Name: Szczurzy model infekcji mózgu EcoHIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj model infekcji mózgu EcoHIV u szczurów do badań nad zaburzeniami neurokognitywnymi związanymi z HIV. Metoda obejmuje pakowanie wirusa, stereotaktyczne wstrzyknięcie i analizę mikrogleju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów NIH HD043680, MH106392, DA013137 i NS100624.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Południowej Karoliny (federalny numer gwarancji: D16-00028). Sześć dorosłych samców szczura F344/N trzymano w parze w kontrolowanym środowisku w cyklu 12/12 światło: ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Wszystkie zwierzęta były pod opieką zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez National Institutes of Health w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych.
1. Opakowanie wirusa w 293 komórkach FT
<ol>
	<li>Hodować 293 komórki FT (5×105/ml) w pokrytych żelatyną 75 cm2 kolbach z DMEM plus 10% FBS11. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, aby były w 50% zlewane podczas transfekcji.</li>
	<li>Rozcieńczyć 22,5 μl odczynnika do transfekcji (np. Lipofectamine 3000) w 750 μl pożywki (np. Opti-MEM) w 1,5 ml mikroprobówce wirówkowej i wirować przez 3 s.</li>
	<li>Rozcieńczyć 20 μg plazmidowego DNA EcoHIV w 750 μl pożywki w 1,5 ml mikroprobówce wirówkowej i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Dodaj rozcieńczone DNA do probówki z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji i delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać mieszaninę do 10 ml podgrzanego podłoża DMEM w kolbie o długości75 cm2. Inkubować komórki przez 2 dni w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać i połączyć 24 ml pożywki warunkowej z dwóch kolb zawierających dołączonego lentiwirusa.</li>
	<li>Odwirować całe 24 ml pożywki warunkowej o stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść sklarowany supernatant do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Połączyć 8 ml koncentratora Lenti-x z 24 ml sklarowanego supernatantu (w stosunku 1:3). Wymieszaj przez delikatne odwrócenie. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez dwa dni.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę o stężeniu 1 500 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć sklarowany osad.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić osad w 100 μl 100 mM PBS.</li>
	<li>Stężenie miana wirusa za pomocą zestawu p24 ELISA.</li>
</ol>
2. Operacje stereotaktyczne wirusa EcoHIV-EGFP
<ol>
	<li>Znieczulenie szczurów za pomocą 3% sewofluranu. Przejdź do kroku 2.2, gdy szczury nie reagują na szkodliwe bodźce i nie mają odruchów.</li>
	<li>Ogol włosy w okolicy mózgu i dwukrotnie wysterylizuj skórę 70% etanolem i peelingiem na bazie chlorheksydyny. Zabezpiecz szczura w pozycji leżącej w aparacie stereotaktycznym.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie (5-6 cm) przez skórę wzdłuż linii środkowej skóry głowy.</li>
