Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

Systematyczna analiza punktowa jest techniką oceny uszkodzenia błony śluzowej, ułatwiającą interpretację histologiczną, która może być wykonana przez przeszkolonych badaczy. Główną zaletą tej metody jest to, że jest bezpłatna i łatwa w użyciu. Pozwala na ilościową analizę danych histologicznych uzyskanych z jelit myszy z zapaleniem jelita grubego.

Protokół ten zapewnia szybki i powtarzalny sposób interpretacji ciężkości choroby całej okrężnicy, co jest niezbędne do porównywania chorób u zwierząt o różnym pochodzeniu genetycznym. Do przygotowania tkanek ważne jest, aby uporządkować wszystkie odczynniki i materiały. Zacznij od umieszczenia uśpionej myszy na podkładce preparacyjnej w pozycji leżącej na plecach i unieruchamij kończyny myszy za pomocą igieł o rozmiarze 20 1,5 cala.

Za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj małe nacięcie na skórze brzucha i pociągnij je na bok, aby odsłonić otrzewną, a następnie otwórz jamę brzuszną z nacięciem w linii środkowej otrzewnej od kości łonowej do boków brzucha. Ostrożnie usuń tkanki i narządy, aż jelito grube zostanie uwidocznione. Przetnij kość miednicy po obu stronach okrężnicy, aby w pełni uwidocznić narząd, rozciągający się od odbytu w kierunku jelita ślepego.

Delikatnie usuń tłuszcz, małe żyły i tętnice przyczepione do okrężnicy, jednocześnie ostrożnie preparując narząd, przecinając go tylko proksymalnie do odbytu i dystalnie do jelita ślepego. Ostrożnie przepłucz okrężnicę PBS, aby usunąć zawartość kału za pomocą elastycznej plastikowej igły do głębnika wprowadzonej przez odbyt. Ustaw okrężnicę w linii prostej i otwórz ją wzdłużnie wzdłuż tętnicy krezkowej.

Przeciąć okrężnicę na pół podłużnie od dystalnego do bliższego końca. Użyj połowy tkanki do analizy histologicznej, a drugiej połowy do Western blot, PCR lub zwiń w drugą szwajcarską rolkę do świeżo mrożonej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przyciąć dodatkową tkankę z bliższej okrężnicy żyletką, aż do uzyskania mniej więcej tej samej szerokości na całej długości okrężnicy.

Wyrównaj okrężnicę, aby odsłonić światło i całkowicie spłaszczyć tkankę za pomocą elastycznej igły do zgłębnika. W razie potrzeby dodaj więcej PBS, aby utrzymać wilgotność tkanki przez cały czas trwania zabiegu. Usuń nadmiar PBS za pomocą papierowej ściereczki.

Za pomocą strzykawki i igły do zgłębnika dodaj 10% neutralny buforowany roztwór formaliny przez dwie do trzech minut, aby utrwalić i spłaszczyć tkankę, a następnie użyj prostych kleszczy, aby chwycić koniec dystalnej okrężnicy i skręć okrężnicę w koncentryczne kręgi od dystalnego do bliższego końca. Włóż igłę o rozmiarze 27, aby przypiąć okrężnicę pośrodku i przytrzymaj jej szwajcarski kształt rolki, a następnie umieść szwajcarską rolkę w kasecie do zatapiania w pojemniku na próbkę histologiczną, orientując tkankę równolegle w stosunku do kasety. Utrwal tkankę w 10% neutralnym buforowym roztworze formaliny przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po utrwaleniu przez noc przemyj tkankę trzykrotnie PBS. Dodaj 70% etanolu przed procesem zatapiania parafiny i wyjmij igłę ze szwajcarskiej bułki przed kontynuowaniem. Tkanka może być przechowywana w etanolu w temperaturze pokojowej do momentu zatopienia w parafinie.

Po otwarciu zeskanowanych obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu sprawdź, czy widoczny jest cały okrężnicy i czy nie brakuje żadnych obszarów próbki. Aktywuj narzędzia Label imager i Scale bar, aby prawidłowo zidentyfikować zeskanowane slajdy, klikając opcję Label imager. Otwórz narzędzie adnotacji, klikając adnotacje i utwórz trzy różne warstwy, klikając nową warstwę, aby określić ilościowo całkowitą długość szwajcarskiej rolki, stan zapalny lub uraz oraz erozję lub owrzodzenie.

