Name: Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę generowania monowarstw nabłonka jelita grubego myszy z krypt jelitowych do badań nad gojeniem ran i funkcjami barierowymi. Protokół zapewnia niskie zużycie mediów i szybkie zastosowanie eksperymentalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Nagrodę Fundacji Crohna i Zapalenia Jelita Grubego (544599, dla MQ) oraz granty NIH (DK055679, DK089763, DK059888, dla AN). Chcielibyśmy podziękować Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory za ich ciągłą pomoc i dostęp do ich odczynników i protokołów.

Wszystkie procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Przygotowanie odczynników do izolacji krypty i hodowli (przygotowanie w kapturze do hodowli tkankowej)
<ol>
	<li>50 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA): Dodaj 50 ml 0,5 M bulionu do 450 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, bez wapnia (Ca2+) i magnezu (Mg2+), aby przygotować 500 ml. W tym protokole PBS będzie odnosić się do PBS bez wapnia i magnezu, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
	<li>Bufor wstrząsający: Rozpuść 7,4 g sacharozy (43,3 mM) i 5 g sorbitolu (54,9 mM) w PBS, aby przygotować 500 ml.</li>
	<li>Pożywki L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin i Noggin): Uzupełnij Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham's F-12 (DMEM / F12) (780 ml) z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (200 ml), 1x dostępnym w handlu suplementem glutaminy (10 ml), 100 U/ml penicyliny i 100 g / ml streptomycyny (10 ml) i sterylizuj filtrem z filtrem 0,22 μm.
	<ol>
		<li>Pobierz komórki L-WRN przez ATCC, hoduj w kolbach T175 i wybierz przy użyciu Geneticin i Hygromycyny. Nośnik jest wymieniany i zbierany przez 12 dni. 
		UWAGA: Każda partia nośnika jest testowana pod kątem aktywności Wnt za pomocą testu TOPflash Wnt Reporter. W tym przypadku zastosowano protokoły Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory (https://www.umichttml.org/protocols). Linia komórkowa TOPflash HEK 293 jest hodowana do zbiegu w kolbie T75, trypsynizowana i powlekana na 96-dołkowej płytce. Następnego dnia różne rozcieńczenia zebranej pożywki dodaje się do komórek i inkubuje w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia komórki są poddawane lizie, a test lucyferazy świetlika jest wykonywany zgodnie z instrukcjami producenta. Test normalizuje się przy użyciu rekombinowanego Wnt-3A. Pożywkę dzieli się na podwielokrotności o objętości 25 ml w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowuje w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka bazowa: Dla 500 ml uzupełnij Advanced DMEM/F12 (448 ml) z 2x dostępnym w handlu suplementem glutaminy (10 ml), 20 mM HEPES (10 ml), 100 U/ml penicyliny i 100 g/ml streptomycyny (10 ml), 2 mM N-acetylo-L-cysteiny (2 ml), suplementem N2 (10 ml) i suplementem B27 (20 ml), sterylizuj filtrem z filtrem 0,22 μm. Podzielić pożywkę na 25 ml porcji w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Kompletna pożywka LWRN: Połącz 25 ml pożywki LWRN z 25 ml pożywki bazowej i uzupełnij 200 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) (20 μl) i 2x roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (1 ml). Przechowuj cały nośnik w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Kolagen i Laminina: Rozpuść 5 mg proszku w 5 ml wysterylizowanego przez filtr 100 mM kwasu octowego (dodaj 60 μl bulionu kwasu octowego do 9,94 ml wody o czystości cząsteczkowej), aby uzyskać stężenie podstawowe 1 mg / ml. Obracać w temperaturze 4 °C przez 4 godziny i przygotować 100 μl porcji w probówkach o pojemności 0,2 ml. Zamrażać w temperaturze -20 °C. Laminina jest kupowana w stężeniu podstawowym 100 μg/ml.</li>
	<li>Kompletne pożywki bez czynników wzrostu (CMGF-): Suplement Advanced DMEM/F12 (500 ml) z 1x dostępnym w handlu suplementem glutaminy (5 ml), 10 mM HEPES (5 ml), 100 U/ml penicyliny i 100 g/ml streptomycyny (5 ml).</li>
	<li>Pożywki różnicujące: Do 9,2 ml pożywki CMGF- dodaj 200 μl suplementu B27, 100 μl suplementu N2, 20 μl N-acetylo-L-cysteiny, 500 μl pożywki Noggin media12 (wykonanej z komórek produkujących Noggin) i 2 μl EGF, aby uzyskać 10 ml pożywki różnicującej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek, szkiełek komorowych i wkładek do błon do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Powlekanie 48-dołkowych płytek i szkiełek komorowych do powlekania monowarstwy 2D: Użyć roztworu powlekającego, który zawiera lamininę (rozcieńczenie 1:40, patrz tabela materiałów) i kolagen (rozcieńczenie 1:30) w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco, z Ca2+ i Mg2+ (DPBS). Dodać 200 μl roztworu powlekającego do każdej studzienki i wstępnie inkubować szkiełko płytkowo-komorowe w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Powlekanie wkładek błony do hodowli komórkowej 0,4 μm: Rozcieńczyć kolagen w wodzie molekularnej w stosunku 1:30 i dodać 200 μl do każdej wkładki. Przechowywać płytkę zawierającą wkładkę membranową na lodzie w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po 30 minutach inkubacji przechowywać płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 1,5-2 godziny. Wkładki membranowe z poliestru i poliwęglanu dają porównywalne rezultaty. 
