Wizualizacja wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na komory jajowe Drosophila za pomocą obrazowania na żywo

Nasze laboratorium wykorzystuje Drosophila melanogaster do identyfikacji i scharakteryzowania genów i szlaków, które regulują funkcję mitochondriów podczas rozwoju i fizjologicznej homeostazy. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje obrazowanie na żywo z dodatkiem nadtlenku wodoru do wizualizacji wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na lokalizację i dynamikę struktur subkomórkowych w dorosłym jajniku Drosophila. Często używamy protokołów obrazowania do badania, w jaki sposób mutacje zmieniają normalną lokalizację i ruch mitochondriów w żeńskich komórkach rozrodczych.

W trakcie naszych badań stwierdziliśmy, że stres wywołany przez rozwarstwienie lub inne stresory komórkowe miał głęboki wpływ na lokalizację mitochondriów. Jako kontrola w celu określenia, czy ogólny stres, w przeciwieństwie do leczenia eksperymentalnego, jest przyczyną jakichkolwiek zmian w lokalizacji lub zachowaniu struktur subkomórkowych. Opracowaliśmy ten protokół, aby wprowadzić stres kontrolny za pomocą nadtlenku wodoru.

W tym filmie pokażemy, jak uszkodzenia oksydacyjne wywołane nadtlenkiem wodoru zmieniają rozmieszczenie mitochondriów i rybonukleoproteiny Clu. Pożywka najlepiej nadająca się do tej techniki obrazowania na żywo zawierała pożywkę Drosophila Schneidera zawierającą 15% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 0,6 X Pen-Strep i 200 mikrogramów na mikrolitr insuliny bydlęcej, zwanej dalej kompletną pożywką Schneidera. Przygotowanie podłoża w sterylnych warunkach zapewni, że nie zostanie ono zanieczyszczone.

Dobrze wymieszaj zawartość i przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni. Insulina nie rozpuszcza się całkowicie w całej pożywce Schneidera i zauważysz osad osadzający się na dnie probówki. Wykonaj porcje, pamiętając, aby pozostawić ten osad, ponieważ będzie on zakłócał obrazowanie.

Roztwór ten może być stosowany przez jeden miesiąc, jeżeli jest przechowywany w porcjach w temperaturze czterech stopni. Aby uzyskać optymalne obrazowanie żeńskich komórek rozrodczych, najpierw przygotuj fiolkę zawierającą odrobinę mokrej pasty drożdżowej o konsystencji masła orzechowego. Dzięki temu samice są dobrze odżywione i wytwarzają wszystkie etapy rozwoju mieszków włosowych do obrazowania.

Aby uzyskać optymalnie zdrowe muchy, zbierz samice w wieku od zera do jednego dnia i przenieś je z samcami do fiolki z pokarmem dla much zawierającej mokrą pastę drożdżową. Upewnij się, że śpiące muchy nie stykają się z pastą drożdżową, ponieważ mogą się do niej przykleić. Karm muchy przez trzy do siedmiu dni, codziennie zmieniając pastę drożdżową.

Upewnij się, że pasta drożdżowa styka się z pokarmem dla much, aby nie wyschł. Aby wywołać uszkodzenie oksydacyjne, użyjemy podstawowego roztworu 30% nadtlenku wodoru, a do wizualizacji mitochondriów użyjemy podstawowego roztworu 100 milimolowego TMRE. Ważne jest, aby przygotować roztwory pożywek na świeżo, ponieważ nadtlenek wodoru jest podatny na utlenianie, a TMRE z czasem ulega degradacji.

Tuż przed preparacją, w kompletnej pożywce Schneidera, przygotuj świeżą porcję dwóch mikromolowych nadtlenków wodoru, świeżą podwielokrotność 46 nanomolowych TMRE i świeżą podwielokrotność 46 nanomolowych TMRE plus dwa mikromolowe nadtlenki wodoru. Do wypreparowania jajników potrzebne są dwie pary cienkich kleszczyków i para elektrolitycznie zaostrzonych igieł wolframowych. Aby wypreparować jajniki, napełnij szkiełko zegarka kompletnymi pożywkami Schneidera, które zostały podgrzane do temperatury pokojowej, a następnie umieść pojedynczą muchę w pożywce za pomocą kleszczy.

