhibitorami transporterów monoamin lub bez nich. Rozpuścić każdy lek w napowietrzonym Buforze 2 (500 µL).</li>
		<li>Podczas tej drugiej 20-minutowej inkubacji zebrać roztwór ze studzienek z pierwszej inkubacji z etapu 2.2.1 i przenieść do probówek do mikrocentryfugi zawierających 50 µL 1 N kwasu nadchlorowego lub kwasu fosforowego (w zależności od rodzaju HPLC, stężenie końcowe 0,1 N). Końcowa objętość próbki wyniesie 550 µL. Próbówki do mikrocentryfugi należy przechowywać na lodzie i oznaczyć jako nr 1.</li>
		<li>Po drugiej 20-minutowej inkubacji przenieść uchwyt z przekrojami lub wycinkami mózgu do pustej studzienki i utrzymać płytkę na lodzie. Przenieść nadsącz do probówek do mikrocentryfugi zawierających 50 µL 1 N kwasu nadchlorowego lub kwasu fosforowego. Końcowa objętość próbki wyniesie 550 µL. Próbówki do mikrocentryfugi należy przechowywać na lodzie i oznaczyć jako nr 2.</li>
		<li>Dodać 1 mL schłodzonego do temperatury lodowej Buforu 1 do każdej studzienki zawierającej tkankę. Zebrać całą tkankę za pomocą małej pęsety i przenieść do czystych probówek do mikrocentryfugi.</li>
		<li>Przechowywać probówki z tkanką mózgową w temperaturze -80 °C. Odrzucić 1 mL Buforu 1 (Rysunek 2B4).</li>
		<li>Przefiltrować roztwory uzyskane z każdej inkubacji przy użyciu filtrów do mikrocentryfugi (0,22 µm) przy 2 500 x g przez 2 min. Wykorzystać filtrat do oznaczenia zawartości monoamin za pomocą HPLC z detekcją elektrochemiczną (Rysunek 2B5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Żywotność tkanek
<ol>
	<li>Test MTT 
	​UWAGA: Istotnym problemem w tym układzie doświadczalnym jest żywotność tkanki, ponieważ tkanka może być wykorzystywana przez kilka godzin59. Do określenia żywotności tkanki po zakończeniu eksperymentu stosuje się test MTT60,61. Test ten opiera się na konwersji żółtej soli tetrazoliowej MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliu) w fioletowe kryształy formazanu przez żywe komórki o odpowiednim metabolizmie.
	<ol>
		<li>Po eksperymencie zachowaj oddzielną grupę próbek tkankowych i podziel je na dwie grupy.</li>
		<li>Inkubuj jedną grupę przez 20 min w 37 °C w Triton X-100 (1%) rozpuszczonym w Buforze 2 jako kontrolę. Traktowanie Triton X-100 prowadzi do śmierci komórek. Drugą grupę utrzymuj w Buforze 2, nie inkubując jej w Triton X-100 (kontrola żywotności tkanki).</li>
		<li>Do obu grup w natlenionym Buforze 2 dodaj MTT (roztwór zapasowy 5 mg/mL w PBS, pH 7.4) do stężenia końcowego 0.5 mg/mL.</li>
		<li>Inkubuj próbki tkankowe przez 20 min w 37 °C, przemyj PBS i przenieś do probówek do mikrocentryfugi zawierających 250 µL mieszaniny SDS (10%, w/v), DMF (25%, v/v) i wody w celu rozpuszczenia kryształów formazanu.</li>
		<li>Inkubuj próbki przez 24 h.</li>
		<li>Wiruj probówki przy 10,000 x g przez 10 min i zmierz absorbancję supernatantu (200 µL) przy 562 nm i 690 nm za pomocą czytnika mikroplatek. Żywotność tkanki oblicza się następująco: (A562-A690)/masa tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza monoamin metodą HPLC
<ol>