	<li>Zaznacz dwie pozycje wiercenia na boku 0,8 mm, 1,2 mm rostral do bregma. Wywierć otwór (średnica 0,4 mm) w każdej pozycji czaszki.</li>
	<li>Napełnić miareczkowany roztwór lentiwirusa EcoHIV (1,04 × 106 j./ml) w strzykawce iniekcyjnej o pojemności 10 μl. Przymocować strzykawkę do aparatu stereotaktycznego.</li>
	<li>Przesuń igłę w dół blisko powierzchni wierconego otworu. Zmierz i przesuń na głębokość 2,5 mm.</li>
	<li>Wlać w infuzji 1 μl roztworu wirusa z szybkością 0,2 μl/min. Trzymać igłę w miejscu wstrzyknięcia przez 5 minut. Powoli przesuwać igłę w górę, aż znajdzie się na zewnątrz czaszki szczura.</li>
	<li>Zszyj skórę jedwabną nicią 4-0.</li>
	<li>Jednokrotnie wysterylizuj nacięcie 70% etanolem. Podskórnie wstrzyknąć butorfenol (Dorolex, 0,1 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Przenieś szczura do komory rekonwalescencji z poduszką grzewczą, aż się obudzi.</li>
</ol>
3. Wizualizacja sekcji mózgu
UWAGA: Poczekaj od jednego do ośmiu tygodni po infuzji wirusa EcoHIV.
<ol>
	<li>Znieczulij szczura 5% sewofluranem. Kontynuuj do kroku 3.2, gdy szczury nie reagują na szkodliwe bodźce i nie mają odruchów.</li>
	<li>Zamocuj szczura w pozycji leżącej na plecach w okapie.</li>
	<li>Naciąć skórę wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej. Przetnij membranę i otwórz klatkę piersiową.</li>
	<li>Wprowadzić igłę o masie 20 g × 25 mm do lewej komory.</li>
	<li>Natychmiast otwórz prawe przedsionek nożyczkami.</li>
	<li>Ukrwić 50 ml wstępnie schłodzonego 100 mM PBS z szybkością 5 ml/min.</li>
	<li>Perfaktor 100 ml zimnego 4% paraformaldehydu z szybkością 5 ml/min.</li>
	<li>Odetnij głowę szczurowi, otwórz skórę głowy i usuń mózg.</li>
	<li>Postfix na noc z 4% paraformaldehydem.</li>
	<li>Przenieś mózg do 40 ml 30% sacharozy w 100 mM PBS w probówce o pojemności 50 ml, aż mózg opadnie na dno (około 3 dni).</li>
	<li>Błyskawicznie zamrozić mózg w metylobutanolu na 2 minuty w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zabezpiecz tkankę mózgową na metalowej platformie wewnątrz kriostatu o temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wytnij skrawki koronalne o grubości 50 μm za pomocą kriostatu.</li>
	<li>Przenieś plastry mózgu na szkiełka za pomocą cienkiego pędzelka.</li>
	<li>Zamontuj sekcje w 0,3 ml podłoża zapobiegającego blaknięciu i przykryj szkiełkami nakrywkowymi 22 mm 50 mm.</li>
	<li>Szkiełka podstawowe należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.</li>
	<li>Zobrazuj docelowe neurony za pomocą mikroskopu konfokalnego za pomocą stosu Z w oparciu o granice regionów mózgu i cechy morfologiczne neuronów. 
	UWAGA: Zastosowano ustawienia mikroskopu konfokalnego: powiększenie 60 x (A/1,4, olej) i interwał w płaszczyźnie Z 0,15 μm (rozmiar otworka 30 μm; promień otworka rzutowanego wstecznie 167 nm) przy długości fali 488 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