	UWAGA: Każdą płytkę do hodowli tkankowej można wysiać (można wykonać skalowanie w górę i w dół) przy użyciu tego protokołu, dostosowując objętość kolagenu/lamininy, aby uzyskać pełne pokrycie powierzchni posiewu.</li>
</ol>
3. Izolacja krypty
UWAGA: Przed rozpoczęciem sekcji, przygotuj płytkę/wkładki membranowe/szkiełko komorowe pokryte kolagenem i/lub lamininą i pozostaw je w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Przygotuj czysty stół warsztatowy i sterylne narzędzia chirurgiczne odpowiednie do operacji, a także komorę bezpieczeństwa biologicznego do hodowli monowarstw 2D. Upewnij się, że wszystkie inne standardowe urządzenia do hodowli jednowarstwowej 2D, takie jak nawilżany inkubator CO2 , wirówki stołowe (utrzymywane w temperaturze 4 °C), mikroskop i pipety (w tym pipety serologiczne) są gotowe.
<ol>
	<li>Użyj myszy C57Bl/6 w wieku 8-12 tygodni. Eutanazja myszy przy użyciu zatwierdzonej metody eutanazji.</li>
	<li>Spryskaj tusze myszy 70% roztworem etanolu (EtOH), aby oczyścić obszar sekcji i usunąć nadmiar EtOH za pomocą chusteczki papierowej. 
	UWAGA: Upewnij się, że odczynniki izolujące krypty (takie jak PBS, 50 mM EDTA, bufor wstrząsowy) są utrzymywane w niskiej temperaturze. Odczynniki te można przygotować dzień wcześniej i można ich używać przez co najmniej 3 miesiące, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C. Należy również upewnić się, że kompletne media LWRN są przechowywane w kąpieli perełkowej/wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Za pomocą czystych nożyczek preparacyjnych i kleszczy wypreparuj okrężnicę od odbytnicy do jelita ślepego. Przytrzymaj koniec jelita grubego za pomocą kleszczy i bardzo delikatnie spłucz kał za pomocą lodowatego PBS w strzykawce o pojemności 10 ml, wyposażonej w rurkę do karmienia 20 G (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Uważaj, aby nie pęknąć okrężnicy.
	<ol>
		<li>Usuń proksymalną okrężnicę. Będzie to część jelita grubego najbliżej połączenia krętniczo-kątniczego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków delikatnie wsuń dystalną okrężnicę na rurkę do karmienia 20 G, wiążąc okrężnicę na końcu rurki za końcówkę jedwabną nicią do szwów 4-0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Odwróć okrężnicę na lewą stronę, używając palców nad zawiązanym końcem i zawiąż drugi koniec jedwabną nicią do szwów 4-0. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij okrężnicę poniżej końcówki rurki do karmienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C,D,E).</li>
	<li>Używając tłoka strzykawki powtórzonej o pojemności 1,25 ml, delikatnie otwórz odwiązany koniec wklęsłej okrężnicy na końcówkę strzykawki powtórzonej o pojemności 1,25 ml. Wsuń odwróconą okrężnicę na koniec strzykawki i mocno zawiąż jedwabną nicią 4-0 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F, G).</li>
	<li>Włożyć tłok do strzykawki i napompować okrężnicę, aby uformować kiełbasę. Napompuj, aż kiełbasa z jelita grubego będzie wyglądać na surową bez widocznych zmarszczek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1H).</li>
	<li>Umieść strzykawkę/okrężnicę w probówce o pojemności 15 ml z 5 ml roztworu do odzyskiwania komórek na lodzie na 20 minut, napompuj i opróżnij okrężnicę raz na 5 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1I). Kiełbasa musi pozostać napompowana podczas inkubacji.</li>
	<li>Zwiąż za pomocą jedwabnej nici do szwów 4-0 poniżej końcówki strzykawki z napompowaną okrężnicą. Odetnij kiełbasę z kolejnej strzykawki i umieść w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 50 mM (2 mM dla jelita cienkiego) EDTA na 40 minut i obracaj w temperaturze 4 °C (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1J,K).</li>
	<li>Zdekantować roztwór EDTA i zastąpić go 5 ml buforu do wstrząsania. Potrząsaj kiełbasą ręcznie w pozycji pionowej (energicznie) przez 2 minuty.</li>
	<li>Przelać roztwór do wytrząsania do nowej probówki o pojemności 15 ml i powtórzyć etap wytrząsania, aby uzyskać łącznie 10 ml krypt w buforze do wytrząsania.</li>
	<li>Pobrać 20 μl zawiesiny krypty na szalkę Petriego i policzyć liczbę krypt pod mikroskopem. Obliczyć stężenie krypty w kryptach/μl. W zależności od stężenia, próbki rozcieńczyć tak, aby uzyskać 5 krypt/μl w momencie powlekania (1000 krypt/cm2).</li>
	<li>Wirować probówkę z izolowanymi kryptami za pomocą wirówki stołowej o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W międzyczasie wyjmij z inkubatora 48-dołkową płytkę/wkładkę/szkiełko komorowe i umieść je w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zassać roztwór powlekający za pomocą P200 i pozostawić płytkę z lekko przesuniętą pokrywką, aż komórki będą gotowe do powlekania.</li>
</ol>
4. Monowarstwa 2D
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowy protokół generowania monowarstw nabłonka jelitowego z kolonoidów 3D, sprawdź protokoły laboratoriów Estes i Kovbasnjuk (7,11).