	<li>Ilościowo określ uwalnianie monoamin w każdej z warunków doświadczalnych przy użyciu HPLC-ECD zgodnie z poprzednimi protokołami13,44, stosując kolumnę w fazie odwróconej.
	<ol>
		<li>Przygotuj fazę ruchomą niezbędną do detekcji. Składa się ona z 100 mM kwasu fosforowego, 100 mM kwasu cytrynowego, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/L kwasu oktanosulfonowego oraz 8% v/v acetonitrylu (końcowe pH 6,0). Skład fazy ruchomej zależy od rodzaju zastosowanego urządzenia HPLC i kolumny.</li>
		<li>Ustaw potencjał detektora elektrochemicznego (elektroda z węgla szklistego 2 mm) na 0,46 V oraz ustaw szybkość przepływu na 0,05 mL/min.</li>
		<li>Wprowadź 5 µL każdej próbki, w tym standardów neurotransmiterów, do urządzenia HPLC w celu autowtrysku i detekcji. Ilość dodanej każdej próbki zależy od rodzaju użytego urządzenia HPLC.</li>
		<li>Po zakończeniu analizy przez HPLC, użyj odpowiedniego oprogramowania analitycznego HPLC do pozyskania i analizy danych chromatograficznych.</li>
		<li>Przeanalizuj zawartość monoamin, korzystając z krzywej wzorcowej dla każdej monoaminy (dopaminy: DA, norepinefryny: NE i serotoniny: 5-HT; Rysunek 2C). Na podstawie uzyskanych chromatogramów wyznacz pole pod krzywą (AUC) zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie lizatów tkankowych do oznaczania ilości białka
<ol>
	<li>Oznaczenie białka
	<ol>
		<li>Do każdej probówki do mikrocentryfugi zawierającej przekroje lub wycinki mózgu dodać lodowaty bufor lizujący z inhibitorami proteaz (0,1 g/1 mL) i homogenizować za pomocą homogenizatora tłuczkowego. Podczas homogenizacji probówki muszą znajdować się w lodzie, aby zapobiec degradacji białek.</li>
		<li>Homogenizaty tkanek inkubować przez 1 h w temperaturze 4 °C przy lekkim obrocie.</li>
		<li>Homogenizaty tkanek wirować z prędkością 16,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C i zebrać nadsącz.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie białka w nadsączach, stosując albuminę surowicy bydlęcej (BSA) jako wzorzec.</li>
		<li>Znormalizować zawartość monoamin w każdej próbce mózgu do całkowitej zawartości białka (µg) zmierzonej w 250 µL lizowanej tkanki mózgowej. Do obliczenia nmol monoaminy/g białka zastosować poniższy wzór. df = czynnik rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Wzór na oznaczanie ilości monoamin, schemat obliczeń dla analizy nmol na gram białka." src="/files/ftp_upload/62127/62127eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przeanalizuj uwalnianie monoamin (nmol/g), stosując jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test wielokrotnych porównań Sidaka dla analiz post-hoc.</li>
	<li>Przeanalizuj żywotność tkanek, stosując nieparzysty test t Studenta dla grup niezależnych (Kontrola vs. 1% Triton X-100).</li>
	<li>Dla wszystkich analiz statystycznych przyjmij poziom istotności alfa ≤ 0,05.</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Pomiary uwalniania monoamin są wykonywane od lat w wielu systemach, takich jak komórki heterologiczne, kultury neuronalne, synaptosomy mózgu, ostre wycinki mózgu ex vivo i całe zwierzęta 13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<...

