Name: Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę FPOP w żywych komórkach przy użyciu inkubatora platformowego z ruchomym stolikiem XY. Technika ta umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe badanie struktury białek i ich interakcji w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z NIH R01 GM128983-01.

<ol><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+%28FPOP%29%3A+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis%3A+Fundamentals+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).</li>
<li>Li, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+with+mass+spectrometry+in+protein+therapeutics+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development.</a> Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+Labeling+with+an+%CE%B1%2C%CE%B2-Unsaturated+Carbonyl+Scaffold+for+Studying+Protein+Structure+and+Interactions+by+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent Labeling with an α,β-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).</li>
<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Flash+Photolysis+of+Hydrogen+Peroxide+to+Oxidize+Protein+Solvent-Accessible+Residues+on+the+Microsecond+Timescale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li>
<li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+%28FPOP%29+for+Higher+Order+Structure+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li>
<li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+generated+by+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+reflect+the+native+conformations+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins.</a> Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).</li>
<li>Hambly, D., Gross, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photochemical+oxidation+to+locate+heme+binding+and+conformational+changes+in+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).</li>
<li>Yan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+%28FPOP%29+maps+the+epitope+of+EGFR+binding+to+adnectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Binding+Interface+of+VEGF+and+a+Monoclonal+Antibody+Fab-1+Fragment+with+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+%28FPOP%29+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).</li>
<li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li>
<li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li>
<li>Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+in+a+Platform+Incubator+with+a+Movable+XY+Stage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).</li>
<li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator-mRNA+delivery%3A+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy.</a> The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).</li>
<li>Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfate+Radical+Anion+as+a+New+Reagent+for+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).</li>
<li>Xu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+Radical-Mediated+Modification+of+Proteins+as+Probes+for+StructuralProteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews.+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics.</a> Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li>
<li>Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+Biological+Interactions+with+In+Vivo+Protein+Footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting.</a> Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).</li>
<li>Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Photochemical+Oxidation+of+Protein+Footprints+Faster+than+Protein+Unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).</li>
<li>Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+Applicability+of+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+across+Multiple+Eukaryotic+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych. Przedstawione w niniejszym dokumencie badania są związane z niżej wymienionym zgłoszeniem patentowym: Nietymczasowy numer zgłoszenia patentowego w USA: 17/042,565 Tytuł: "Urządzenie i metoda oznaczania fałdowania białek" Numer dowodu UMB: LJ-2018-104 UMass Nr ref.: UMA 18-059.

Białka wykonują większość pracy w żywych komórkach. Biorąc pod uwagę to znaczenie, potrzebne są szczegółowe dane dotyczące funkcji białek i struktury wyższego rzędu (HOS) w środowisku komórkowym, aby pogłębić zrozumienie zawiłości w większych kompleksach i reakcjach enzymatycznych w komórkach, a nie w systemach oczyszczonych. W tym celu przyjęto metodę drukowania stóp z białkami rodnikowymi hydroksylowymi (HRFP) o nazwie In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). Większość badań FPOP przeprowadzono in vitro w stosunkowo czystych układach białkowych, co wyraźnie kontrastuje z zatłoczonym środowiskiem molekularnym, które wpływa na interakcje wiążące i dynamikę konformacji białek. W rezultacie istnieje przepaść między wynikami eksperymentów in vitro 18 a tymi, które zostałyby uzyskane w rzeczywistym środowisku komórkowym. Aby wypełnić lukę między wyidealizowanymi warunkami eksperymentu FPOP in vitro a złożoną naturą komórki, opracowano nową, zautomatyzowaną, sześciodołkową platformę FPOP opartą na płytkach komórkowych. Ta nowatorska technologia FPOP jest w stanie zidentyfikować i scharakteryzować te gatunki molekularne oraz śledzić ich dynamiczne interakcje molekularne zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym. Ta nowa platforma nazywa się Inkubator Platformy z Ruchomym Stopniem XY (PIXY).
FPOP został z powodzeniem wykorzystany do scharakteryzowania informacji strukturalnych w proteomie. Jednak każda technika biologiczna ma pewne ograniczenia, które wymagają dalszej poprawy. Podczas fotolizy laserowej i do skutecznego wygaszania nieprzereagowanych rodników hydroksylowych potrzebne są specjalne odczynniki. Separacja strawionych peptydów może wymagać dużej ilości czasu, aby zmaksymalizować informacje strukturalne. To bogactwo informacji może również wymagać obszernej kwantyfikacji podczas analizy danych po stwardnieniu rozsianym1. Inkubator platformowy, w tym urządzenia peryferyjne potrzebne do hodowli komórek i IC-FPOP na platformie laserowej, wiąże się z dużymi kosztami, które mogą być niewykonalne dla niektórych laboratoriów. Wraz z postępami, solidne oprogramowanie i narzędzia analityczne powinny jeszcze bardziej rozwinąć tę technikę; Niektóre z nich zostały zaprezentowane w tym badaniu. Obecne badania w tym inkubatorze platformowym przeprowadzono na komórkach HEK293T i C. elegans. Wykazano, że metoda IC-FPOP jest kompatybilna z szeroką gamą linii komórkowych, w tym z komórkami jajnika chomika chińskiego (CHO), Vero, MCF-7 i MCF10-A19. Ponieważ ogólna metoda IC-FPOP jest translowana na tę statyczną platformę, te linie komórkowe powinny być również możliwe do badania przy użyciu PIXY.
IC-FPOP wykorzystujeH2O2do oksydacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych aminokwasów dostępnych dla rozpuszczalników, aby następnie dalej rozróżniać interakcje białek, strukturę i efekty metaboliczne w żywotnych komórkach, co jest istotne w zapewnieniu kontekstu biologicznego. Przed eksperymentem IC-FPOP konieczne jest potwierdzenie, że komórki są żywotne po dodaniuH2O2. Badania żywotności komórek wykazały, że komórki były żywotne w obecności stężeńH2O2do 200 mM 13. Ważne jest również, aby upewnić się, żeH2O2jest podawany w końcowym stężeniu 200 mM bezpośrednio na komórki po usunięciu pożywki. Niecałkowite usunięcie pożywki do hodowli komórkowych spowoduje różne stężeniaH2O2. W porównaniu z warunkami standardowymi, wydłużenie czasu inkubacji do 10 sekund wraz ze zwiększeniem stężeniaH2O2doprowadziło do zwiększenia liczby białek modyfikowanych przez IC-FPOP w inkubatorze platformowym. Konieczne jest zalanie pomp perystaltycznych przed użyciem, aby upewnić się, że pompy działają prawidłowo, a ciecz jest rozpraszana. Niezastosowanie się do tego może spowodować powstawanie pęcherzyków powietrza w przewodach, niewystarczającą objętośćH2O2do zanurzenia komórek i/lub niewystarczającą objętość roztworu hartującego.
Kolejnym problemem, który może się pojawić, są niechciane opóźnienia w systemie. Przykładem tego jest proces weryfikacji otrzymanych poleceń dla systemów pompowych, który dodaje znaczne opóźnienia rzędu 1000 lub więcej milisekund za pomocą oprogramowania integracyjnego. Ten problem można rozwiązać, minimalizując komunikację z pompami podczas eksperymentu i używając wstępnie ustawionych poleceń z wyprzedzeniem tak bardzo, jak to możliwe.
W przyszłości celem PIXY jest wyprodukowanie w pełni zautomatyzowanego i zintegrowanego systemu. Oprócz pomp perystaltycznych wyzwalanie impulsu laserowego będzie zautomatyzowane. Nowy system pozycjonowania zostanie również wykorzystany do szybkiego ruchu inkubatora platformowego w celu zwiększenia prędkości i dokładności. Wszystkie komponenty systemu będą nadal programowane przy użyciu oprogramowania integracyjnego w celu dalszego zwiększenia przepustowości.

Techniki śladowania białek mogą ujawnić szczegółowe informacje na temat organizacji białek. Te podstawowe techniki oparte na biologii strukturalnej MS są składnikiem zestawu narzędzi spektrometrii mas. Metody te badają strukturę wyższego rzędu białek (HOS) i synergię poprzez znakowanie kowalencyjne1,2,3,4. Szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP) wykorzystuje rodniki hydroksylowe do oksydacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych aminokwasów dostępnych w rozpuszczalniku5,6 (Tabela 1). Metoda wykorzystuje laser excimerowy o długości fali 248 nm do fotolizy nadtlenku wodoru (H2O2) w celu wytworzenia rodników hydroksylowych. Teoretycznie 19 z 20 aminokwasów może być modyfikowanych oksydacyjnie, a Gly jest jedynym wyjątkiem. Jednak ze względu na różne szybkości reaktywności aminokwasów z rodnikami hydroksylowymi, eksperymentalnie zaobserwowano modyfikację tylko ich podzbioru. Mimo to metoda ta ma potencjał do analizy na całej długości sekwencji białka5. FPOP modyfikuje białka w skali mikrosekundowej, co czyni go przydatnym w badaniu słabych oddziaływań z szybkimi wskaźnikami. Dostępność rozpuszczalnika zmienia się po związaniu liganda lub zmianie konformacji białka, dlatego siła metody polega na porównaniu wzorca znakowania białka w wielu stanach (tj. bez ligandu w porównaniu z wiązanym ligandem). W rezultacie, FPOP odniósł sukces w identyfikacji miejsc interakcji białko-białko i białko-ligand oraz regionów zmian konformacyjnych7,8,9,10. Metoda FPOP została rozszerzona z badania oczyszczonych układów białkowych na analizę wewnątrzkomórkową. In-cell FPOP (IC-FPOP) może oksydacyjnie modyfikować ponad tysiąc białek w komórkach, aby dostarczyć informacji strukturalnych w całym proteomie11,12. Konwencjonalna platforma IC-FPOP wykorzystuje system przepływu do przepływu komórek pojedynczym plikiem obok wiązki laserowej. Opracowanie tego systemu pozwoliło poszczególnym komórkom na równą ekspozycję na promieniowanie laserowe. Doprowadziło to do 13-krotnego wzrostu liczby białek znakowanych oksydacyjnie12. Ograniczeniem systemu przepływu jest jednak długość eksperymentu z pojedynczą próbką, składającego się z 10-minutowego interwału napromieniania, podczas którego zachodzi modyfikacja, oraz dodatkowego 10-minutowego cyklu mycia. Ograniczenia czasowe IC-FPOP sprawiają, że nie nadaje się on do badania krótkożyciowych produktów pośrednich zwijania białek lub zmian zachodzących między sieciami interakcji w biochemicznych kaskadach sygnalizacyjnych. To ograniczenie czasowe zainspirowało do zaprojektowania nowej platformy IC-FPOP wyposażonej w wyższą przepustowość.
Aby dokładnie zmierzyć strukturę białka wyższego rzędu w natywnym środowisku komórkowym, nowy projekt pozwala na przeprowadzenie hodowli komórkowej bezpośrednio na platformie laserowej, co umożliwia IC-FPOP wysoką przepustowość. Taka konfiguracja pozwala również na zminimalizowanie zakłóceń w środowisku komórkowym, w przeciwieństwie do IC-FPOP wykorzystującego przepływ, w którym przylegające komórki muszą zostać usunięte z podłoża. Nowa platforma pozwala na występowanie IC-FPOP w sterylnym systemie inkubacji przy użyciu CO2 i górnej komory stopnia z kontrolowaną temperaturą, przy jednoczesnym wykorzystaniu skonfigurowanej optyki lustrzanej do prowadzenia wiązki laserowej, systemu pozycjonowania ruchu XY oraz pomp perystaltycznych do wymiany chemicznej. Nowa platforma do przeprowadzania IC-FPOP nosi nazwę Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W PIXY IC-FPOP przeprowadza się na komórkach ludzkich hodowanych na płytkach sześciodołkowych w komorze inkubatora platformowego. W tej konfiguracji wiązka laserowa jest odbijana w dół na płytkę za pomocą luster kompatybilnych z wiązką, ponieważ stopień pozycjonujący, który utrzymuje inkubator, jest przesuwany w płaszczyźnie XY, więc wiązka laserowa jest strategicznie ustawiona, aby naświetlać tylko jedną studnię na raz. Badania walidacyjne pokazują, że IC-FPOP może być wykonywany szybciej w PIXY niż w systemie przepływowym i prowadzi do zwiększonych modyfikacji aminokwasów na białko. Rozwój tej nowej platformy IC-FPOP będzie opierał się na wiedzy, którą można uzyskać z eksperymentów komórkowych13.

<table><tbody><tr><td>Pompy perystaltyczne Ismatec Reglo ICC</td><td>Cole-Palmer</td><td>122270050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mocowanie lusterka kinematycznego do &Oslash; 2" Optyka</td><td>Thor Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X trypsyna&minus; EDTA</td><td>Corning</td><td>AB00490-00005</td><td></td></tr><tr><td>50,0 mm 248nm 45&deg;, ekscymerowe lustro liniowe</td> lasera <td>Edmond Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton, klasa HPLC</td><td>Acetonitryl Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>z 0,1% kwasem mrówkowym (v / v), klasa LC / MS</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC Kolumna pułapki C18 klasy M, 100 cali, 5 i mikro; m, 180 i mikro; m x 20 mm, 2G, V/M, 1/opk</td><td>Waters</td><td>23275</td><td>inne instrumenty o wysokiej rozdzielczości (np. Q exactive Orbitrap lub Orbitrap Fusion) mogą być używane</td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class System</td><td>Waters</td><td>A53225</td><td></td></tr><tr><td>Afinia H480 Drukarka 3D</td> <td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pompa powietrza</td><td>OKOlabs</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Magazyn naukowy</td><td>#63-120</td><td></td></tr><tr><td>Aqua 5 & mikro; m C18 125 i Aring; materiał opakowaniowy</td><td>Dwutlenek węgla Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>OKOlabs</td><td>MadMotor&reg;-UHV</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>złącza (Y PP 1/16" i 1/16x1/8")</td><td>Cole-Palmer</td><td>116891000</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne wycieraczki</td><td>do zadań Fisher Scientific</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreiotol (DTT)</td><td>AmericanBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO, bezwodny</td><td>invitrogen</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Corning</td><td>SK-78001-82</td><td></td></tr><tr><td>EX350 laser excimerowy</td><td>GAM Laser PI89900</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>SK-12023-78</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, klasa LC / MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>ilość 4 L nie jest konieczna</td></tr><tr><td>HEK293T komórek</td><td>Paul Shapiro Lab (University of Maryland, Baltimore)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nawilżacz</td><td>OKOlabs</td><td>Nano-LPMW stopień</td><td></td></tr><tr><td>HV3-2 ZAWÓR</td><td>Hamilton</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>ACROS Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LABVIEW Professional 2018</td><td>National Instruments</td><td>86728</td><td></td></tr><tr><td>System pozycjonowania MadMotor i kontrolery</td><td>Mad City Labs</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>wystarczy dowolna marka</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>H301-T Unit-BL-PLUS</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Dimethylthiourea (DMTU)</td><td>ACROS Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etap nanopozycyjny</td><td>Mad City Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-tert-butyl-&alfa;-fenylonitron (PBN)</td><td>ACROS Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OKO Dotykowy system monitorowania</td><td>OKOlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometr masowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>7Z02936</td><td></td></tr><tr><td>PE50-C Miernik energii piroelektrycznej</td><td>Ophir Optronics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA Pierce Rapid Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteaza trypsyny Pierce, MS Grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna nukleaza Pierce do lizy komórek</td><td>Manometr Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>OKOlabs</td><td>Filtr OKO-AIR-PUMP-BL</td><td></td></tr><tr><td>PTFE</td><td>OKOlabs</td><td>CO2-UNIT-BL</td><td></td></tr><tr><td>Sześć pierścieni z filamentem PLA 33 mm</td> <td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sterylny inkubator</td><td>Jednostka temperatury OKOlabs OKOlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Thermo Scientific <td></td></tr><tr><td>Pierce RIPA</td><td>Buffer Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>TiNKERcad</td> <td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>dowolna 30% nadtlenek wodoru jest wystarczająca</td></tr><tr><td>rurka (Tygon 3.18 i 1.59 ID)</td><td>Cole-Palmer</td><td>177350250</td><td></td></tr><tr><td>Woda z 0,1% kwasem mrówkowym (v / v), klasa LC / MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td>4 L ilość nie jest konieczna</td></tr><tr><td>Woda, LC / MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>KM200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>186007496</td><td></td></tr></tbody></table>

inkubator platformowy z ruchomym stolikiem xy: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Szybkie Fotochemiczne Utlenianie Białek (FPOP) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) stało się nieocenionym narzędziem w proteomice strukturalnej do badania interakcji białek, struktury i dynamiki konformacji białek w funkcji dostępności rozpuszczalników. W ostatnich latach zakres FPOP, techniki drukowania stóp z hydroksylowo-rodnikowym białkiem (HRPF), został rozszerzony o znakowanie białek w żywych hodowlach komórkowych, zapewniając środki do badania interakcji białek w zawiłym środowisku komórkowym. Modyfikacje białek w komórkach mogą dostarczyć informacji na temat zmian strukturalnych wywołanych ligandami lub zmian konformacyjnych towarzyszących tworzeniu kompleksów białkowych, a wszystko to w kontekście komórkowym. Ślad białkowy został osiągnięty przy użyciu zwykłego systemu opartego na przepływie i lasera excimerowego KrF o długości fali 248 nm w celu uzyskania rodników hydroksylowych poprzez fotolizę nadtlenku wodoru, co wymaga 20 minut analizy dla jednej próbki komórki. Aby ułatwić eksperymenty FPOP z rozdzielczością czasową, po raz pierwszy wykorzystano nową, 6-dołkową platformę IC-FPOP opartą na płytkach. W obecnym systemie pojedynczy impuls laserowy naświetla jedną całą studzienkę, co skraca ramy czasowe eksperymentu FPOP, co skutkuje 20 sekundami czasu analizy, co stanowi 60-krotny spadek. Ten znacznie skrócony czas analizy umożliwia badanie mechanizmów komórkowych, takich jak kaskady sygnalizacji biochemicznej, fałdowanie białek i eksperymenty różnicowe (tj. wolne od leków vs. związane z lekiem) w sposób zależny od czasu. To nowe oprzyrządowanie, nazwane Platformowym Inkubatorem z Ruchomym Stopniem XY (PIXY), pozwala użytkownikowi na przeprowadzanie hodowli komórkowych i IC-FPOP bezpośrednio na stole optycznym za pomocą inkubatora platformowego z kontrolą temperatury,CO2 i wilgotności. Platforma zawiera również stolik pozycjonujący, pompy perystaltyczne i zwierciadlaną optykę do prowadzenia wiązki laserowej. Warunki IC-FPOP, takie jak konfiguracja optyki, natężenia przepływu, transfekcje przejściowe i stężenieH2O2 w PIXY, zostały zoptymalizowane i zrecenzowane. Automatyzacja wszystkich elementów systemu ograniczy manipulację człowieka i zwiększy przepustowość.

Aby potwierdzić, że warunki panujące w inkubatorze platformy są wystarczające do hodowli komórkowej na platformie laserowej, do komórek HEK293T przeprowadzono przejściową transfekcję GCaMP2, a następnie oceniono wydajność transfekcji dla obu płytek za pomocą obrazowania fluorescencyjnego (Rycina 4A). GCaMP2 jest fluorescencyjnym białkiem sensorowym wapnia, wykorzystywanym jako genetycznie kodowany wewnątrzkomórkowy wskaźnik wapnia. Jest to fuzja zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) oraz białka wiążącego wapń, kalmoduliny. W celu ilościowego określenia wydajności transfekcji przeprowadzono test lucyferazowy na komórkach HEK 293 transfekowanych plazmidem prl-TK (Rycina 4B). Wyniki te wskazują, że inkubator platformy przewyższył skutecznością inkubator standardowy, wykazując 1,13-krotny wzrost wydajności transfekcji, co stanowi ilościowy punkt odniesienia dla optymalnego środowiska hodowli komórkowej.
Modyfikacje FPOP w komórkach HEK293T znakowanych w systemie przepływowym porównano z modyfikacjami w komórkach znakowanych w inkubatorze platformowym; wykazano, że inkubator platformowy przewyższa system przepływowy zarówno pod względem liczby zmodyfikowanych białek (Rycina 5)&#160;, jak i całkowitego zakresu FPOP w tych białkach. Liczba białek zmodyfikowanych metodą FPOP uzyskana w inkubatorze platformowym wynosiła około 1051, co stanowi 2,2-krotny wzrost w porównaniu z wynikami uzyskanymi w typowym eksperymencie. Modyfikacje z dwóch powtórzeń biologicznych dla każdego eksperymentu zostały połączone. Ponadto system PIXY zapewnia wyższą przepustowość.
Aby zademonstrować zaletę wyższego stopnia pokrycia modyfikacjami w obrębie białka, lokalizację modyfikacji IC-FPOP określono na poziomie peptydów, a zakres modyfikacji ilościowo oceniono, aby odróżnić wyniki uzyskane dla obu systemów w przypadku aktyny, białka składającego się z 375 aminokwasów. W systemie przepływowym wykryto dwa zmodyfikowane peptydy, co dostarczyło ograniczonych informacji strukturalnych (Rysunek 6A). Jednakże w inkubatorze platformowym wykryto pięć zmodyfikowanych peptydów obejmujących sekwencję aktyny. Tandemowe widma mas wskazują, że reszta Pro322 była zmodyfikowana i wykryta w każdym eksperymencie (Rysunek 6B). Pięć peptydów zmodyfikowanych w próbkach z inkubatora platformowego zawierało dwanaście zmodyfikowanych reszt, podczas gdy w systemie przepływowym zmodyfikowano tylko cztery reszty (Rysunek 6C). Zwiększenie zakresu pokrycia utlenianiem dostarcza więcej informacji strukturalnych dotyczących białka.
Espino i wsp. wykazali możliwość przeprowadzenia metody FPOP in vivo (IV-FPOP) u C. elegans, modelu nicieniowego dla ludzkich stanów chorobowych17. Chociaż IV-FPOP wykonuje się również za pomocą systemu przepływowego, w celu sprawdzenia kompatybilności z nicieniami przetestowano system PIXY. W każdej studzience inkubatora platformy inkubowano około 10 000 nicieni w temperaturze 20 °C. Analiza LC−MS/MS wykazała, że w inkubatorze platformy metodą IV-FPOP zmodyfikowano 792 białka, w porównaniu do 545 białek zmodyfikowanych przy użyciu systemu przepływowego (Rycyna 7). Wyniki te dowodzą, że poza dwuwymiarową kulturą komórkową, ta nowa metodologia jest również kompatybilna z badaniem innych systemów biologicznych, takich jak C. elegans.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig01.jpg" /> 
Rysunek 1. Schemat systemu PIXY. Komponenty systemu: (A) inkubator nadstołowy, (B) system pozycjonowania, (C) pompy perystaltyczne oraz (D) linie perfuzyjne. Pożywka hodowlana jest usuwana z każdej studzienki za pomocą pomp przed wprowadzeniem H2O2 i roztworów gaszących w obliczonych punktach czasowych. Ścieżka lasera do naświetlania pokazana na biało. Przedrukowano za zgodą Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig02.jpg" /> 
Rysunek 2. W pełni zmontowany system PIXY. (A) dotykowy system monitorowania, (B) jednostka dwutlenku węgla, (C) jednostka temperatury, (D) pompa powietrza, (E) nawilżacz, (F) lustra optyczne, (G) inkubator platformowy, (H) stół pozycjonujący, (I) laser ekscymerowy KrF 248nm oraz (J) pompy perystaltyczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig03.jpg" /> 
Rycina 3.&#160;Automatyzacja pomp perystaltycznych. (A) Przykład skryptu poleceń w programie LABVIEW. Opcje poleceń obejmują objętość, szybkość przepływu, pauzy oraz kierunek przepływu. Prędkość, odległość etapu i lokalizacja są obecnie automatyzowane. (B) Czytnik skryptów w programie LABVIEW. Tutaj skrypty poleceń są przesyłane, a następnie naciska się przyciski Run Sequence i START, aby uruchomić pompy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig04.jpg" /> 
Rysunek 4. Wydajność transfekcji komórek HEK. (A) Porównanie średniej intensywności fluorescencji po transfekcji GCaMP2 w standardowym inkubatorze (Kontrola) oraz w inkubatorze nadstołowym (PIXY). Kropki i kwadraty reprezentują poszczególne punkty w studni, w których dokonano pomiaru. (B) Wydajność transfekcji ilościowo określona i zwalidowana przy użyciu innego plazmidu wektora, pRL-TK. Wartość p&#60; 0,005. Przedrukowano za zgodą Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig05.jpg" /> 
Rycina 5. Porównanie białek zmodyfikowanych w systemie przepływowym dla pojedynczej komórki oraz w systemie PIXY. Diagram Venna białek zmodyfikowanych w systemie przepływowym (kolor fioletowy) oraz w systemie PIXY (kolor zielony). Przedrukowano za zgodą autorów: Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig05large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig06.jpg" /> 
Rysunek 6. Lokalizacja modyfikacji IC-FPOP. Porównanie modyfikacji IC-FPOP pomiędzy systemami. (A) Wykres słupkowy utlenionych modyfikowanych peptydów w aktynie w systemie przepływowym (fioletowy) w porównaniu z inkubatorem platformowym (zielony). (B) Widma tandemowej MS aktyny (peptyd 316-326) z modyfikowaną proliną w obu systemach oraz niemodyfikowany peptyd aktyny (C) Pozostałości aktyny modyfikowane metodą FPOP (PDB: 6ZXJ, łańcuch A): 11 zmodyfikowanych pozostałości w inkubatorze platformowym (zielony), 3 zmodyfikowane pozostałości w systemie przepływowym (fioletowy), 1 nakładająca się zmodyfikowana pozostałość (żółty). Przedrukowano za zgodą Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig07.jpg" /> 
Rysunek 7.&#160;Porównanie białek modyfikowanych metodą FPOP w C. elegans przy użyciu przepływu względem PIXY. Stwierdzono 1,5-krotny wzrost liczby białek zmodyfikowanych utleniająco przy zastosowaniu PIXY w porównaniu z systemem przepływowym. Przedrukowano za zgodą Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1. Rozkład modyfikacji przepływu pracy i przesunięcia masy (Da). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/Table 1.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać&#160;tę tabelę.</a>

Nowa platforma statyczna służy do charakteryzowania struktury białek i miejsc interakcji w natywnym środowisku komórkowym, wykorzystując technikę śladu białkowego zwaną szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Metoda ta dostarcza odpowiedzi na dzisiejsze wymagające pytania biologiczne. Z eksperymentu FPOP w komórce możemy badać interakcje białko-ligand, miejsca interakcji białko-białko i regiony zmian konformacyjnych. Zaletą tej technologii jest zastosowanie zautomatyzowanej sześciodołkowej platformy IC-FPOP opartej na płytkach, która umożliwia hodowlę komórek i przeprowadzanie badań FPOP w komórkach bezpośrednio przy laserze.Metoda ta może być stosowana w przemyśle farmaceutycznym i biotechnologicznym, a także w głównych instytutach akademickich i klinicznych, zwłaszcza przez badaczy biologicznych na uniwersytetach zajmujących się dynamiką białek. Aby rozpocząć, odkręć inkubator platformowy od stopnia pozycjonowania i odłącz przewody temperatury, gazu i nawilżacza. Spryskaj inkubator 70% etanolem i umieść go w kapturze do hodowli komórkowych.Wyjmij sześciodołkową płytkę z inkubatora platformowego, zabezpiecz oryginalną pokrywę płytki i potwierdź zbieżność komórek za pomocą mikroskopu, a następnie umieść sześciodołkową płytkę ze zbiegającymi się komórkami z powrotem w inkubatorze platformowym wewnątrz okapu do hodowli komórkowych. Włóż trzy wstępnie przycięte rurki Tygon do każdej studzienki przez wbudowane porty, spłukując rurki ze ściankami studni i zabezpiecz je niestandardowymi pierścieniami wydrukowanymi w 3D. Przygotuj skrypt oprogramowania integracyjnego do wycofania pompy.Użyj jednej pompy perystaltycznej, aby całkowicie usunąć media komórkowe ze wszystkich sześciu studzienek. Zalać rozpuszczalniki w każdym kanale pozostałych trzech pomp perystaltycznych, a następnie wlać nadtlenek wodoru i bufor hartowniczy w odpowiednich naprzemiennych probówkach, aż odczynniki dotrą do portów inkubatora. Upewnij się, że wiązka laserowa została prawidłowo ustawiona pod kątem i dociera do inkubatora bez przeszkód.Sprawdź energię lasera za pomocą zewnętrznego czujnika. Przygotuj skrypt oprogramowania integracyjnego do infuzji pompy po potwierdzeniu wyrównania wiązki. Wlej 200 milimolowy nadtlenek wodoru w ilości 35 mililitrów na minutę do pierwszej studzienki.Naciśnij przycisk start w oprogramowaniu lasera po pięciu sekundach, aby wyzwolić impuls po 11 sekundach na timerze. Wlej 125 milimolowy roztwór hartowniczy w ilości 35 mililitrów na minutę do pierwszego dołka natychmiast po impulsie laserowym. Ręcznie przesuń etap pozycjonowania, aby wyrównać następną studzienkę z wiązką laserową i powtórz proces dla wszystkich dołków.W kapturze do hodowli komórkowych użyj skrobaka do komórek, aby przenieść komórki z każdej studzienki do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki w temperaturze 1 200 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu do lizy RIPA.Przenieś komórki do pojedynczych rurek polipropylenowych o pojemności 1,2 mililitra. Błyskawiczne zamrożenie wszystkich próbek w ciekłym azocie i umieszczenie ich w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni do czasu użycia. Aby zlokalizować modyfikacje FPOP, przeanalizuj strawiony lizat komórkowy za pomocą analizy tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej, a następnie oblicz zakres modyfikacji.Aby potwierdzić, że warunki panujące w inkubatorze platformy są wystarczające do hodowli komórek na platformie laserowej, GCaMP2 poddano przejściowej transfekcji do HEK293T, a skuteczność transfekcji dla obu płytek oceniono za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Przeprowadzono test lucyferazy w celu ilościowego określenia skuteczności transfekcji. Modyfikacje FPOP w HEK293T komórkach znakowanych w systemie przepływu porównano z tymi znakowanymi w inkubatorze platformowym.Inkubator platformowy przewyższał system przepływowy zarówno pod względem liczby zmodyfikowanych białek, jak i całkowitego pokrycia FPOP w tych białkach. W układzie przepływowym wykryto dwa zmodyfikowane peptydy, które dostarczyły ograniczonych informacji strukturalnych. Jednak w inkubatorze platformy wykryto pięć zmodyfikowanych peptydów obejmujących sekwencję aktyny.Przedstawiono tutaj tandemowe widma MS aktyny ze zmodyfikowaną proliną w obu układach i niezmodyfikowanym peptydem aktyny. Zmodyfikowane pozostałości FPOP w próbkach inkubatora platformowego zawierały 12 zmodyfikowanych pozostałości, trzy zmodyfikowane pozostałości w systemie przepływowym i jedną nakładającą się zmodyfikowaną pozostałość. Analiza LC-MS MS wykazała, że 792 białka zmodyfikowano metodą FPOP in vivo w inkubatorze platformowym w porównaniu z 545 białkami zmodyfikowanymi za pomocą systemu przepływowego.Konieczne jest utrzymywanie komórek w sterylnych warunkach. Zawsze wkładaj inkubator platformowy do sterylnego okapu do hodowli komórek, aby włożyć wszystkie niezbędne sześciodołkowe płytki, rurki i pierścienie. Zapewnia to integralność eksperymentu.

platform-incubator-with-movable-xy-stage-new-platform-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje ogólne podejście do przeprowadzania fotokonwersji białek fluorescencyjnych przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Opisujemy procedury fotokonwersji oczyszczonych próbek białek, a także optycznego uwydatniania z użyciem dwóch sond w żywych komórkach z wykorzystaniem mOrange2 i Dronpa.

Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

W tym protokole, kinaza białkowa A (PKA), bioefektor transdukcji sygnału komórkowego, została unieruchomiona na powierzchni nanocząsteczki, mikrowstrzyknięta do cytozolu i aktywowana przez przekonwertowane światło UV z bliskiej podczerwieni (NIR), indukując rozpad włókien naprężeniowych w cytozolu.

Zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Tutaj charakteryzujemy strukturę białek i miejsca interakcji w żywych komórkach za pomocą techniki śladu białkowego, zwanej szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Charakterystyka białek komórkowych za pomocą szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek to nowa technika strukturalnej charakterystyki białek. Różne dodatki rozpuszczalnikowe i ligandy mają różne właściwości wymiatania rodników hydroksylowych. Aby porównać strukturę białka w różnych warunkach, wymagana jest kompensacja w czasie rzeczywistym rodników hydroksylowych powstających w reakcji w celu normalizacji warunków reakcji.

Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek

Poznaj zautomatyzowaną metodę FPOP w żywych komórkach przy użyciu inkubatora platformowego z ruchomym stolikiem XY. Technika ta umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe badanie struktury białek i ich interakcji w komórkach.

Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach

Przeglądaj więcej filmów