Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Technika ta jest adaptacją powszechnie stosowanych metod badania uwalniania monoamin, umożliwiając pomiar uwalniania endogennego, a nie wstępnie załadowanych monoamin znakowanych radioaktywnie w wielu warunkach farmakologicznych w tym samym czasie. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest dość opłacalna, wiele stanów farmakologicznych może być badanych jednocześnie i możemy badać endogenne uwalnianie monoamin z możliwością rozróżnienia między uwalnianiem pęcherzykowym a transporterowym. Aby przygotować wycinki mózgu od dorosłych samców szczurów o wadze od 250 do 350 gramów po zbiorach, natychmiast umieść mózg i lodowaty natleniony bufor rozwarstwiający i uzyskaj 300-mikronowe koronalne sekcje mózgu z każdego regionu zainteresowania.

W celu dalszej sekcji wycinków mózgu ostrożnie przenieś tkanki na szkiełka i użyj atlasu mózgu szczura, aby zidentyfikować prążkowie grzbietowe na podstawie jego ciemnej struktury prążkowanej oraz zidentyfikować hipokamp na podstawie jego bliskości do kory i unikalnej spiralnej struktury. Oddziel prawą i lewą półkulę do wykorzystania jako plasterki kontrolne i eksperymentalne. Prążkowie grzbietowe można dalej rozciąć na dwa milimetrowe stemple.

Następnie użyj plastikowej pipety transferowej ze zmodyfikowaną końcówką, aby przenieść próbki do małych pojemników zanurzonych w natlenionym, lodowatym buforze preparacyjnym z bulgoczącym tlenem. Aby wywołać uwalnianie monoamin, przenieś próbki tkanek do każdej studzienki w specjalnie wykonanej 48-dołkowej komorze wypływowej zawierającej od 0,5 do jednego mililitra buforu wypływowego na studzienkę ze stałym delikatnym bulgotaniem i pozwól próbkom odzyskać przez 30 do 50 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec okresu równowagi przenieść uchwyt na tkankę z tkanką mózgową do studzienek zawierających 500 mikrolitrów natlenionego buforu wypływowego ze środkiem farmakologicznym lub bez, stukając uchwytem w krawędź studzienki, aby zapobiec minimalnemu przenoszeniu buforu między studzienkami przez 20 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przenieść posiadacza do nowego zestawu studzienek zawierających 500 mikrolitrów buforu wypływowego z lekiem lub bez niego i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na dodatkowe 20 minut. Podczas drugiej inkubacji przenieś roztwór z dołków z pierwszej inkubacji do probówek mikrowirówek zawierających 50 mikrolitrów jednego normalnego kwasu nadchlorowego lub fosforowego na lodzie i oznacz probówki numerem jeden"Pod koniec drugiej inkubacji przenieś uchwyt na tkankę do pustych studzienek z płytką na lodzie i przenieś supernatanty z drugiej inkubacji do nowych probówek do mikrowirówek zawierających 50 mikrolitrów jednego normalnego nadchloru lub fosforu kwas na lodzie. Oznacz te probówki numerem dwa"Gdy wszystkie supernatanty zostaną przeniesione, dodaj jeden mililitr lodowatego buforu do rozwarstwiania do każdej studzienki tkanki i użyj małej pęsety, aby przenieść każdą próbkę tkanki do nowej probówki mikrowirówkowej.

Usunąć bufor z probówek z próbkami i przechowywać tkanki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, a następnie przenieść zebrane roztwory inkubacyjne do probówek filtracyjnych do mikrowirówek w celu odwirowania i umieścić filtrat na lodzie do czasu analizy HPLC. Ustaw potencjał ECD i natężenie przepływu zgodnie z zaleceniem producenta dotyczącym wykrywania monoamin. Załadować i odpowiednią porcję każdej próbki, w tym wzorce neuroprzekaźników, do HPLC w celu automatycznego wstrzykiwania i wykrywania, a następnie pozwolić przyrządowi zakończyć analizę.

Następnie użyj oprogramowania do analizy HPLC, aby pozyskać i przeanalizować dane chromatografu przy użyciu standardowej krzywej złożonej z każdej monoaminy, aby uzyskać obszar pod krzywą w oparciu o wytyczne producenta. Po sześciu godzinach analizy funkcjonalnej próbki tkanek pozostają żywe, podczas gdy próbki inkubowane z 1%Triton X-100 wykazują znaczne zmniejszenie transformacji MTT. Ostre 20-minutowe leczenie amfetaminą odcinków mózgu w korze hipokampa i kory przedczołowej powoduje znaczny wzrost poziomu zewnątrzkomórkowego każdej monoaminy.

Gdy próbki są wstępnie traktowane fluoksetyną, selektywnym inhibitorem wychwytu zwrotnego serotoniny, nie występuje indukowany amfetaminą wzrost zewnątrzkomórkowej serotoniny w hipokampie i korze przedczołowej, podczas gdy wzrost zewnątrzkomórkowej produkcji dopaminy i noradrenaliny nie jest zaburzony. Ponadto, ostre 20-minutowe leczenie amfetaminą pążków prążkowia grzbietowego powoduje 35-krotny wzrost ekspresji zewnątrzkomórkowego poziomu dopaminy, podczas gdy leczenie kłuciem prążkowia grzbietowego kokainą, blokerem transportera monoamin, powoduje znaczne zahamowanie zewnątrzkomórkowej dopaminy indukowanej amfetaminą. Zwiększenie stężenia zewnątrzkomórkowego chlorku potasu w celu wywołania depolaryzacji błony jest wystarczające do wywołania egzocytotycznego uwalniania monoamin w porównaniu z nieleczonymi warunkami kontrolnymi, a ani leczenie fluoksetyną, ani kokainą nie blokuje tego wzrostu wywołanego głęboką polaryzacją.

Konieczne jest posiadanie czystych sekcji cięcia, precyzyjna lokalizacja stempli i utrzymanie stałego natlenienia przez cały czas trwania eksperymentu. Wycinki mózgu mogą być wykorzystane po eksperymentach do dalszego przetwarzania i analizy biochemicznej, takiej jak western blotting i histologia.