<ol>
	<li>Usunąć bufor do wytrząsania za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Upewnij się, że pelety są nienaruszone i mogą użyć P1000 do usunięcia resztek płynu. Ponownie zawiesić osad w 3 ml kompletnego podłoża LWRN i pipetować w górę iw dół za pomocą P1000. Dodać 200 μl krypt do każdej studzienki wstępnie pokrytej 48-dołkowej płytki/szkiełka komorowego i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zassaj pożywkę za pomocą P200 i dodaj nową pożywkę. Komórki zlewają się w ciągu 24-48 godzin.</li>
	<li>W przypadku wstawek błonowych do hodowli komórkowych dodać 200 μl krypt (5 krypt/μl) do górnej części wkładek i 600 μl kompletnej pożywki L-WRN do dolnej części. Następnego dnia odessać pożywkę za pomocą P200 i dodawać świeżą pożywkę tylko do górnej komory. Inkubować płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Przeznabłonkowy opór elektryczny (TEER) mierzy się codziennie za pomocą nabłonkowego miernika napięcia / oma (EVOM). 
	UWAGA: Jeśli kultura ma odczyt TEER większy niż 300 Ω.cm2, uważa się, że są one zlewane. Konfluencję osiąga się w ciągu 3-4 dni. Zmieniaj nośniki co 2 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Quiros, M., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+wound-associated+cells+and+mediators+in+orchestrating+gastrointestinal+mucosal+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair.</a> Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).</li>
<li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+organoids+to+study+regenerative+responses+to+intestinal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).</li>
<li>Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+human+gastrointestinal+organoids%3A+principle+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 6(2020).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2Fcolonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+and+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59357(2019).</li>
<li>Cardenas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-+and+three-dimensional+bioengineered+human+intestinal+tissue+models+for+cryptosporidium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium.</a> Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).</li>
<li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+enteroids%3A+New+models+to+study+gastrointestinal+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Nik, A. M., Carlsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+intact+intestinal+epithelium+from+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme.</a> Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Nasz protokół zapewnia szybką, powtarzalną i niezawodną metodę generowania bezpośrednich pierwotnych monowarstw 2D IEC. Jedną z głównych różnic w naszym protokole w porównaniu z wcześniej opublikowanymi protokołami generowania monowarstw nabłonka jelita grubego jest to, że nie tniemy okrężnicy na małe kawałki, aby uwolnić krypty. Zamiast tego dostosowaliśmy protokół oddzielania nabłonka jelitowego od mezenchymy13 poprzez połączenie sił chemicznych i mechanicznych, aby uwolnić krypty w wyjątkowo czystym preparacie (ryc. 2), zapewniając badaczowi idealny materiał do wytworzenia kultur pierwotnych. Nasza metoda izolacji może być również wykorzystana do generowania enteroidów 3D i okrężnic. Ważne jest, aby zliczać krypty za każdym razem, gdy przeprowadzany jest eksperyment, aby znormalizować liczbę krypt, które są platerowane. Zmienne takie jak turgor kiełbasy jelita grubego, szybkość izolacji, wiedza użytkownika mogą wpływać na liczbę izolowanych krypt. Sugerowana koncentracja krypty poszycia wymieniona w protokole jest punktem wyjścia, ale każdy użytkownik, który ma uwzględnić zmienne sterowane przez użytkownika, musi ją zoptymalizować. Zastosowaliśmy tę technikę z samcami i samicami myszy WT w okresie od 8 do 20 tygodni i nie zaobserwowaliśmy większych różnic w przeżywalności komórek, teoretycznie krypty odizolowane od młodszych myszy mają większe szanse na przeżycie. Krypty są pokryte w nadmiarze, ponieważ tylko niewielki procent z nich przyczepia się do powierzchni i przetrwa. Celem jest równowaga, w której jest wystarczająco dużo krypt, aby mieć 50% konfluencji jednego dnia po poszyciu, ale nie za dużo krypt, w których umierające krypty będą miały efekt cytotoksyczny. Pożywki LWRN należy ostrożnie usunąć 24 godziny po poszyciu, aby wyeliminować martwe krypty i zanieczyszczenia, należy to zrobić ostrożnie, aby uniknąć oderwania komórek, które już rosną jako monowarstwa.