Delikatnie chwyć muchę za klatkę piersiową za pomocą jednej pary cienkich kleszczy. Drugimi kleszczami chwyć tył i delikatnie pociągnij, aby usunąć jajniki. Usuń wszelkie obce naskórki lub tkanki, a następnie przenieś jajnik do nowej studzienki zawierającej świeżą pożywkę.

Jajniki powinny nadal poruszać się od otaczającej osłonki mięśniowej. Za pomocą zaostrzonych igieł wolframowych delikatnie rozsuń jajniki, uważając, aby usunąć otaczającą osłonkę mięśniową. Jeśli osłonka mięśniowa nie zostanie usunięta, jak pokazano tutaj, jajnik będzie drgał, powodując problemy z akwizycją obrazu.

Po czystym wypreparowaniu jajników przenieś je w 100-mikrolitrowej kropli pożywki do naczynia MatTek, jeśli wizualizujesz endogennie znakowane struktury. Przenieś jajniki w 100-mikrolitrowej kropli pożywki TMRE do naczynia MatTek, jeśli wizualizujesz mitochondria znakowane TMRE. Jajniki opadną na dno kropli.

Ważne jest, aby ćwiczyć sekcje, aby jak najszybciej rozpocząć obrazowanie tkanki. Po zamontowaniu jajników umieść szalkę na odwróconym mikroskopie i uzyskaj nieruchome obrazy lub krótkie filmy jako zapis warunków wstępnej obróbki. Gdy to zrobisz, przerwij obrazowanie na żywo, zdejmij pokrywkę i ostrożnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu dwumolowego mikromolowego nadtlenku wodoru.

Należy unikać rozbijania powierzchni istniejącej kropelki pożywki lub zbyt szybkiego dodawania roztworu, aby nie przemieścić jajników spoczywających na dnie. Załóż pokrywę naczynia, przenieś i ponownie ustaw ostrość żądanego jajnika i wznów obrazowanie. Należy zadbać o jak najszybsze wznowienie obrazowania, ponieważ leczenie eksperymentalne jest wrażliwe na czas.

Pokazane tutaj są zdjęcia z filmu, zrobione po leczeniu nadtlenkiem wodoru. Mitochondria i żeńskie komórki rozrodcze są rozproszone w cytoplazmie, gdy muchy są dobrze odżywione i zdrowe. Po dodaniu nadtlenku wodoru uszkodzenie oksydacyjne powoduje zlepianie się mitochondriów, co można zauważyć już po 10 minutach od zabiegu.

Po 20 minutach uszkodzenie powoduje rozproszenie potencjału błony mitochondrialnej. W ten sposób większość mitochondriów zanika. Na tym filmie na żywo z tego procesu można zobaczyć, jak mitochondria szybko się zlepiają, a większość mitochondriów ostatecznie zanika.

Pulsujące mruganie w cytoplazmie, szczególnie w otaczających komórkach pęcherzykowych, wydaje się charakterystyczne dla dodawania TMRE. Jak wspomniano wcześniej, obrazowanie musi odbywać się szybko po dodaniu nadtlenku wodoru. Jak pokazano tutaj, jeśli upłynie zbyt dużo czasu, potencjał błony mitochondrialnej zostanie już utracony, a znakowanie TMRE rozproszy się, co sprawi, że dane będą niemożliwe do zinterpretowania.

Na tych nieruchomych zdjęciach wideo endogennie znakowane cząstki Clu GFP są wytrzymałe i obfite w plazmie zarodkowej dobrze odżywionych samic. Po dodaniu nadtlenku wodoru cząsteczki Clu rozpraszają się w ciągu 10 minut. Jest to pokazane w załączonym filmie.

Po dodaniu nadtlenku wodoru cząsteczki błogości Clu szybko się rozpraszają. Odkryliśmy, że ten protokół jest użytecznym narzędziem zapewniającym dokładne obrazowanie lokalizacji mitochondriów typu dzikiego i cząstek błogości Clu w żeńskich komórkach rozrodczych Drosophila. Protokół ten powinien mieć zastosowanie w szerokim zakresie badań obrazowych na żywo i może być również stosowany do leczenia tkanek przed fiksacją.

Najważniejszymi krokami są wyizolowanie jajników wolnych od osłonki mięśniowej, delikatne dodanie nadtlenku wodoru, aby nie usunąć jajników, oraz szybkie zobrazowanie po dodaniu nadtlenku wodoru. Mamy nadzieję, że okaże się to przydatną kontrolką do obrazowania na żywo różnych struktur subkomórkowych. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.