W tym protokole ustaliliśmy model zakażenia wirusem HIV wywołanego przez EcoHIV u szczurów. W szczególności opisaliśmy obustronne stereotaktyczne wstrzyknięcie EcoHIV do kory mózgowej, które skutecznie wywołało aktywne zakażenie wirusem HIV w mózgu szczura 7 dni po wstrzyknięciu. Co więcej, wykazaliśmy, że zakażenie EcoHIV u szczurów może być dobrym systemem biologicznym do badania kluczowych aspektów HAND. Osiem tygodni po zakażeniu EcoHIV szczury wykazywały znaczne zaburzenia neurokognitywne, które obejmowały zmiany w ...

Systemy biologiczne poszerzyły naszą wiedzę na temat zaburzeń neurokognitywnych związanych z HIV-1 (HAND) i leżących u ich podstaw mechanizmów neuronalnych2. Określenie, który system biologiczny jest najbardziej odpowiedni dla danego badania, jest często zależne od interesującego pytania2. Ograniczenie zakresu modeli zwierzęcych gospodarzy stanowi wyzwanie dla badań nad rozwojem choroby HIV-1. Aby zbadać replikację i patogenezę wirusa HIV-1, Potash i wsp.3 stworzyli mysi model aktywnego zakażenia HIV-1, zastępując region kodujący glikoproteiny otoczki powierzchniowej HIV, gp120, ekotropowym MLV gp80, co doprowadziło do udanej replikacji wirusa u myszy4. Po wstrzyknięciach do żyły ogonowej u chimerycznych myszy zakażonych wirusem HIV (EcoHIV) zaobserwowano wiele cech przypominających cechy osób seropozytywnych HIV-1 (np. zakażone limfocyty i makrofagi, ukierunkowane na przeciwwirusową odpowiedź immunologiczną i stan zapalny3,5,6).
Chociaż myszy i szczury należą do rodziny Muridae, fundamentalne różnice między gatunkami mogą wpływać na ich przydatność do konkretnych pytań eksperymentalnych7. W związku z tym rozszerzenie modelu zakażenia EcoHIV na szczury (powszechnie stosowanego w badaniach nad nadużywaniem narkotyków i zaburzeniami neurokognitywnymi) byłoby korzystne w badaniach nad neuroHIV. Na przykład, ich większy rozmiar sprawia, że implantacja cewnika szyjnego do procedur samodzielnego podawania leków jest bardziej praktyczna8. Techniki samodzielnego podawania leków u szczurów zostały wykorzystane do oceny motywacji w HIV-19. Co więcej, wiele zadań neurokognitywno-behawioralnych zostało początkowo zaprojektowanych dla szczurów10. W tym miejscu donosimy o wykorzystaniu stereotaktycznych zastrzyków EcoHIV u szczurów w celu rozszerzenia modelu infekcji EcoHIV i stworzenia kluczowej okazji do odpowiedzi na nowe pytania związane z neuroHIV i HAND.

<table><tbody><tr><td>Ogniwa 293FT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>roztwór Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatŻelatyna 75cm&sup2; Prostokątna kolba do hodowli komórkowych z przechyloną szyjką i wentylowaną nasadką</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM z L-glutaminą, 4,5 g/l glukozy i pirogronianem sodu</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>wiertarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Kleszcze</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikrowirówka zatrzaskowa Biopur Safe-Lock Probówki</td> Life <td>Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus Antybakteryjny, 4-0 Polyglactin 910 Szew, 27in. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Technologie życia</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tęczówki</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA p24 związany z lentiwirusem Cell</td><td>Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane technologie surowicy o średniej</td><td>żywotności</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Zaopatrzenie weterynaryjne</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>aparat stereotaktyczny</td><td>Instrumenty Kopf Model</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice SuperFrost Plus Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

szczurzy model infekcji mózgu ecohiv

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Zostało dobrze zbadane, że model myszy zakażony EcoHIV jest bardzo przydatny w badaniu powikłań neurologicznych związanych z HIV. Opracowanie modelu szczura zakażonego wirusem EcoHIV do badań nad nadużywaniem narkotyków i zaburzeniami neurokognitywnymi byłoby korzystne w badaniach nad neuroHIV i zaburzeniami neuropoznawczymi związanymi z HIV-1 (HAND). W niniejszej pracy wykazano udane stworzenie szczurzego modelu aktywnego zakażenia wirusem HIV przy użyciu chimerycznego HIV (EcoHIV). Po pierwsze, lentiwirusowy konstrukt EcoHIV umieszczono w hodowanych 293 komórkach FT przez 48 godzin. Następnie pożywka warunkowa została zagęszczona i zbalansowana. Następnie przeprowadziliśmy obustronne stereotaktyczne wstrzyknięcia EcoHIV-EGFP do tkanki mózgowej szczura F344 / N. Tydzień po zakażeniu w zakażonej tkance mózgowej wykryto sygnały fluorescencyjne EGFP, co wskazuje, że EcoHIV skutecznie indukuje aktywne zakażenie wirusem HIV u szczurów. Ponadto przeprowadzono barwienie immunologiczne dla markera komórek mikrogleju, Iba1. Wyniki wskazują, że mikroglej był dominującym typem komórek, w których występuje EcoHIV. Co więcej, szczury z wirusem EcoHIV wykazywały zmiany w przetwarzaniu czasowym, co jest potencjalnym mechanizmem neurobehawioralnym leżącym u podstaw HAND, a także dysfunkcją synaps osiem tygodni po zakażeniu. Reasumując, niniejsze badanie rozszerza model zakażenia HIV-1 EcoHIV na szczury, oferując cenny system biologiczny do badania rezerwuarów wirusa HIV-1 w mózgu, a także HAND i powiązanych chorób współistniejących, takich jak nadużywanie narkotyków.