Po wstępnym usunięciu pożywki LWRN użytkownik musi zdecydować, czy warunki eksperymentalne wymagają pierwotnych monowarstw IEC, które pozostają bliżej komórek macierzystych i dodania świeżych pożywek LWRN, czy też pożądane jest różnicowanie monowarstwy, zastąpienia pożywką różnicującą. Najważniejszym czynnikiem w tym protokole jest zapewnienie integralności jelita grubego podczas procesu izolacji. Jeśli dojdzie do pęknięcia, kiełbasę można skrócić, aby wyeliminować uszkodzony obszar. Przed włożeniem kiełbasy do EDTA upewnij się, że węzły są tak ciasne, jak to możliwe. Jeśli kiełbasa zostanie opróżniona po inkubacji EDTA, protokół może być kontynuowany z niewielkim lub żadnym wpływem na ogólną wydajność krypty. Jeśli powtórzenie strzykawki nie jest dostępne, do procesu napełniania i opróżniania można również użyć zwykłej końcówki do mikropipety dołączonej do zwykłej strzykawki. Ponadto, jeśli nie jest dostępny żaden roztwór do odzyskiwania komórek, etapy inflacji i deflacji można przeprowadzić w EDTA (2 mM jelito cienkie, 50 mM okrężnicy), ale ta substytucja nie jest zalecana. Jeśli zbieg nie jest wymagany, krypty mogą rosnąć na płytkach pokrytych tylko kolagenem, a nawet na płytkach niepowlekanych. Używaj tylko niepowlekanych pojemników na płytki, nie ma innej opcji, ale komórki nie będą rosły zdrowo, tak jak w płytkach pokrytych kolagenem. Jeśli chodzi o zdrowie i stabilność hodowli, monowarstwy platerowane tworzywem sztucznym są zdrowe przez 4 do 5 dni, podczas gdy monowarstwy platerowane w transwellach mogą być noszone do 8 dni.
Jednym z głównych ograniczeń tej metody jest pożywka komórkowa wymagana do wzrostu monowarstw nabłonka jelita grubego. Ogniwa LWRN są dostępne w ATCC, ale generowanie pożywek kondycjonowanych LWRN jest pracochłonne i wymaga dostępu do spektrometru fluorescencyjnego w celu określenia aktywności Wnt. Podłoża różnicujące wymagają pewnej liczby odczynników, które są dodawane na świeżo przed użyciem, co sprawia, że jest to żmudny proces. Wreszcie, większość z tych odczynników jest kosztowna i łatwo jest je spalić w szybkim tempie. Jeśli laboratorium chce ustalić tę technikę bez wcześniejszej hodowli pierwotnych komórek jelitowych, zdecydowanie zaleca się znalezienie współpracownika/uczelni z doświadczeniem i przeszkolenie jednego z ich członków.
Utrzymanie hodowli 3D może być kosztowne ze względu na koszt podłoża z matrycą błony podstawnej i dużych ilości kondycjonowanych pożywek potrzebnych do hodowli organoidów, ale ma tę zaletę, że wykorzystuje się zmniejszoną liczbę myszy, a wygenerowane struktury mogą być wielokrotnie pasażowane. Enteroidy (pochodzące z jelita cienkiego) są stosunkowo łatwe do wyizolowania i utrzymania, podczas gdy kolonoidy są delikatniejsze, rosną w wolniejszym tempie i mają bardziej ograniczoną zdolność przejścia. Generowanie monowarstw z kolonoidów 3D wymaga nieproporcjonalnie dużej ilości struktur 3D, co sprawia, że tego rodzaju eksperymenty są czasochłonne i kosztowne. Wręcz przeciwnie, bezpośrednie przygotowanie monowarstwy nabłonka jelita grubego jest szybkie i jest szybkim sposobem na uzyskanie wyników. Jedno przygotowanie jelita grubego może wygenerować zlewający się obszar o długości 75 cm2 (10 do 15 ml kondycjonowanej pożywki, wymienia się raz) 2 do 3 dni po posiewie (obszar ten wymagałby 144 dołków koloidów 3D, co oznacza prawie 6 ml Matrigel i ponad 250 ml kondycjonowanej pożywki). Mniejsze zużycie pożywki, niskie koszty utrzymania hodowli komórkowej oraz możliwość wykonywania testów funkcjonalnych i szybkie przetwarzanie to duże zalety monowarstw nabłonka jelita grubego.
