Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach

Metoda ta dostarcza odpowiedzi na dzisiejsze wymagające pytania biologiczne. Z eksperymentu FPOP w komórce możemy badać interakcje białko-ligand, miejsca interakcji białko-białko i regiony zmian konformacyjnych. Zaletą tej technologii jest zastosowanie zautomatyzowanej sześciodołkowej platformy IC-FPOP opartej na płytkach, która umożliwia hodowlę komórek i przeprowadzanie badań FPOP w komórkach bezpośrednio przy laserze.

Metoda ta może być stosowana w przemyśle farmaceutycznym i biotechnologicznym, a także w głównych instytutach akademickich i klinicznych, zwłaszcza przez badaczy biologicznych na uniwersytetach zajmujących się dynamiką białek. Aby rozpocząć, odkręć inkubator platformowy od stopnia pozycjonowania i odłącz przewody temperatury, gazu i nawilżacza. Spryskaj inkubator 70% etanolem i umieść go w kapturze do hodowli komórkowych.

Wyjmij sześciodołkową płytkę z inkubatora platformowego, zabezpiecz oryginalną pokrywę płytki i potwierdź zbieżność komórek za pomocą mikroskopu, a następnie umieść sześciodołkową płytkę ze zbiegającymi się komórkami z powrotem w inkubatorze platformowym wewnątrz okapu do hodowli komórkowych. Włóż trzy wstępnie przycięte rurki Tygon do każdej studzienki przez wbudowane porty, spłukując rurki ze ściankami studni i zabezpiecz je niestandardowymi pierścieniami wydrukowanymi w 3D. Przygotuj skrypt oprogramowania integracyjnego do wycofania pompy.

Użyj jednej pompy perystaltycznej, aby całkowicie usunąć media komórkowe ze wszystkich sześciu studzienek. Zalać rozpuszczalniki w każdym kanale pozostałych trzech pomp perystaltycznych, a następnie wlać nadtlenek wodoru i bufor hartowniczy w odpowiednich naprzemiennych probówkach, aż odczynniki dotrą do portów inkubatora. Upewnij się, że wiązka laserowa została prawidłowo ustawiona pod kątem i dociera do inkubatora bez przeszkód.

Sprawdź energię lasera za pomocą zewnętrznego czujnika. Przygotuj skrypt oprogramowania integracyjnego do infuzji pompy po potwierdzeniu wyrównania wiązki. Wlej 200 milimolowy nadtlenek wodoru w ilości 35 mililitrów na minutę do pierwszej studzienki.

Naciśnij przycisk start w oprogramowaniu lasera po pięciu sekundach, aby wyzwolić impuls po 11 sekundach na timerze. Wlej 125 milimolowy roztwór hartowniczy w ilości 35 mililitrów na minutę do pierwszego dołka natychmiast po impulsie laserowym. Ręcznie przesuń etap pozycjonowania, aby wyrównać następną studzienkę z wiązką laserową i powtórz proces dla wszystkich dołków.

W kapturze do hodowli komórkowych użyj skrobaka do komórek, aby przenieść komórki z każdej studzienki do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki w temperaturze 1 200 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu do lizy RIPA.

Przenieś komórki do pojedynczych rurek polipropylenowych o pojemności 1,2 mililitra. Błyskawiczne zamrożenie wszystkich próbek w ciekłym azocie i umieszczenie ich w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni do czasu użycia. Aby zlokalizować modyfikacje FPOP, przeanalizuj strawiony lizat komórkowy za pomocą analizy tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej, a następnie oblicz zakres modyfikacji.

Aby potwierdzić, że warunki panujące w inkubatorze platformy są wystarczające do hodowli komórek na platformie laserowej, GCaMP2 poddano przejściowej transfekcji do HEK293T, a skuteczność transfekcji dla obu płytek oceniono za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Przeprowadzono test lucyferazy w celu ilościowego określenia skuteczności transfekcji. Modyfikacje FPOP w HEK293T komórkach znakowanych w systemie przepływu porównano z tymi znakowanymi w inkubatorze platformowym.

Inkubator platformowy przewyższał system przepływowy zarówno pod względem liczby zmodyfikowanych białek, jak i całkowitego pokrycia FPOP w tych białkach. W układzie przepływowym wykryto dwa zmodyfikowane peptydy, które dostarczyły ograniczonych informacji strukturalnych. Jednak w inkubatorze platformy wykryto pięć zmodyfikowanych peptydów obejmujących sekwencję aktyny.

Przedstawiono tutaj tandemowe widma MS aktyny ze zmodyfikowaną proliną w obu układach i niezmodyfikowanym peptydem aktyny. Zmodyfikowane pozostałości FPOP w próbkach inkubatora platformowego zawierały 12 zmodyfikowanych pozostałości, trzy zmodyfikowane pozostałości w systemie przepływowym i jedną nakładającą się zmodyfikowaną pozostałość. Analiza LC-MS MS wykazała, że 792 białka zmodyfikowano metodą FPOP in vivo w inkubatorze platformowym w porównaniu z 545 białkami zmodyfikowanymi za pomocą systemu przepływowego.

Konieczne jest utrzymywanie komórek w sterylnych warunkach. Zawsze wkładaj inkubator platformowy do sterylnego okapu do hodowli komórek, aby włożyć wszystkie niezbędne sześciodołkowe płytki, rurki i pierścienie. Zapewnia to integralność eksperymentu.