Pożywka warunkowana została zebrana z komórek 293FT zainfekowanych lentiwirusem EcoHIV-EGFP. Następnie została ona skoncentrowana i określono jej miano, po czym wstrzyknięto ją stereotaktycznie do mózgu (obszaru kory) szczurów F344/N. Siedem dni po iniekcji szczury zostały uśpione, a następnie wykonano obrazy koronalnych przekrojów mózgu w zakresie od bregma 5,64 mm do bregma -4,68 mm. Na Rysunku 1A widoczne są znaczące sygnały EcoHIV-EGFP w całym mózgu, szczególnie w korze oraz w zakręcie z...

Tutaj prezentujemy protokół do stworzenia nowego szczurzego modelu aktywnego zakażenia wirusem HIV za pomocą chimerycznego HIV (EcoHIV), który jest kluczowy dla zwiększenia naszego zrozumienia rezerwuarów wirusa HIV-1 w mózgu i oferuje system do badania zaburzeń neurokognitywnych związanych z HIV i związanych z nimi chorób współistniejących (np. nadużywania narkotyków).

Szczurzy model infekcji mózgu EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Wykorzystując szczury, protokół ten może być wykorzystany do ustalenia nowego modelu aktywnego zakażenia wirusem HIV przy użyciu chimerycznego wirusa HIV. w przypadku szczurów, ustanowienie modelu zakażenia EcoHIV do badań nad nadużywaniem narkotyków i zaburzeniami neurokognitywnymi może być korzystne dla badań nad neuro HIV i zaburzeniami neuropoznawczymi związanymi z HIV-1. Procedurę zademonstruje Hailong Li, pracownik naukowy z mojego laboratorium.W celu upakowania wirusa do 293 limfocytów T, wysiewaj pięć razy 10 do piątych 293 limfocytów T na mililitr DMEM uzupełnionych 10% FBS do każdej z dwóch pokrytych żelatyną kolb o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż kultury osiągną 50% konfluencji. W dniu transfekcji rozcieńczyć 22,5 mikrolitra odczynnika do transfekcji w 750 mikrolitrach pożywki na kolbę w 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki i wirować roztwór przez trzy sekundy. Rozcieńczyć 20 mikrogramów chimerycznego plazmidowego DNA EcoHIV w 750 mikrolitrach pożywki w drugiej 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej na kolbę, dokładnie mieszając.Połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji, delikatnie mieszając i inkubować otrzymany roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodać każdą zawiesinę wirusa do 10 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki DMEM i dodać każdy roztwór uzupełniony wirusem do jednej kolby z 293 limfocytami T. Po dwóch dniach hodowli komórkowej zebrać supernatant z kolb w pojedynczej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów do odwirowania i przenieść oczyszczony supernatant do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Dodać osiem mililitrów koncentratora Lenti-X do oczyszczonego supernatantu i wymieszać z delikatną inwersją. Po dwudniowej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza odwirować mieszaninę i ostrożnie usunąć supernatant, a następnie delikatnie ponownie zawiesić osad ze 100 mikrolitrami 100 milimolowych PBS i użyć zestawu P24 ELISA do miana stężenia wirusa. W przypadku wstrzyknięcia EcoHIV-EGFP, po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, należy ogolić włosy w okolicy mózgu i dwukrotnie wysterylizować odsłoniętą skórę za pomocą 70% etanolu i peelingu na bazie chlorheksydyny.Zabezpiecz szczura w pozycji leżącej w aparacie stereotaktycznym i wykonaj pięcio- do sześciocentymetrowego nacięcia przez skórę wzdłuż linii środkowej skóry głowy. Zaznacz jedną pozycję wiercenia w odległości 0,8 milimetra bocznego i jedną 1,2 milimetra rostral do bregmy i wywierć otwór o średnicy 0,4 milimetra w każdej pozycji czaszki. Załadować 1,04 razy 10 do szóstej jednostki transdukcji na mililitr roztworu EcoHIV Lentivirus do 10-mikrolitrowej strzykawki iniekcyjnej i przymocować strzykawkę do aparatu stereotaktycznego.Przesuń igłę blisko powierzchni jednego wierconego otworu i włóż igłę 2,5 mililitra do otworu. Podawać jeden mikrolitr roztworu wirusa w ilości 