Protokół ten jest cennym narzędziem w badaniach biologii komórek nabłonka jelitowego w obszarach takich jak adhezja komórek, polaryzacja i różnicowanie. Daje to przewagę w generowaniu pierwotnych kultur komórkowych z genetycznie zmodyfikowanych myszy (nokaut, nadekspresja, reportery). Pierwotne monowarstwy nabłonka jelitowego umożliwiają łatwy dostęp do powierzchni wierzchołkowej i podstawno-bocznej (po pokryciu na transwellach), umożliwiając badanie przepuszczalności, bariery i migracji przeznabłonkowej różnych typów komórek. Wreszcie, model ten może być przydatny w różnych dziedzinach, takich jak interakcje gospodarz-patogeny, uszkodzenia i naprawa nabłonka oraz odkrywanie leków.

Komórki nabłonka jelitowego (IEC) otaczają jelita, tworząc selektywnie przepuszczalną barierę, która umożliwia wchłanianie składników odżywczych i wody, jednocześnie zapobiegając przedostawaniu się mikroorganizmów i toksyn do organizmu 1. Błona śluzowa jelita składa się z projekcji świetlnych zwanych kosmkami (obecnych tylko w jelicie cienkim) i wgłębień zwanych kryptami. Kosmki i powierzchnia krypt jelita grubego pokryte są zróżnicowanymi komórkami nabłonkowymi, podczas gdy podstawa krypt składa się z komórek macierzystych, które dokonują szybkiej odnowy nabłonka jelitowego, który ma obrót od 3 do 7 dni. Jelitowe komórki macierzyste (ISC) są ważne nie tylko dla utrzymania homeostazy jelitowej, ale także dla odpowiedniej naprawy uszkodzonego nabłonka2.
Badanie biologii nabłonka jelitowego było ograniczone przez brak pierwotnych hodowli komórkowych, a przekształcone linie komórkowe były jedynym dostępnym narzędziem. Linie komórkowe modelu nabłonka jelitowego nie są w stanie dokładnie odtworzyć fizjologii normalnego nabłonka jelitowego. Opracowanie kultur 3D pochodzących z ISC dostarczyło biologom błony śluzowej jelit modeli in vitro, które przypominają warunki błony śluzowej jelit in vivo3. Krypty można łatwo wyizolować z próbek mysich, osadzić w pożywce z matrycą błony podstawnej (np. Matrigel) i hodować w kondycjonowanych pożywkach zawierających Wnt3a, R-spondynę i Noggin, generując struktury 3D znane jako enteroidy (jelito cienkie) lub kolonoidy (jelito grube)4. Enteroidy i kolonoidy są spolaryzowanymi strukturami sferoidalnymi, w których domena wierzchołkowa jest skierowana w stronę wewnętrznego światła, a obszar podstawno-boczny jest w bezpośrednim kontakcie z macierzą zewnątrzkomórkową. Enteroidy i kolonoidy zawierają wszystkie główne zróżnicowane podtypy nabłonka jelitowego, takie jak enterocyty/kolonocyty, Paneth, komórki enteroendokrynne i kubkowe, i pojawiają się w stosunkowo takich samych proporcjach, jak w sekcji jelita, z której zostały wyizolowane5. Mimo że enteroidy i kolonoidy 3D stanowią duży postęp w badaniach nad rozwojem i fizjologią jelit, modele te mają pewne wady, takie jak ograniczony dostęp do wierzchołkowej powierzchni komórek nabłonka (światło) oraz możliwość skalowania kultur w górę lub w dół w celu uzyskania wysokoprzepustowych badań przesiewowych interesujących molekuł. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano protokoły uzyskiwania pierwotnych kultur 2D IEC pochodzących z enteroidów/kolonoidów 3D. Enteroidy / kolonoidy 2D rosną jako arkusze komórek, tak jak modelowe linie komórkowe i są idealne do badania naprawy ran jelitowych, interakcji gospodarz-patogen i medycyny regeneracyjnej. Kilka opublikowanych artykułów opisuje, jak generować monowarstwy 2D ze struktur 3D lub bezpośrednio z krypt jelitowych, (patrz6,7,8,9,10,11), ale te metody są zwykle pracochłonne i trudne do odtworzenia. W niniejszym protokole przedstawiono szybką, prostą i powtarzalną metodę uzyskiwania monowarstw bezpośrednio ze świeżo wyizolowanych krypt jelit myszy.