Mnóstwo chorób neurologicznych i psychiatrycznych wiąże się z rozregulowaniem lub niedostatecznym utrzymaniem neuroprzekaźnika monoaminowego (dopaminy [DA], serotoniny [5-HT], noradrenaliny [NE]) homeostazy1,2,3. Do tych schorzeń należą między innymi: depresja1,2, schizofrenia2, anxiety2, addiction4, menopauza5,6,7, ból8 oraz choroba Parkinsona3. Na przykład kilka szczurzych modeli menopauzy wykazało, że rozregulowanie lub zmniejszenie monoamin w hipokampie, korze przedczołowej i prążkowiu może być związane zarówno z depresją, jak i pogorszeniem funkcji poznawczych, co obserwuje się u kobiet doświadczających menopauzy. Rozregulowanie monoamin w tych modelach zostało szeroko zbadane przy użyciu HPLC-ECD, chociaż badania nie rozróżniały między zmierzoną zawartością neuroprzekaźników a uwalnianiem neuroprzekaźników5,6,7. Monoaminy są klasycznie uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poprzez zależne od Ca2+ uwalnianie pęcherzykowe9 i są zawracane z powrotem przez odpowiedni system wychwytu zwrotnego błony komórkowej (transporter dopaminy, DAT; transporter serotoniny, SERT; transporter noradrenaliny, NET)10,11. Z drugiej strony, dane sugerują, że te transportery są w stanie uwalniać lub wypływać monoaminy, ponieważ wiadomo, że narkotyki, takie jak amfetamina (AMPH) i 3,4-metylenodioksymetamfetamina (MDMA), uwalniają odpowiednio DA i 5-HT za pośrednictwem swoich systemów transportowych12,13,14,15,16,17. W związku z tym właściwe mechanistyczne zrozumienie dynamiki uwalniania monoamin ma kluczowe znaczenie dla opracowania specyficznych i celowanych farmakoterapii.
Do badania uwalniania monoamin zastosowano szeroki zakres technik, takich jak Szybka Woltamperometria Cykliczna (FSCV)18, mikrodializy in vivo13, obrazowanie19, preinkubacja z radioznakowanymi monoaminami20, optogenetyka, a ostatnio genetycznie kodowane czujniki fluorescencyjne i fotometria21,22. FSCV i mikrodializa in vivo są podstawowymi technikami stosowanymi do badania uwalniania monoamin. FSCV jest używany do badania stymulowanego uwalniania egzocytotyki, przede wszystkim, DA w ostrych wycinkach mózgu i in vivo23. Ponieważ FSCV wykorzystuje elektrody do stymulowania lub wywoływania uwalniania, głównym źródłem uwalniania neuroprzekaźników jest zależne od Ca2+ uwalnianie pęcherzyków18,24,25,26,27,28,29,30,31. Mikrodializa in vivo w połączeniu z HPLC mierzy zmiany w poziomach neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych za pomocą sondy umieszczonej w obszarze zainteresowania mózgu13,32. Podobnie jak w przypadku FSCV, głównym ograniczeniem mikrodializy in vivo jest trudność w określeniu źródła uwalniania neuroprzekaźników: zależnego od Ca2+ uwalniania pęcherzykowego lub zależnego od transportera. Warto zauważyć, że obie metody pozwalają na bezpośredni pomiar uwalniania monoamin. Dzięki niedawnemu postępowi w optogenetyce, badania wykazały wykrywanie uwalniania 5-HT i DA w krótkim czasie z wyjątkową specyficznością typu komórki21,22. Jednak strategie te wymagają złożonych i kosztownych technik i sprzętu oraz pośrednio mierzą uwalnianie monoamin, w szczególności poprzez wiązanie monoamin z receptorami. Co więcej, znakowane radioizotopowo monoaminy są również wykorzystywane do badania dynamiki monoamin. Monoaminy znakowane radioizotopowo mogą być wstępnie załadowane do różnych systemów modelowych, takich jak komórki heterologiczne z nadekspresją każdego transportera monoamin20,33,34,35,36,37,38,39,40, primary neurons20, synaptosomes33,39,41,42, oraz acute brain slices43,44. Jednak radioaktywność stanowi potencjalną szkodę dla eksperymentatora, a anality znakowane trytem mogą nie odzwierciedlać wiernie endogennej dynamiki monoamin45,46. Systemy superfuzyjne w połączeniu z metodami detekcji off-line, takimi jak HPLC-ECD, pozwoliły na wykrycie monoamin z wielu źródeł tkankowych. W tym przypadku protokół ten zapewnia zoptymalizowaną i tanią, prostą i precyzyjną metodę wykorzystującą ostre wycinki mózgu do bezpośredniego pomiaru endogennego podstawowego i stymulowanego uwalniania monoamin.
Ostre wycinki mózgu pozwalają na testowanie hipotez mechanistycznych, przede wszystkim dlatego, że zachowują mikrośrodowisko anatomiczne in vivo i utrzymują nienaruszone synapsy47,48,49,50,51,52. W kilku badaniach ostre wycinki mózgu lub posiekana tkanka mózgowa były używane w połączeniu z techniką superfuzji przy użyciu KCl w celu stymulacji uwalniania za pośrednictwem Ca2+53,54,55,56. Systemy superfuzji odegrały kluczową rolę w pogłębieniu wiedzy na temat mechanizmów uwalniania neuroprzekaźników, w tym monoamin. Systemy te są jednak stosunkowo drogie, a liczba dostępnych komór do analizy tkanek waha się od 4 do 12. Dla porównania, przedstawiona tutaj metoda jest niedroga, pozwala na pomiar 48 próbek tkanek i może być udoskonalona do wykorzystania do 96 próbek tkanek. Każda studzienka w 48-dołkowej płytce zawiera uchwyty tkanek, które wykorzystują filtry do oddzielenia uwolnionego produktu od tkanki, a uwolnione monoaminy są następnie zbierane i analizowane przez HPLC-ECD. Co ważne, metoda ta pozwala na jednoczesny pomiar uwalniania 5-HT, DA i NE z różnych obszarów mózgu, takich jak kora przedczołowa, hipokamp i prążkowie grzbietowe po leczeniu środkami farmakologicznymi modulującymi uwalnianie monoamin. W ten sposób eksperymentator może odpowiedzieć na wiele pytań za pomocą niedrogiego systemu wielodołkowego, który zwiększa liczbę badanych próbek, a tym samym zmniejsza liczbę wykorzystywanych zwierząt.