0,2 mikrolitra wirusa na minutę. Po wstrzyknięciu całego wirusa należy pozostawić igłę w obszarze wstrzyknięcia na pięć minut, a następnie powoli wycofać igłę, aż znajdzie się na zewnątrz czaszki szczura.Zamknij nacięcie skóry szwem z jedwabnej nici 4-0 i wysterylizuj roztwór 70% etanolem, a następnie umieść szczura w komorze rekonwalescencji z poduszką grzewczą z monitorowaniem do leżenia. Od jednego do ośmiu tygodni po infuzji wirusa, po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, unieruchamić szczura w pozycji leżącej na plecach w dygestorii i naciąć skórę wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej. Przetnij przeponę, aby otworzyć klatkę piersiową i włóż igłę o wymiarach 20 na 25 milimetrów do lewej komory.Natychmiast otwórz prawe przedsionek nożyczkami i przelej 50 mililitrów wstępnie schłodzonego 100-milimolowego PBS przy natężeniu przepływu pięciu mililitrów na minutę. Gdy cały PBS zostanie dostarczony, perfaktor przelać 100 mililitrami zimnego 4% paraformaldehydu. Kiedy cały utrwalacz zostanie dostarczony, usuń mózg z czaszki i utrwal tkankę na noc w świeżym 4% paraformaldehydzie.Następnego ranka umieść próbkę w 40 mililitrach 30% sacharozy w 100 milimolowym PBS w 50-mililitrowej probówce na około trzy dni, aż mózg osiądzie na dnie probówki, zanim zamrozisz tkankę mózgową w metylobutanolu na dwie minuty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po zamrożeniu użyj kriostatu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i cienkiego pędzla, aby uzyskać skrawki koronalne o grubości 50 mikronów. Po uzyskaniu wszystkich skrawków przykryj próbki 300 mikrolitrami podłoża zapobiegającego blaknięciu i połącz je z 22 50-mililitrowymi szkiełkami nakrywkowymi.Po wyschnięciu podłoża należy zobrazować skrawki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Siedem dni po wstrzyknięciu lentiwirusa, obrazy koronalnego wycinka mózgu szczura ujawniają znaczącą obecność sygnałów EcoHIV-EGFP w całej tkance mózgowej, zwłaszcza w korze i zakręcie zębatym hipokampa. Podwójne znakowanie za pomocą sond Iba1 i EcoHIV-EGFP dostarcza mocnych dowodów na to, że mikroglej jest dominującym typem komórek zawierających ekspresję EcoHIV w mózgu.Osiem tygodni po zakażeniu, zwierzęta, którym wstrzyknięto EcoHIV, wykazują względną niewrażliwość na manipulację interwałem między bodźcami, o czym świadczy stosunkowo bardziej płaska funkcja interwału w porównaniu z kontrolami z solą fizjologiczną. Ponadto szczury, którym wstrzyknięto EcoHIV, wykazują głębokie zmiany w morfologii kolców dendrytycznych, o czym świadczy zwiększona względna częstość występowania krótszych kolców dendrytycznych o zwiększonych średnicach głowy i szyi w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Stężenie i miareczkowanie pożywki kondycjonalnej przed wstrzyknięciem stereotaktycznym ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia spójnych i powtarzalnych wyników we wszystkich eksperymentach.To specyficzne regionalne stereotaktyczne wstrzyknięcie EcoHIV zapewnia skuteczne zakażenie wirusem HIV w mózgu i powoduje deficyty przetwarzania czasowego u szczurów. Wykorzystanie stereotaktycznych zastrzyków HIV u szczurów w celu rozszerzenia modelu infekcji EcoHIV stanowi kluczową okazję do odpowiedzi na nowe pytania związane z neurowirusem HIV.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Postnatalny model niedotlenienia i niedokrwienia mózgu u szczura jest uznanym modelem ludzkiej noworodkowej encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej (HIE). W niniejszym artykule opisujemy model HIE u postnatalnych szczurząt.

Model niedotlenienia i niedokrwienia mózgu w perinatalnym niedokrwieniu

Ten film demonstruje procedurę wstrzykiwania chimerycznych wirusów HIV do kory mózgowej szczura, gdzie RNA wirusa integruje się z genomem gospodarza, replikuje się i rozprzestrzenia, aby ustalić aktywne zakażenie wirusem HIV w modelu eksperymentalnym.