Tutaj szczegółowo wyjaśniamy proces ekstrakcji krypt przy minimalnym generowaniu zanieczyszczeń, wybór macierzy zewnątrzkomórkowej oraz różne powierzchnie i zastosowania dla tej techniki. To eksperymentalne podejście zostało zoptymalizowane pod kątem krypt jelita grubego, ale podobne wyniki uzyskuje się w przypadku zastosowania do jelita cienkiego.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy</td><td>Suplement Corning</td><td>30-004CI</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50X)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen z ludzkiego łożyska (typ IV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>85529-250G</td><td></td></tr><tr><td>D-Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami, z Ca2+ i Mg2+ (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Nabłonkowy woltomierz/omomierz</td><td>World Precision Instruments</td><td>0-10K&Omega; z STX2 (EVOM2)</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>51201</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Test lucyferazy świetlika</td><td>Biotium</td><td>30085-2</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td> <td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Corning</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany EGF</td><td>R& Systemy D</td><td>236-EG</td><td>Stężenie zapasów: 500&mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany Wnt-3A</td><td>R& Systemy D</td><td>W3a-H-005</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>ogniwa LWRN</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy molekularnej</td><td>Suplement Corning</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>N2 (100X)</td> <td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>Stężenie zapasów: 500mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Kondycjonowane</td> <td>media-Nunc</td><td></td></tr> <tr><td>Lab-Tek System prowadnic komorowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycyna (10 000U / ml)</td> <td>Corning</td><td>30002CI</td><td></td></tr><tr><td>Buforowana sól fizjologiczna Phospahte, Ca2+ i Mg2+ free (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa rurka zasilająca 20G</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-810-46</td><td></td></tr><tr><td>rh-laminin-521</td><td>Gibco</td><td>A29248</td><td>Stężenie zapasów: 100&mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Roboz Surgical 4-0 Jedwabny pleciony 100YD</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9452680</td><td></td></tr><tr><td>TOPflash HEK293 ogniwa</td><td>ATCC</td><td>CRL-3249</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Przepuszczalne podpory (0,4 i mikro; m)</td> <td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Nabłonek jelitowy składa się z pojedynczej warstwy komórek, które działają jak bariera między światłem jelita a wnętrzem ciała. Przerwanie ciągłości tej bariery może skutkować zaburzeniami zapalnymi, takimi jak nieswoiste zapalenie jelit. Jednym z ograniczeń w badaniach nad biologią nabłonka jelitowego był brak pierwotnych modeli hodowli komórek, co zmusiło naukowców do wykorzystania modelowych linii komórkowych pochodzących z raków. Pojawienie się trójwymiarowych (3D) enteroidów dało biologom nabłonkowym potężne narzędzie do generowania pierwotnych kultur komórkowych, niemniej jednak struktury te są osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej i brakuje im dojrzałości charakterystycznej dla zróżnicowanych komórek nabłonka jelitowego. Opublikowano kilka technik generowania monowarstw nabłonka jelitowego, ale większość z nich pochodzi z ustalonych enteroidów 3D, co sprawia, że proces ten jest pracochłonny i kosztowny. Tutaj opisujemy protokół generowania pierwotnych monowarstw nabłonka jelita grubego bezpośrednio z mysich krypt jelitowych. Szczegółowo opisujemy również podejścia eksperymentalne, które można zastosować w tym modelu, takie jak generowanie zlewających się kultur na filtrach przepuszczalnych, monowarstwa konfluentna do badań gojenia ran zadrapań oraz rzadkie i zlewające się monowarstwy do analizy immunofluorescencyjnej.

Aby zilustrować wiarygodność pierwotnych kultur monowarstw nabłonkowych okrężnicy, przedstawiono podsumowanie izolacji krypt oraz reprezentatywne obrazy uzyskane zgodnie z protokołem. Należy pamiętać, że izolowane krypty są hodowane w warunkach sterylnych, dlatego priorytetem jest prawidłowa sekcja i oczyszczenie okrężnicy. Rycina 1 przedstawia kluczowe etapy izolacji krypt. Izolowane krypty (Rycina 2A) są następnie liczone i zagęszczane (Rycina 2B) w celu uzyskania stężenia 5 krypt/µL. Po przygotowaniu zagęszczonej zawiesiny krypt, komórki są wysiewane w wybranym formacie (szalki hodowlane, wkłady membranowe lub szkiełka komorowe) i inkubowane w odpowiednich mediach, zależnie od potrzeb eksperymentalnych. Rycina 3 pokazuje postęp hodowli po 24 i 48 h inkubacji w płytkach 48-dołkowych. Komórki są inkubowane aż do osiągnięcia pożądanej konfluencji. Aby zilustrować możliwe zastosowania tej metody, pozwolono komórkom w dołkach płytki 48-dołkowej osiągnąć pełną konfluencję, a następnie przeprowadzono test gojenia rany (scratch-wound assay). Rycina 4 przedstawia świeżo wykonane zadrapanie (Rycina 4A) w dwuwymiarowej (2D) monowarstwie kolonoidów oraz tę samą ranę po 24 h (Rycina 4B). Wyraźnie widać, że hodowla pozostaje zdrowa i żywotna, a rana ulega naprawie. Aby wygenerować zróżnicowane monowarstwy, media są zmieniane z LWRN na media różnicujące. Różnicowanie jest potwierdzane poprzez wysokie wartości TEER (Rycina 5A), spadek poziomu markerów ISC (Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 (Lgr5) oraz Achaete-scute like 2 (Ascl2)) oraz wzrost poziomu markerów różnicowania (Alanyl aminopeptidase (Anpep), Mucin 2 (Muc2), lysozyme 1 (Lyz1), Sucrose iso-maltase (Sis) oraz Chrmogranin A (Chga)) (Rycina 5B,C) w badaniu PCR. W tym panelu można uwzględnić również inne markery, takie jak CDX2 i KRT20. Oprócz poziomów ekspresji mRNA, obecność podtypów zróżnicowanych komórek nabłonkowych w kolonoidach 2D hodowanych w warunkach różnicowania została wykazana za pomocą immunofluorescencji (Muc2 i Chga; Rycina 5D).