<table><tbody><tr><td>48 Płytka dołkowa</td><td>Test NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fischer Scientific</td><td>A998-1</td><td>Faza ruchoma</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia Ahydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Zmodyfikowany sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy LUB Oprogramowanie do klarowności bufora wypływu</td></tr><tr><td></td><td>Anetc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Faza ruchoma</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma</td><td>1002608421</td><td>Bufor rozpiskowy</td></tr><tr><td>DMF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td>Test MTT</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr> Mobile <tr><td>Phase GraphPad Software Graphpad</td><td>Software, Inc</td><td></td><td>Analiza statystyczna</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>HPLC, dekada amperometryczna</td><td>Anetc</td><td></td><td>HPLC, system LC-EC</td></tr><tr><td></td><td>HPLC Amuza</td><td></td><td>HPLC HTEC-510.</td></tr><tr><td>Kwas L-asrobinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td>Bufor rozdzielczy</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>7487-88-9</td><td>KH</td></tr><tr><td>Jednostki filtrujące do mikrowirówek UltraFree</td><td>Millipore</td><td>C7554</td><td>Test - 6 pasujący do 48-dołkowej płytki</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Thermo Fisher</td><td>M6494</td><td>MTT</td>Test</tr><tr><td>Nanosep</td><td>VWR</td><td>29300-606</td><td>; Test białka</td></tr><tr><td>Kwas oktanosulfonowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V800010</td><td>Faza ruchoma</td></tr><tr><td>Pargyline Clorohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8013</td><td>Zmodyfikowany sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy OR Bufor Deflux</td></tr><tr><td>Kwas fosforowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Faza ruchoma</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>12636</td><td>KH Bufor</td></tr><tr><td>Fosforan potasu Monobasic</td><td>Sigma</td><td>1001655559</td><td>KH Bufor</td></tr><tr><td>Precyzonarny VF-21-0Z</td><td>Precissonary</td><td></td><td>Compresstome</td></tr><tr><td>Inhibitor Inhibitor Koktajl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2714</td><td>Bufor do lizy.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Bufor rozdzielczy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Bufor rozwarstwiający</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>KH Bufor</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>MTT Test / Bufor do lizy</td></tr></tbody></table>