Wybierz inny kolor dla każdej warstwy, klikając kolor warstwy. Zmierz długość każdej warstwy lub kategorii, klikając narzędzie Pióro, aby narysować linię podążającą za błoną śluzową mięśni, przesuwając wskaźnik w razie potrzeby, aby zwizualizować sąsiedni obszar do analizy. Obejrzyj obraz w powiększeniu 400 mikrometrów, aby ułatwić odpowiednią wizualizację błony śluzowej mięśni.

Za każdym razem, gdy pióro zostanie zatrzymane, zostanie wygenerowany mały nowy obszar warstwy. Można go wizualizować i edytować za pomocą zakładki regionów warstw. Przejrzyj całkowitą długość, stan zapalny lub uraz oraz erozję lub owrzodzenie mierzone przy użyciu błony śluzowej mięśni jako odniesienia.

Po zdefiniowaniu wszystkich warstw wyeksportuj dane za pomocą przycisku eksportuj siatkę do pliku tekstowego w opcjach regionów warstw. Otwórz pliki tekstowe i skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Zsumuj wszystkie segmenty z każdego regionu i oblicz procent obrażeń i owrzodzeń w odniesieniu do całkowitej długości.

Rozważ trzy główne cechy, aby obliczyć wynik histologicznego zapalenia jelita grubego i ocenić ciężkość choroby. Sprawdź, czy błona śluzowa jelit jest zdrowa, która charakteryzuje się zorganizowanymi komórkami nabłonkowymi w osi światła krypty, blaszką właściwą z niewielką liczbą komórek odpornościowych i błoną śluzową mięśni podskórnych. Następnie sprawdź, czy nie ma stanu zapalnego lub urazu, który charakteryzuje się kryptami nabłonka, które są osłabione lub częściowo brakuje komórek nabłonka oraz zapaleniem błony śluzowej z infiltracją neutrofili do krypt.

Na koniec sprawdź, czy nie ma erozji lub owrzodzenia, które charakteryzuje się obszarami pozbawionymi nabłonka powierzchniowego lub obszarami całkowicie pozbawionymi krypt nabłonka z powiązanymi leukocytami lub bez nich. Aby zilustrować wiarygodność tej histologicznej analizy oceny zapalenia jelita grubego w kontekście uszkodzenia błony śluzowej, 2,5% DSS podawano w wodzie pitnej ośmiu myszom typu dzikiego C57BL6 przez pięć dni, po czym nastąpił okres rekonwalescencji z regularną wodą przez pięć dni. Masa ciała pozostała stała podczas ostrego podawania DSS, ale dramatycznie zmniejszyła się, gdy myszy zaczęły pić zwykłą wodę z kranu.

Krew i miękkie stolce pojawiły się po trzech dniach podawania DSS i trwały do ósmego dnia eksperymentu. Obserwacje te sugerowały, że najbardziej szkodliwe skutki ekspozycji na DSS zaobserwowano w okresie rekonwalescencji między piątym a ósmym dniem. Pomiar długości jelita grubego w 10 dniu potwierdził znaczne skrócenie pod koniec eksperymentu.

Okrężnice zbierano w dniu zero, drugim, piątym, siódmym, ósmym i dziesiątym, aby zrobić szwajcarskie bułeczki parafinowe. Tkankę wybarwiono za pomocą H&E i przeanalizowano skany w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego oraz procentu urazów i owrzodzeń. Normalną architekturę krypty zaobserwowano u myszy nieleczonych.

Po dwóch dniach od podania DSS zaobserwowano rekrutację komórek odpornościowych. W piątym dniu komórki nabłonkowe wydają się uszkodzone i doszło do naciekania neutrofili przez nabłonek związanego z uszkodzeniem nabłonka. Od piątego do ósmego dnia obserwowano obszary utraty nabłonka ze stanem zapalnym i owrzodzeniem.

W 10 dniu komórki nabłonkowe zaczęły się regenerować i ponownie zasiedlać owrzodzone obszary, powoli odbudowując błonę śluzową okrężnicy. Podczas prób stosowania tego protokołu ważne jest, aby stworzyć odpowiednio zorientowaną i dobrze zachowaną bułkę szwajcarską, a także prawidłowo zidentyfikować zapalenie lub uraz błony śluzowej oraz owrzodzenie lub nadżerkę. Metoda ta może być stosowana do ilościowej oceny uszkodzenia na całej długości błony śluzowej okrężnicy w innych modelach zapalenia jelita grubego, takich jak TMS lub model transferu komórek T.