<img alt="Układ perfuzji tkanki w eksperymencie laboratoryjnym, przedstawiający krok po kroku metodę z użyciem strzykawki oraz postępowanie z tkanką." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie próbek do generowania zdrowych monowarstw. Przygotowanie próbek jest kluczowe dla generowania zdrowych monowarstw. Na tym rysunku przedstawiono kluczowe etapy procesu izolacji, aby ułatwić go czytelnikowi. Okrężnicę wycina się z organizmu myszy, upewniając się, że nie pozostały na niej resztki futra. Należy ostrożnie usunąć kał, dbając o to, aby nie perforować okrężnicy; jest to kwestia kluczowa, ponieważ okrężnica musi być w stanie utrzymać powietrze i być nadmuchiwana oraz wypuszczana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy przedstawiający proces zagęszczania komórek: przygotowanie początkowe w porównaniu z etapem po zagęszczeniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Liczenie i zagęszczanie wyizolowanych krypt. (A) Krypty jelita grubego po wstrząsaniu „kiełbasek” jelitowych. Obraz przedstawia pole widzenia kropli o objętości 20 µL. (B) Zagęszczanie krypt w celu uzyskania stężenia 5 krypt/µL. Pasek skali: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie wzrostu komórek, obrazy mikroskopowe, 24 h i 48 h po wysianiu, analiza proliferacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wzrost monowarstwy pierwotnych IEC. (A) 2D monowarstwy IEC po 24 h od wysiania i usunięciu szczątków komórkowych. (B) Konfluentne 2D monowarstwy IEC 48 h po wysianiu. Pasek skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces migracji komórek; test gojenia ran; obrazy mikroskopowe; linie przerywane wskazują krawędź zarysowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Testy zarysowania z użyciem pierwotnych komórek IEC myszy. Obrazy przedstawiające gojenie rany po wykonaniu zarysowania w monowarstwie nabłonka okrężnicy. Pasek skali: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki eksperymentu TEER; wykresy przedstawiają markery komórek macierzystych i różnicowania; obrazy fluorescencyjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Różnicowanie monowarstw nabłonkowych jelita grubego. (A) Pożywka do różnicowania tworzy szczelne bariery nabłonkowe, co wykazano za pomocą TEER. Pożywka do różnicowania powoduje spadek ekspresji mRNA (B) markerów komórek macierzystych oraz zwiększenie ekspresji (C) markerów różnicowania. (D) Markery wyspecjalizowanych zróżnicowanych komórek nabłonka, takich jak Muc2 i Chromogranina-A, można również wykryć za pomocą immunofluorescencji bezpośrednich kolonoidów 2D. Pasek skali: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Nasz protokół zapewnia szybką, powtarzalną i niezawodną metodę generowania bezpośrednich monowarstw pierwotnego nabłonka jelitowego na różnych powierzchniach przy minimalnej ilości zanieczyszczeń. Głównymi zaletami tego protokołu są niskie zużycie pożywki i niskie koszty utrzymania hodowli komórkowych. Jest to szybka metoda wykonywania testów funkcjonalnych i szybkich aplikacji podrzędnych.Protokół ten zapewni wgląd w badania nad gojeniem się ran, barierą przepuszczalności i migracją przeznabłonkową różnych typów komórek. Model ten może być również przydatny w interakcji gospodarz-patogen, uszkodzonym nabłonku i odkrywaniu leków. Na początek dodaj 200 mikrolitrów roztworu powlekającego do każdego dołka 48-dołkowej płytki i szkiełka komorowego.Wstępnie inkubuj oba w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Pokryj wkładki błony komórkowej o grubości 0,4 mikrometra 200 mikrolitrami roztworu kolagenu. Inkubować płytkę z wkładkami membranowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie przenieść ją do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny.Zdezynfekuj uśpioną mysz 70% etanolem, a następnie wypreparuj okrężnicę od odbytnicy do jelita ślepego za pomocą nożyczek i kleszczy. Delikatnie wypłucz kał lodowatym PBS w 10-mililitrowej strzykawce wyposażonej w rurkę do karmienia o rozmiarze 20. Usuń proksymalną okrężnicę i delikatnie wsuń dystalną okrężnicę na rurkę do karmienia o rozmiarze 20.Zawiąż okrężnicę na końcu rurki jedwabną nicią do szwów 4-0. Odwróć okrężnicę na lewą stronę nad zawiązanym końcem i zawiąż drugi koniec nitką, a następnie odetnij okrężnicę poniżej końcówki rurki do karmienia za pomocą nożyczek chirurgicznych. Delikatnie otworzyć odwiązany koniec odwróconej okrężnicy na końcówce strzykawki o pojemności 1,25 mililitra za pomocą tłoka.Wsunąć odwiązany koniec odwróconej okrężnicy na strzykawkę i mocno zawiązać go nitką. Włożyć tłok do strzykawki i napompować okrężnicę, aż zacznie wyglądać na surową i bez widocznych