test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Neuroprzekaźniki monoaminowe są związane z licznymi dolegliwościami neurologicznymi i psychiatrycznymi. Modele zwierzęce takich stanów wykazały zmiany w dynamice uwalniania i wychwytu neuroprzekaźników monoaminowych. Do badania funkcji monoamin wymagane są technicznie złożone metody, takie jak elektrofizjologia, woltamperometria cykliczna Fast Scan (FSCV), obrazowanie, mikrodializa in vivo, optogenetyka lub wykorzystanie radioaktywności. Przedstawiona tutaj metoda jest zoptymalizowanym dwuetapowym podejściem do wykrywania uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu 48-dołkowej płytki zawierającej uchwyty tkankowe do badania uwalniania monoamin oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ECD) do pomiaru uwalniania monoamin. Krótko mówiąc, skrawki mózgu szczura zawierające obszary zainteresowania, w tym korę przedczołową, hipokamp i prążkowie grzbietowe, uzyskano za pomocą krajalnicy do tkanek lub wibratomu. Te obszary zainteresowania wypreparowano z całego mózgu i inkubowano w natlenionym buforze fizjologicznym. Żywotność badano przez cały okres eksperymentu za pomocą testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT). Ostro wypreparowane obszary mózgu inkubowano w różnych warunkach lekowych, o których wiadomo, że indukują uwalnianie monoamin przez transporter (amfetaminę) lub poprzez aktywację egzocytotycznego uwalniania pęcherzykowego (KCl). Po inkubacji produkty uwolnione w supernatancie zebrano i przeanalizowano za pomocą systemu HPLC-ECD. W tym przypadku podstawowe uwalnianie monoamin jest wykrywane przez HPLC z ostrych wycinków mózgu. Dane te potwierdzają wcześniejsze wyniki in vivo i in vitro, które wykazały, że AMPH i KCl indukują uwalnianie monoamin. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania mechanizmów związanych z uwalnianiem zależnym od transportera monoamin i daje możliwość badania przesiewowego związków wpływających na uwalnianie monoamin w szybki i tani sposób.