Ustalenie aktywnego zakażenia wirusem HIV w modelu szczurzym

Encefalopatia wcześniaków obejmuje nieprawidłowości ośrodkowego układu nerwowego związane z uszkodzeniem spowodowanym przedwczesnym porodem. W niniejszym raporcie opisano klinicznie istotny szczurzy model przejściowego ogólnoustrojowego niedotlenienia i niedokrwienia w macicy oraz podawania lipopolisacharydów owodniowych (LPS), który naśladuje zapalenie błon płodowych i związanego z tym wpływu bodźców zakaźnych i niedostatecznej perfuzji łożyska na rozwój OUN.

Modelowanie encefalopatii wcześniaków za pomocą prenatalnej hipoksji-niedokrwienia lipopolisacharydem wewnątrzowodniowym u szczurów

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na reprodukcję rozległej demielinizacji istoty szarej obu półkul korowych u dorosłych samców szczurów Dark Agouti. Metoda polega na domózgowym wszczepieniu cewnika, subklinicznej immunizacji przeciwko glikoproteinie mielinowych oligodendrocytów oraz domózgowej iniekcji prozapalnej mieszaniny cytokin przez wszczepiony cewnik.

Szczurzy model rozległej demielinizacji kory mózgowej indukowanej przez domózgowe wstrzyknięcie cytokin prozapalnych

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia immunokompetentnego mysiego modelu infekcji ośrodkowego układu nerwowego ICR (Institute of Cancer Research), aby pokazać rozwój neuropatii. Monitorowanie ostrych wirusowych zaburzeń encefalitycznych za pomocą identycznych wyników choroby można przeprowadzić w celu wykazania neuropatii wywołanej wirusem dengi in vivo.

Mysi model ostrej choroby podobnej do wirusowego zapalenia mózgu wywołanej wirusem dengi

Celem tego badania jest stworzenie i walidacja modelu zwierzęcego do badań w fazach odzyskiwania i następstwa niedokrwienia mózgu poprzez testowanie zawału mózgu i funkcji sensomotorycznych po okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) po 1-90 dniach u szczurów.

Model przedkliniczny do oceny regeneracji mózgu po ostrym udarze mózgu u szczurów

Tutaj prezentujemy hydrofobową metodę oczyszczania tkanek, która pozwala na oglądanie docelowych cząsteczek jako części nienaruszonych struktur mózgu. Technika ta została teraz zwalidowana dla kontroli F344/N i transgenicznych szczurów HIV-1 obu płci.

Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki mózgowej szczura

Pokrwawiąca wodogłowie przedwczesnego (PHHP) można modelować u noworodków szczurów poprzez połączenie zapalenia chorioamnionitisu i krwotoku wewnątrzkomorowego. Połączenie tych wydarzeń prenatalnych i poporodowych wiernie oddaje kliniczne cechy PHHP, w tym makrocefalię, brzuszną omegę oraz podwyższone ciśnienie wewnątrzczaszkowe, przez całe życie.

Modelowanie pokrwaconego wodogłowia przedwczesnego u szczurów

Ten protokół opisuje, w jaki sposób połączenie infekcji EcoHIV z myszami Tmem119-EGFP oferuje cenny system biologiczny do badania zmian mikrogleju i rezerwuarów wirusa w modelach gryzoni zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV.

Identyfikacja komórek zakażonych ekoHIV u myszy transgenicznych manipulowanych mikroglejem

W artykule przedstawiono protokół indukcji unikalnego szczurzego modelu choroby afektywnej dwubiegunowej, który obejmuje zarówno zachowania podobne do manii, jak i depresyjne.

Opracowanie modelu szczura dla choroby afektywnej dwubiegunowej

Poznaj model infekcji mózgu EcoHIV u szczurów do badań nad zaburzeniami neurokognitywnymi związanymi z HIV. Metoda obejmuje pakowanie wirusa, stereotaktyczne wstrzyknięcie i analizę mikrogleju.

Szczurzy model infekcji mózgu EcoHIV

Przeglądaj więcej filmów