Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Nasz protokół zapewnia szybką, powtarzalną i niezawodną metodę generowania bezpośrednich monowarstw pierwotnego nabłonka jelitowego na różnych powierzchniach przy minimalnej ilości zanieczyszczeń. Głównymi zaletami tego protokołu są niskie zużycie pożywki i niskie koszty utrzymania hodowli komórkowych. Jest to szybka metoda wykonywania testów funkcjonalnych i szybkich aplikacji podrzędnych.

Protokół ten zapewni wgląd w badania nad gojeniem się ran, barierą przepuszczalności i migracją przeznabłonkową różnych typów komórek. Model ten może być również przydatny w interakcji gospodarz-patogen, uszkodzonym nabłonku i odkrywaniu leków. Na początek dodaj 200 mikrolitrów roztworu powlekającego do każdego dołka 48-dołkowej płytki i szkiełka komorowego.

Wstępnie inkubuj oba w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Pokryj wkładki błony komórkowej o grubości 0,4 mikrometra 200 mikrolitrami roztworu kolagenu. Inkubować płytkę z wkładkami membranowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie przenieść ją do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny.

Zdezynfekuj uśpioną mysz 70% etanolem, a następnie wypreparuj okrężnicę od odbytnicy do jelita ślepego za pomocą nożyczek i kleszczy. Delikatnie wypłucz kał lodowatym PBS w 10-mililitrowej strzykawce wyposażonej w rurkę do karmienia o rozmiarze 20. Usuń proksymalną okrężnicę i delikatnie wsuń dystalną okrężnicę na rurkę do karmienia o rozmiarze 20.

Zawiąż okrężnicę na końcu rurki jedwabną nicią do szwów 4-0. Odwróć okrężnicę na lewą stronę nad zawiązanym końcem i zawiąż drugi koniec nitką, a następnie odetnij okrężnicę poniżej końcówki rurki do karmienia za pomocą nożyczek chirurgicznych. Delikatnie otworzyć odwiązany koniec odwróconej okrężnicy na końcówce strzykawki o pojemności 1,25 mililitra za pomocą tłoka.

Wsunąć odwiązany koniec odwróconej okrężnicy na strzykawkę i mocno zawiązać go nitką. Włożyć tłok do strzykawki i napompować okrężnicę, aż zacznie wyglądać na surową i bez widocznych zmarszczek. Umieść napompowaną kiełbasę okrężnicy w 15-mililitrowej probówce zawierającej pięć mililitrów roztworu do odzyskiwania komórek na lodzie na 20 minut.

Napompuj i opróżnij okrężnicę raz na pięć minut. Zawiąż napompowaną okrężnicę poniżej końcówki strzykawki za pomocą jedwabnej nici do szwów 4-0. Odetnij kiełbasę okrężnicy z strzykawki i umieść ją w 15-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów 50-milimolowego EDTA na 40 minut.

Obróć rurkę o cztery stopnie Celsjusza. Zastąp roztwór EDTA pięcioma mililitrami buforu do wstrząsania i potrząsaj kiełbasą ręcznie w pozycji pionowej przez dwie minuty. Zdekantować roztwór do wytrząsania do nowej 15-mililitrowej probówki i powtarzać etap wytrząsania, aż do zebrania łącznie 10 mililitrów krypt i buforu do wytrząsania.

Policz liczbę krypt w 20 mikrolitrach zawiesiny pod mikroskopem i rozcieńcz próbkę, aby uzyskać stężenie pięciu krypt na mikrolitr. Odwirować próbkę krypty w temperaturze 400 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W międzyczasie wyjmij 48-dołkową płytkę i wkładki membranowe z inkubatora i umieść je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Odessać roztwór powlekający za pomocą pipety P200 i pozostawić płytkę z lekko przesuniętą pokrywką, aż komórki będą gotowe do powlekania. Po odwirowaniu zawiesiny krypty należy usunąć bufor wstrząsający i ponownie zawiesić nienaruszoną osadkę w trzech mililitrach kompletnego podłoża LWRN. Dodaj 200 mikrolitrów krypt do każdej studzienki wstępnie pokrytej 48-dołkowej płytki i szkiełka komorowego i inkubuj oba w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia odessaj pożywkę i dodaj świeżą pożywkę. Ogólnie rzecz biorąc, komórki stają się zlewające się w ciągu 24 do 48 godzin. W przypadku wkładek błonowych do hodowli komórkowych dodaj 200 mikrolitrów krypt na górze wkładek i 600 mikrolitrów kompletnej pożywki LWRN na dole.

Następnego dnia odessać pożywkę i dodać świeżą pożywkę tylko do górnej komory. Inkubować płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Codziennie mierz przeznabłonkową rezystancję elektryczną za pomocą nabłonkowego woltomierza/omomierza.

Po wyizolowaniu krypt z mysiej okrężnicy i zweryfikowaniu stężenia, zawiesinę krypty zatężono do pięciu krypt na mikrolitr. 48-dołkowe studzienki płytkowe poddano testowi ran od zadrapań po dotarciu do zbiegu komórek. Po 24 godzinach zaobserwowano gojenie się rany, co wskazuje, że posiew był zdrowy i żywotny.

Wyższe wartości poziomu zostały osiągnięte, gdy media zostały zmienione z LWRN na pożywki różnicujące. Zaobserwowano również spadek markerów ISC i wzrost markerów różnicowania, co wskazuje, że zróżnicowane monowarstwy zostały wygenerowane z powodzeniem. Ponadto za pomocą immunofluorescencji wykazano pojawienie się podtypów zróżnicowanych komórek nabłonka hodowanych w różnych warunkach.

Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby upewnić się, że okrężnica nie zostanie pęknięta w żadnym momencie podczas przygotowania i pozostanie napompowana, aby uwolnić krypty w wyjątkowo czystym przygotowaniu. Po utworzeniu monowarstw komórek nabłonka jelitowego 2d możemy przeprowadzić testy immunofluorescencji, zadrapań i przepuszczalności oraz inne dalsze zastosowania. Dostarczy to wiedzy na temat gojenia się ran, migracji różnych typów komórek oraz badań nad naprawą i uszkodzeniem nabłonka.