Niniejsza technika opisuje zastosowanie skrawków mózgu do pomiaru uwalniania endogennych monoamin przy użyciu HPLC z detekcją elektrochemiczną, z wykorzystaniem płytki 48-dołkowej z wewnętrznym uchwytem do tkanek. Układ eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Początkowo, w celu zapewnienia żywotności tkanki do końca eksperymentu, przeprowadzono test MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliu...

Ta metoda wprowadza prostą technikę wykrywania endogennego uwalniania monoamin za pomocą ostrych wycinków mózgu. Zestaw wykorzystuje 48-dołkową płytkę zawierającą uchwyt na tkankę do uwalniania monoamin. Uwolniona monoamina jest analizowana za pomocą HPLC w połączeniu z detekcją elektrochemiczną. Ponadto technika ta zapewnia metodę przesiewową w celu odkrywania leków.

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Technika ta jest adaptacją powszechnie stosowanych metod badania uwalniania monoamin, umożliwiając pomiar uwalniania endogennego, a nie wstępnie załadowanych monoamin znakowanych radioaktywnie w wielu warunkach farmakologicznych w tym samym czasie. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest dość opłacalna, wiele stanów farmakologicznych może być badanych jednocześnie i możemy badać endogenne uwalnianie monoamin z możliwością rozróżnienia między uwalnianiem pęcherzykowym a transporterowym. Aby przygotować wycinki mózgu od dorosłych samców szczurów o wadze od 250 do 350 gramów po zbiorach, natychmiast umieść mózg i lodowaty natleniony bufor rozwarstwiający i uzyskaj 300-mikronowe koronalne sekcje mózgu z każdego regionu zainteresowania.W celu dalszej sekcji wycinków mózgu ostrożnie przenieś tkanki na szkiełka i użyj atlasu mózgu szczura, aby zidentyfikować prążkowie grzbietowe na podstawie jego ciemnej struktury prążkowanej oraz zidentyfikować hipokamp na podstawie jego bliskości do kory i unikalnej spiralnej struktury. Oddziel prawą i lewą półkulę do wykorzystania jako plasterki kontrolne i eksperymentalne. Prążkowie grzbietowe można dalej rozciąć na dwa milimetrowe stemple.Następnie użyj plastikowej pipety transferowej ze zmodyfikowaną końcówką, aby przenieść próbki do małych pojemników zanurzonych w natlenionym, lodowatym buforze preparacyjnym z bulgoczącym tlenem. Aby wywołać uwalnianie monoamin, przenieś próbki tkanek do każdej studzienki w specjalnie wykonanej 48-dołkowej komorze wypływowej zawierającej od 0,5 do jednego mililitra buforu wypływowego na studzienkę ze stałym delikatnym bulgotaniem i pozwól próbkom odzyskać przez 30 do 50 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec okresu równowagi przenieść uchwyt na tkankę z tkanką mózgową do studzienek zawierających 500 mikrolitrów natlenionego buforu wypływowego ze środkiem farmakologicznym lub bez, stukając uchwytem w krawędź studzienki, aby zapobiec minimalnemu przenoszeniu buforu między studzienkami przez 20 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji przenieść posiadacza do nowego zestawu studzienek zawierających 500 mikrolitrów buforu wypływowego z lekiem lub bez niego i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na dodatkowe 20 minut. Podczas drugiej inkubacji przenieś roztwór z dołków z pierwszej inkubacji do probówek mikrowirówek zawierających 50 mikrolitrów jednego normalnego kwasu nadchlorowego lub fosforowego na lodzie i oznacz probówki numerem jeden"Pod koniec drugiej inkubacji przenieś uchwyt na tkankę do pustych studzienek z płytką na lodzie i przenieś supernatanty z drugiej inkubacji do nowych probówek do mikrowirówek zawierających 50 mikrolitrów jednego normalnego nadchloru lub fosforu kwas na lodzie. Oznacz te probówki numerem dwa"Gdy wszystkie supernatanty zostaną przeniesione, dodaj jeden mililitr lodowatego buforu do rozwarstwiania do każdej studzienki tkanki i użyj małej pęsety, aby przenieść każdą próbkę tkanki do nowej probówki mikrowirówkowej.Usunąć bufor z probówek z próbkami i przechowywać tkanki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, a następnie przenieść zebrane roztwory inkubacyjne do probówek filtracyjnych do mikrowirówek w celu odwirowania i umieścić filtrat na lodzie do czasu analizy HPLC. Ustaw potencjał ECD i natężenie przepływu zgodnie z zaleceniem producenta dotyczącym wykrywania monoamin. Załadować i odpowiednią porcję każdej próbki, w tym wzorce neuroprzekaźników, do HPLC w celu automatycznego wstrzykiwania i wykrywania, a następnie pozwolić przyrządowi zakończyć analizę.Następnie użyj oprogramowania do analizy HPLC, aby pozyskać i przeanalizować dane chromatografu przy użyciu standardowej krzywej złożonej z każdej monoaminy, aby uzyskać obszar pod krzywą w oparciu o wytyczne producenta. Po sześciu godzinach analizy funkcjonalnej próbki tkanek pozostają żywe, podczas gdy próbki inkubowane z 1%Triton X-100 wykazują znaczne zmniejszenie transformacji MTT. Ostre 20-minutowe leczenie amfetaminą odcinków mózgu w korze hipokampa i kory przedczołowej powoduje znaczny wzrost poziomu zewnątrzkomórkowego każdej monoaminy.Gdy próbki są wstępnie traktowane fluoksetyną, selektywnym inhibitorem wychwytu zwrotnego serotoniny, nie występuje indukowany amfetaminą wzrost zewnątrzkomórkowej serotoniny w hipokampie i korze przedczołowej, podczas gdy wzrost zewnątrzkomórkowej produkcji dopaminy i noradrenaliny nie jest zaburzony. Ponadto, ostre 20-minutowe leczenie amfetaminą pążków prążkowia grzbietowego powoduje 35-krotny wzrost ekspresji zewnątrzkomórkowego poziomu dopaminy, podczas gdy leczenie kłuciem prążkowia grzbietowego kokainą, blokerem transportera monoamin, powoduje znaczne zahamowanie zewnątrzkomórkowej dopaminy indukowanej amfetaminą. Zwiększenie stężenia zewnątrzkomórkowego chlorku potasu w celu wywołania depolaryzacji błony jest wystarczające do wywołania egzocytotycznego uwalniania monoamin w porównaniu z nieleczonymi warunkami kontrolnymi, a ani leczenie fluoksetyną, ani kokainą nie blokuje tego wzrostu wywołanego głęboką polaryzacją.Konieczne jest posiadanie czystych sekcji cięcia, precyzyjna lokalizacja stempli i utrzymanie stałego natlenienia przez cały czas trwania eksperymentu. Wycinki mózgu mogą być wykorzystane po eksperymentach do dalszego przetwarzania i analizy biochemicznej, takiej jak western blotting i histologia.