zmarszczek. Umieść napompowaną kiełbasę okrężnicy w 15-mililitrowej probówce zawierającej pięć mililitrów roztworu do odzyskiwania komórek na lodzie na 20 minut.Napompuj i opróżnij okrężnicę raz na pięć minut. Zawiąż napompowaną okrężnicę poniżej końcówki strzykawki za pomocą jedwabnej nici do szwów 4-0. Odetnij kiełbasę okrężnicy z strzykawki i umieść ją w 15-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów 50-milimolowego EDTA na 40 minut.Obróć rurkę o cztery stopnie Celsjusza. Zastąp roztwór EDTA pięcioma mililitrami buforu do wstrząsania i potrząsaj kiełbasą ręcznie w pozycji pionowej przez dwie minuty. Zdekantować roztwór do wytrząsania do nowej 15-mililitrowej probówki i powtarzać etap wytrząsania, aż do zebrania łącznie 10 mililitrów krypt i buforu do wytrząsania.Policz liczbę krypt w 20 mikrolitrach zawiesiny pod mikroskopem i rozcieńcz próbkę, aby uzyskać stężenie pięciu krypt na mikrolitr. Odwirować próbkę krypty w temperaturze 400 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W międzyczasie wyjmij 48-dołkową płytkę i wkładki membranowe z inkubatora i umieść je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Odessać roztwór powlekający za pomocą pipety P200 i pozostawić płytkę z lekko przesuniętą pokrywką, aż komórki będą gotowe do powlekania. Po odwirowaniu zawiesiny krypty należy usunąć bufor wstrząsający i ponownie zawiesić nienaruszoną osadkę w trzech mililitrach kompletnego podłoża LWRN. Dodaj 200 mikrolitrów krypt do każdej studzienki wstępnie pokrytej 48-dołkowej płytki i szkiełka komorowego i inkubuj oba w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia odessaj pożywkę i dodaj świeżą pożywkę. Ogólnie rzecz biorąc, komórki stają się zlewające się w ciągu 24 do 48 godzin. W przypadku wkładek błonowych do hodowli komórkowych dodaj 200 mikrolitrów krypt na górze wkładek i 600 mikrolitrów kompletnej pożywki LWRN na dole.Następnego dnia odessać pożywkę i dodać świeżą pożywkę tylko do górnej komory. Inkubować płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Codziennie mierz przeznabłonkową rezystancję elektryczną za pomocą nabłonkowego woltomierza/omomierza.Po wyizolowaniu krypt z mysiej okrężnicy i zweryfikowaniu stężenia, zawiesinę krypty zatężono do pięciu krypt na mikrolitr. 48-dołkowe studzienki płytkowe poddano testowi ran od zadrapań po dotarciu do zbiegu komórek. Po 24 godzinach zaobserwowano gojenie się rany, co wskazuje, że posiew był zdrowy i żywotny.Wyższe wartości poziomu zostały osiągnięte, gdy media zostały zmienione z LWRN na pożywki różnicujące. Zaobserwowano również spadek markerów ISC i wzrost markerów różnicowania, co wskazuje, że zróżnicowane monowarstwy zostały wygenerowane z powodzeniem. Ponadto za pomocą immunofluorescencji wykazano pojawienie się podtypów zróżnicowanych komórek nabłonka hodowanych w różnych warunkach.Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby upewnić się, że okrężnica nie zostanie pęknięta w żadnym momencie podczas przygotowania i pozostanie napompowana, aby uwolnić krypty w wyjątkowo czystym przygotowaniu. Po utworzeniu monowarstw komórek nabłonka jelitowego 2d możemy przeprowadzić testy immunofluorescencji, zadrapań i przepuszczalności oraz inne dalsze zastosowania. Dostarczy to wiedzy na temat gojenia się ran, migracji różnych typów komórek oraz badań nad naprawą i uszkodzeniem nabłonka.

generation-murine-primary-colon-epithelial-monolayers-from-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: In, J. G. i in. Monowarstwy ludzkich koloniów do badania interakcji między patogenami, komensalami a nabłonkiem jelitowym gospodarza. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje procedurę hodowania komórek nabłonkowych pochodzących z jelita grubego na systemie Transwell pokrytym kolagenem, aby uzyskać monowarstwę produkującą śluz, która modeluje barierę jelitową i umożliwia badania interakcji gospodarz–patogen.

Generowanie monowarstwy ludzkiej kolonoidu z funkcją bariery do badania interakcji gospodarz–patogen

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Tutaj opisujemy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych. Opisujemy również metodę tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, umożliwiających dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonkowych.

Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Poznaj metodę generowania monowarstw nabłonka jelita grubego myszy z krypt jelitowych do badań nad gojeniem ran i funkcjami barierowymi. Protokół zapewnia niskie zużycie mediów i szybkie zastosowanie eksperymentalne.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Przeglądaj więcej filmów