a-plate-based-assay-for-measurement-endogenous-monoamine-release

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

W tym filmie demonstrujemy test, który bada mechanizmy uwalniania monoamin z neuronów metabolicznie aktywnych wycinków mózgu szczura ex vivo, podczas leczenia testowymi lekami. Test pokazuje, że leki neurostymulujące indukują uwalnianie monoamin przez komórkowe transportery monoamin, podczas gdy wysokie stężenie KCl indukuje pęcherzykowe uwalnianie monoamin za pośrednictwem egzocytozy pęcherzyków synaptycznych.

Test na płytkach do pomiaru uwalniania monoamin z wycinków mózgu podczas ekspozycji na lek testowy

Ten film demonstruje test oparty na matrycy mikroelektrod do badania aktywności sieci neuronalnej w odcinkach rdzenia kręgowego myszy. Najpierw rejestruje się aktywność elektrofizjologiczną z powierzchownego rogu grzbietowego (SDH) warstwy. Następnie wprowadza się inhibitor kanału potasowego w celu przedłużenia depolaryzacji, co skutkuje synchroniczną aktywnością rytmiczną w całej sieci neuronalnej.

Oparta na mikroelektrodach ocena sieci neuronalnych w wycinkach rdzenia kręgowego myszy

Ten film pokazuje ocenę wychwytu dopaminy w synaptosomach pobranych z mózgów myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania synaptosomów do wychwytu dopaminy za pośrednictwem transporterów dopaminy, traktowania ich różnymi stężeniami dopaminy znakowanej radioaktywnie, izolowania synaptosomów i pomiaru radioaktywności w celu ilościowego określenia wychwytu dopaminy.

Pomiar wychwytu dopaminy w synaptosomach mózgu myszy za pomocą dopaminy znakowanej radioaktywnie

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

Wychwyt synaptosomalnej dopaminy i wysokosprawna chromatografia cieczowa stanowią eksperymentalne narzędzia do badania homeostazy dopaminy u myszy, oceniając odpowiednio funkcję transportera dopaminy i poziom dopaminy w tkance prążkowia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) jest powszechnym wskaźnikiem funkcji mitochondriów i może być używany do badania różnych modeli chorób. Opracowaliśmy nową metodę wykorzystującą analizator Seahorse XF do bezpośredniego pomiaru OCR w ostrych wycinkach prążkowia od dorosłych myszy, która jest bardziej fizjologicznie istotna niż inne metody.

Pomiar wskaźnika zużycia tlenu w ostrych plastrach prążkowia od dorosłych myszy

Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

Naucz się mierzyć endogenne uwalnianie monoamin w ostrych wycinkach mózgu szczura przy użyciu płytki 48-well i HPLC-ECD. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów uwalniania neuroprzekaźników w warunkach farmakologicznych.

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów