Name: Dysocjacja komórek z nabłonka języka i mezenchymy/tkanki łącznej myszy w wieku 12,5 dnia zarodkowego i 8 tygodni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj metodę dysocjacji komórek z nabłonka i mezenchymy języka myszy. Protokół zapewnia wysoką wydajność i jakość komórek do analiz RNA-seq i hodowli organoidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health, grant numer R01DC012308 i R21DC018089 dla HXL. Dziękujemy Brettowi Marshallowi (University of Georgia, Athens, GA) i Egonowi Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) za pomoc techniczną i konsultacje dotyczące dysocjacji komórek; dla Francisci Gibson Burnley (University of Georgia, Athens, Georgia) za redakcję w języku angielskim.

Wykorzystanie zwierząt (myszy C57BL/6 w całym badaniu) zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Georgii i było zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt w badaniach.
1. Wykorzystanie zwierząt
UWAGA: Myszy hodowano i utrzymywano w zwierzęciu wydziale Animal and Dairy Science na University of Georgia w temperaturze 22 °C przy 12-godzinnym cyklu dzień/noc.
<ol>
	<li>Południe dnia wykrycia czopu pochwowego u myszy uznaje się za dzień embrionalny (E) 0,5. W poniższych eksperymentach należy wykorzystać embriony w stadium E12,5 oraz myszy postnatalne w wieku 8 tygodni.</li>
</ol>
2. Przygotowania przed eksperymentem
UWAGA: Instrumenty wymagane do tego protokołu są wymienione w Tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Przed eksperymentem wysterylizuj instrumenty w autoklawie. W trakcie eksperymentu do sterylizacji narzędzi używaj sterylizatora koralikowego.</li>
	<li>Oczyść obszar operacyjny, mikroskop stereoskopowy oraz komorę z laminarnym przepływem powietrza za pomocą chusteczek nasączonych 70% etanolem. Włącz lampę UV w komorze i pozostaw ją włączoną przez 20 min przed rozpoczęciem procedury eksperymentalnej.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę enzymów składającą się z dispazy (5,0 mg/mL) i kolagenazy (2,0 mg/mL) w stosunku 1:1, tak aby końcowe stężenia wynosiły odpowiednio 2,5 i 1,0 mg/mL, a następnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm7.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 mL mieszaniny enzymów dla języka dorosłego osobnika lub 0,5 mL dla konkretnego regionu języka (np. tylnej lub przedniej części języka).</li>
		<li>Przygotuj 2 mL mieszaniny enzymów dla języków embrionalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 10 mL 2,5% BSA w 0,1 M PBS i przefiltruj roztwór za pomocą strzykawki 1 mL i filtra strzykawkowego 0,22 µm.</li>
	<li>Przygotuj 500 µL 5% FBS w DMEM/F12.</li>
	<li>Przygotuj 3 mL DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% BSA i przefiltruj roztwór za pomocą strzykawki 1 mL i filtra strzykawkowego 0,22 µm.</li>
</ol>
3. Oddzielenie nabłonka języka od mezenchymy/podległej tkanki łącznej
<ol>
	<li>Oddzielenie nabłonka od mezenchymy języka myszy w stadium E12.5
	<ol>
		<li>Uśmierć ciężarne samice myszy z embrionami w stadium E12.5 poprzez umieszczenie w komorze z CO2, a następnie zastosowanie zwichnięcia szyjnego. 
		UWAGA: Embriony myszy w stadium E12.5 pobiera się po godzinie 12:00 (po południu) w 12. dniu po wykryciu czopu pochwowego u ciężarnych samic.</li>
		<li>Przenieś myszy do strefy operacyjnej. Zwilż brzuch myszy 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się sierści do pola operacyjnego.</li>
		<li>Otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek sekcyjnych, aby odsłonić rogi macicy z embrionami. Wypreparuj rogi macicy nożyczkami sekcyjnymi i przenieś je do 15 mL świeżego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej.</li>
		<li>Wypreparuj embriony (Rycina 1A1) z rogów macicy pod mikroskopem sekcyjnym, używając mini-nożyczek i precyzyjnej pęsety.</li>
		<li>Ostrożnie szeroko otwórz jamę ustną za pomocą precyzyjnej pęsety i oddziel język od żuchwy mini-nożyczkami (Rycina 1A2).</li>
		<li>Przemyj języki, używając 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej.</li>
		<li>Przenieś tkanki do 2 mL mieszaniny enzymatycznej zawierającej dyspazę (2.5 mg/mL) i kolagenazę (1.0 mg/mL) w 35 mm szalce hodowlanej, używając szpatułki i precyzyjnej pęsety w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Inkubuj przez 20 min w 37 °C.</li>
		<li>Przenieś języki do 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej i delikatnie oddziel mezenchymę od nabłonka od strony brzusznej za pomocą precyzyjnej pęsety. 
		​UWAGA: Płaty nabłonka mogą oddzielić się bez użycia siły mechanicznej podczas inkubacji.</li>
		<li>Przemyj oddzielony nabłonek i mezenchymę dwukrotnie w 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej. 
		UWAGA: Aktywność dyspazy i kolagenazy zostanie zahamowana przez EDTA podczas procedury dysocjacji komórek (krok 4.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddzielenie nabłonka języka od leżącej pod nim tkanki łącznej u dorosłych myszy
	<ol>
		<li>Uśmierć mysz w wieku 8 tygodni, umieszczając ją w komorze z CO2. Potwierdź uśmiercenie myszy brakiem oddechów oraz brakiem reakcji na uciśnięcie przedniej łapy.</li>
		<li>Przenieś myszy do strefy operacyjnej. Zwilż głowę myszy 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się sierści do jamy ustnej.</li>
		<li>Nacinij kąciki ust wzdłuż policzka nożyczkami sekcyjnymi, aby otworzyć jamę ustną. Wypreparuj język wraz z żuchwą (Rycina 1B1) i umieść go w plastikowym naczyniu wyłożonym folią spożywczą.</li>
		<li>Trzymając język pęsetą chirurgiczną pod mikroskopem sekcyjnym, wstrzyknij mieszaninę enzymatyczną dyspazy (2.5 mg/mL) i kolagenazy (1.0 mg/mL) do przestrzeni podnabłonkowej języka poprzez krawędź cięcia (Rycina 1B1, strzałki) tylnej części języka.
		<ol>
			<li>Wstrzyknij 1 mL mieszaniny enzymatycznej równomiernie w cały język, aby pobrać tkankę zarówno z przedniej, jak i tylnej części języka.</li>
			<li>Wstrzyknij 0.5 mL mieszaniny enzymatycznej miejscowo w przednią część języka w celu pobrania tkanki z czubka języka lub w tylną część języka w celu pobrania tkanki z brodawek okrężnych. 
			​UWAGA: Język spuchnie w miarę gromadzenia się enzymu (Rycina 1B2). Delikatne wstrzykiwanie enzymu może zapobiec uszkodzeniu nabłonka przez ciśnienie i pozwolić na zatrzymanie jak największej ilości enzymu w języku.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Owiń język folią spożywczą i inkubuj przez 30 min w 37 °C.</li>
		<li>Użyj mini-nożyczek, aby wypreparować czubek języka i/lub brodawki okrężne, a następnie użyj szpatułki i precyzyjnej pęsety, aby przenieść tkankę do 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej.</li>
		<li>Oddziel nabłonek od leżącej pod nim tkanki łącznej w przestrzeni podnabłonkowej przetrawionej enzymatycznie za pomocą mini-nożyczek. Przytnij tkanki do odpowiedniej wielkości zgodnie z wymaganiami dalszych eksperymentów.</li>
		<li>Przemyj oddzielony nabłonek i leżącą pod nim tkankę łączną dwukrotnie w 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej. 
		​UWAGA: Aktywność dyspazy i kolagenazy zostanie zahamowana przez EDTA podczas procedury dysocjacji komórek (krok 4.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dysocjacja komórek
UWAGA: Opisany tutaj protokół dysocjacji komórek można zastosować do nabłonka języka oraz mezenchymy/tkanki łącznej u myszy w stadium embrionalnym E12.5, jak i u myszy 8-tygodniowych. Aby zmniejszyć utratę komórek podczas wytrząsania i przenoszenia zawiesiny komórkowej, należy stosować komercyjne końcówki do pipet o niskiej retencji lub końcówki pokryte wcześniej 2,5% BSA w 0,1 M PBS o pH 7,48.
<ol>
	<li>Przenieść tkanki za pomocą szpatułki i precyzyjnych pęsety do 3 mL 0,25% trypsyny-EDTA w nowej szalce hodowlanej 35 mm na 30 min w temperaturze 37 °C. Delikatnie mieszać tkanki co 5 min za pomocą końcówek do pipet 1 mL. 
	UWAGA: Nie należy ucinać końcówki pipety, ponieważ ostra krawędź może fizycznie uszkodzić zdysocjowane komórki.</li>
	<li>Dodać 500 µL 5% FBS w DMEM/F12, aby zatrzymać reakcję, a następnie przenieść medium do probówki wirówkowej o niskiej wiązalności o pojemności 5 mL.</li>
	<li>Wirować zawiesinę komórkową przy 200 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej i usunąć nadsącz.</li>
	<li>Delikatnie resuspender komórki w 3 mL DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% BSA przy użyciu końcówek do pipet 1 mL, a następnie przefiltrować komórki przez sito komórkowe 70 µm, a następnie przez sito komórkowe 35 µm.</li>
	<li>Wirować zawiesinę komórkową przy 200 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej. Usunąć większość medium, pozostawiając 50-300 µL jako objętość końcową do resuspensji komórek. 
	​UWAGA: Stężenie komórek należy dostosować do wymagań dalszych eksperymentów poprzez zmianę końcowej objętości zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
</ol>
5. Liczenie komórek i test żywotności z użyciem komory countingowej (hemocytometru)
UWAGA: Aby zwiększyć dokładność pomiaru, zaleca się wykonanie 3 powtórzeń technicznych dla każdej próbki.
<ol>
	<li>Delikatnie zmieszać 5-10 µL zawiesiny pojedynczych komórek z równą objętością błękitu trypanu i nanieść na komorę countingową. 
	UWAGA: Przed użyciem dokładnie oczyścić komorę countingową 70% etanolem. Cząsteczki kurzu na komorze zostaną zabarwione na ciemnoniebiesko, co wpłynie na dokładność testu żywotności. Sprawdzić czystość komory pod mikroskopem.</li>
	<li>Oznaczyć całkowitą liczbę komórek, liczbę komórek żywych (białe) oraz liczbę komórek martwych (ciemnoniebieskie) zabarwionych błękitem trypanu (Rycina 2, strzałki) odpowiednio w 4 polach zawierających 16 siatek (Rycina 2), korzystając z mikroskopu odwróconego z systemem obrazowania.</li>
	<li>Obliczyć stężenie komórek: 
	Stężenie komórek = <img alt="Wzór obliczeniowy na stężenie komórek, równanie z uwzględnieniem czynnika rozcieńczenia." src="/files/ftp_upload/62163/62163eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">
	<ol>
		<li>Obliczyć żywotność: 
		Żywotność = <img alt="Obliczanie żywotności komórek, wzór: (komórki żywe/całkowita liczba komórek) × 100%, procent, analiza komórek." src="/files/ftp_upload/62163/62163eq02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grada, A., Weinbrecht, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing%3A+methodology+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing: methodology and application.</a> The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).</li>
<li>Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+methodology+and+clinical+applications+of+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).</li>
<li>Schaum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%3A+The+Tabula+Muris+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium.</a> Nature. 562 (7727), 367(2018).</li>
<li>Sukumaran, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+profiling+of+taste+bud+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome profiling of taste bud cells.</a> Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+labeling+in+whole+tongue+epithelial+sheet+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen-Ngoc%2C+K-V+%22Tissue+Morphogenesis%22">Tissue Morphogenesis</a>. , Springer. 135-162 (2015).</li>
<li>Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+mapping+of+taste+bud+cells+and+keratinocytes+in+the+mouse+tongue+and+soft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate.</a> Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Do tej pory nie był dostępny szczegółowy protokół dysocjacji komórek z nabłonka języka i leżącej pod nim mezenchymy/tkanki łącznej. Ten obecny protokół dysocjacji komórek zapewnia powtarzalną procedurę generowania zawiesiny pojedynczej komórki o wysokiej żywotności komórek (>90%) z tkanek języka myszy, w tym arkuszy nabłonka i mezenchymów / tkanek łącznych zarówno w stadium embrionalnym, jak i pourodzeniowym, mimo że izolowane komórki z E12.5 i dorosłych myszy różnią się wielkością. Na przykład izolowane komórki z nabłon...

Język ssaków jest złożonym organem decydującym o smaku, mówieniu i przetwarzaniu żywności. Składa się z wielu rodzajów wysoce zorganizowanych tkanek podzielonych na mezenchymy / tkankę łączną i pokrytych warstwowym arkuszem nabłonkowym zawierającym brodawki smakowe i kubki smakowe. Populacje komórek zarówno w nabłonku języka, jak i mezenchymie/tkance łącznej są niejednorodne. Aby lepiej zrozumieć funkcje i rozmieszczenie określonego typu komórek w języku, konieczne są badania z wykorzystaniem komórek zdysocjowanych. Na przykład sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki jest potężną i wysokoprzepustową metodą profilowania transkryptomicznego w pojedynczych komórkach, która ma na celu zrozumienie transkryptomu złożonej tkanki w rozdzielczości pojedynczej komórki1,2,3,4. Udowodniono, że pierwotna hodowla komórkowa jest użytecznym narzędziem do badania funkcji i różnicowania komórek macierzystych/progenitorowych dla kubków smakowych5,6. Badania te wymagają dużej ilości wysokiej jakości izolowanych populacji komórek (np. wystarczająca całkowita liczba komórek o odpowiednim stężeniu i wysokiej żywotności).
Dlatego istnieje potrzeba izolowania komórek z różnych regionów tkanek językowych i na różnych etapach rozwoju. Obecnie nie ma szczegółowego protokołu dysocjacji komórek z nabłonka języka i leżącej pod nim mezenchymy/tkanki łącznej. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę dysocjacji komórek w celu przygotowania komórek do eksperymentów wymagających wysokiej jakości żywych komórek, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i pierwotne hodowle komórek macierzystych. Odkryliśmy, że wybór buforu do trawienia enzymatycznego, delikatne pipetowanie, wybór pożywki do reprodukcji oraz optymalny czas i prędkość wirowania mają kluczowe znaczenie dla wytworzenia tych dużych ilości komórek wysokiej jakości.

<table><tbody><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-100</td><td></td></tr><tr><td>Mysz C57BL/6 (C57BL/6J)</td><td>Kolagenaza Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>(Kolagenaza A)</td>Naczynie hodowlane <td>Sigma-Aldrich</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>(średnica 35 mm)</td><td>Genesee Naczynie</td> hodowlane Scientific <td>32-103G</td><td></td></tr><tr><td>(średnica 100 mm)</td><td>Genesee Naukowa</td> dypaza <td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>(Dispase II)</td>Nożyczki preparacyjne <td>Sigma-Aldrich</td><td>04942078001</td><td></td></tr><tr><td>(Fine Scissors dla studentów)</td><td>Znajdź narzędzie naukowe</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Kleszczyki higieniczne</td><td>C838U82</td><td></td></tr><tr><td>(kleszcze Dumount #3)</td><td>Znajdź narzędzie naukowe</td><td>Hemocytometr 11293-00</td><td></td></tr> Mikroskop odwrócony <tr><td></td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>z systemem obrazowania (EVOS XL Core Cell Imaging System)</td> <td>Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet o niskiej retencji</td> Mininożyczki <td>METTLER TOLEDO</td><td>17014342</td><td></td></tr><tr><td>(nożyczki sprężynowe Evo)</td><td>Narzędzie do nauki</td> precyzyjnej <td>15800-01</td><td></td></tr><tr><td>plastikowa osnowa</td> Szpatułka <td>VWR</td><td>46610-056</td><td></td></tr><tr><td>(łyżka Moria)</td><td>Kleszcze chirurgiczne Fine Science Tool</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>(kleszcze do laminektomii Dumount #2)</td><td>Narzędzie do nauki o</td> nauce <td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2145-10L</td><td>wykonany z soli Tyrode</td></tr><tr><td>0,25% typozyny-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td> <td>Hoefer</td><td>33946</td><td>wykonany z 1 M PBS</td></tr><tr><td>0,22-&mu; m filtr strzykawkowy</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Koptec</td><td>233919</td><td>wykonany ze 100% etanolu</td></tr><tr><td>1-mL strzykawka</td><td>BD</td><td>8194938</td><td></td></tr><tr><td>5-mL probówka do mikrowirówki o niskim poziomie wiązania</td><td>Eppendorf</td><td>30122348</td><td></td></tr><tr><td>30-G igła</td><td>BD</td><td>9193532</td><td></td></tr><tr><td>35-&mu; m sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>64750</td><td></td></tr><tr><td>70-&mu; m sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>64752</td><td></td></tr></tbody></table>

dysocjacja komórek z nabłonka języka i mezenchymy/tkanki łącznej myszy w wieku 12,5 dnia zarodkowego i 8 tygodni

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Dysocjacja komórek była niezbędną procedurą do badań na poziomie pojedynczej komórki i/lub na poziomie populacji komórek (np. sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i hodowla komórek pierwotnych). Uzyskanie żywotnych, zdrowych komórek w dużych ilościach ma kluczowe znaczenie, a optymalne warunki do tego zależą od tkanek. Populacje komórek w nabłonku języka i leżącej pod nim mezenchymie/tkance łącznej są niejednorodne, a struktury tkanek różnią się w różnych regionach i na różnych etapach rozwoju. Przetestowaliśmy protokoły izolacji komórek z nabłonka języka myszy i mezenchymy/tkanki łącznej we wczesnym stadium rozwojowym [12,5 dnia embrionalnego (E12,5)] i młodych dorosłych (8 tygodni). Czysta separacja między nabłonkiem a leżącą pod nim mezenchymą/tkanką łączną była łatwa do osiągnięcia. Jednak dalsze przetwarzanie i izolowanie komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania żywotnych zdrowych komórek w dużych ilościach oraz staranny dobór bufora trawienia enzymatycznego, czasu inkubacji oraz szybkości i czasu wirowania. Inkubacja oddzielonego nabłonka lub leżącej pod nim mezenchymy/tkanki łącznej w 0,25% trypsyny-EDTA przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie wirowanie w temperaturze 200 x g przez 8 minut dała wysoką wydajność komórek przy wysokim wskaźniku żywotności (>90%), niezależnie od stadiów myszy i regionów języka. Co więcej, stwierdziliśmy, że zarówno zdysocjowane komórki nabłonkowe, jak i mezenchymalne/tkanki łącznej z języka embrionalnego i dorosłego mogą przetrwać w pożywce opartej na kulturze komórkowej przez co najmniej 3 godziny bez znacznego spadku żywotności komórek. Protokoły będą przydatne w badaniach, które wymagają przygotowania wyizolowanych komórek z języków myszy we wczesnym stadium rozwojowym (E12.5) i młodych dorosłych (8 tygodni) wymagającym dysocjacji komórek z różnych przedziałów tkankowych.

Oddzielenie nabłonka języka od leżącego pod nim mezenchymy/tkanki łącznej 
W embrionalnym języku myszy, po prawidłowym trawieniu enzymatycznym, widoczna jest szczelina w przestrzeni podnabłonkowej. Arkusze nabłonka w niektórych językach oddzielają się bez użycia siły mechanicznej podczas inkubacji.
W języku dorosłej myszy o pomyślnym wstrzyknięciu enzymu świadczy obrzęk w miejscach iniekcji (Rycina 1B2), co sugeruje,...

Opracowaliśmy uogólniony protokół do dysocjacji dużej ilości wysokiej jakości pojedynczych komórek z nabłonka i mezenchymy/tkanki łącznej embrionalnych i dorosłych języków myszy.

Dysocjacja komórek z nabłonka języka i mezenchymy/tkanki łącznej myszy w wieku 12,5 dnia zarodkowego i 8 tygodni

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Wysoka wydajność i jakość komórek ze złożonych tkanek są niezbędne do powszechnie stosowanych analiz eksperymentalnych, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek i hodowle pierwotnych komórek macierzystych. Protokół ten generuje zdrowe komórki o wysokiej wydajności i jakości z różnych regionów i przedziałów tkankowych języka ssaków, w tym nabłonka języka i tkanki łącznej. Aby oddzielić nabłonek od mezenchymy języka myszy E 12,5, przenieś uśpioną ciężarną samicę myszy na obszar operacyjny i zwilż brzuch myszy 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się futra do miejsca operacji.Otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek preparacyjnych, aby odsłonić rogi macicy zawierające zarodki, wypreparuj rogi macicy i przenieś je do 15 mililitrów świeżego roztworu Tyrode'a w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj mini nożyczek i cienkich kleszczyków, aby wypreparować zarodki z rogów macicy. Otwórz jamę ustną cienkimi kleszczami i odetnij język od żuchwy za pomocą mini nożyczek.Umyj języki 15 mililitrami świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Następnie przenieś tkanki do dwóch mililitrów mieszaniny enzymów dyspazy i kolagenu w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś języki do 15 mililitrów świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a i delikatnie oddziel mezenchymę i nabłonek od strony brzusznej za pomocą cienkich kleszczy.Przemyć oddzielony nabłonek i mezenchymę dwukrotnie w 15 mililitrach świeżego sterylnego roztworu Tyrode. Aby oddzielić nabłonek języka od leżącej poniżej tkanki łącznej dorosłej myszy, przenieś uśpioną mysz na obszar chirurgiczny i zwilż głowę myszy za pomocą 70% etanolu, aby zapobiec przedostawaniu się futra do jamy ustnej. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przyciąć kąciki ust wzdłuż policzka, aby otworzyć jamę ustną.Rozetnij język żuchwą, umyj go i umieść w plastikowym naczyniu z warstwą folii. Używając kleszczy chirurgicznych do przytrzymania języka, wstrzyknij mieszaninę enzymów dyspazy i kolagenazy w przestrzeń podnabłonkową języka przez krawędź tnącą tylnego języka. Wstrzyknąć jeden mililitr mieszaniny enzymów równomiernie do całego języka w celu pobrania tkanki, a następnie wstrzyknąć 0,5 mililitra mieszaniny enzymów lokalnie do przedniego języka w celu pobrania tkanki z czubka języka lub do tylnego języka w celu pobrania tkanki brodawki obwodowej.Owiń język folią spożywczą i inkubuj go przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj mini nożyczek, aby wypreparować brodawkę obwodową i końcówkę języka. Następnie przenieś tkankę do 15 mililitrów świeżego sterylnego roztworu Tyrode.Oddziel nabłonek od leżącej poniżej tkanki łącznej w trawionej enzymatycznie przestrzeni podnabłonkowej za pomocą mini nożyczek i przytnij tkanki do odpowiedniego rozmiaru, zgodnie z wymaganiami dalszych eksperymentów. Umyj oddzielony nabłonek i leżącą pod nim tkankę łączną dwukrotnie w 15 mililitrach świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Przenieś tkanki do trzech mililitrów 0,25% trypsyny EDTA w nowym 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym.Inkubuj naczynie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając tkanki co pięć minut za pomocą jednomililitrowych końcówek pipety. Dodaj 500 mikrolitrów 5% FBS w DMEM F12, aby zatrzymać reakcję i przenieść pożywkę do pięciomililitrowej probówki wirówkowej o niskim stopniu wiązania. Odwirować zawiesinę komórkową o ciśnieniu 200 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.Delikatnie ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach DMEM F12 zawierającym 10% FBS i 1% BSA, a następnie przefiltruj komórki za pomocą sitka o długości 70 mikrometrów, a następnie sitka o długości 35 mikrometrów. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 200 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć większość pożywki, pozostawiając od 50 do 300 mikrolitrów jako końcową objętość do ponownego zawieszenia komórek. W zarodkowym języku myszy po prawidłowym trawieniu enzymatycznym widoczna jest przerwa w przestrzeni podnabłonkowej.W języku dorosłej myszy na udane wstrzyknięcie enzymu wskazuje obrzęk w wstrzykniętych obszarach, co sugeruje, że enzym może być trzymany przez język. Po połączeniu arkuszy nabłonka języków E12,5 i cienkich warstw mezenchymy, ręczne liczenie komórek wykazało, że protokół dał łącznie 63 917 komórek o żywotności 95,2% z arkuszy nabłonka i łącznie 294 333 komórki o żywotności 96,3% z mezenchymy. Kiedy użyto 10 dorosłych języków w wieku ośmiu tygodni, protokół dał 187 333 komórki o żywotności 95,4% z arkuszy nabłonka końca języka, 544 000 komórek o żywotności 96,3% z arkuszy nabłonkowych brodawek okołobrzegowych i 150 500 komórek o żywotności 93% z tkanek łącznych.Zgodnie z tym protokołem, zdysocjowane komórki mogą być wykorzystane do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i hodowli organoidów testowych 3D w celu zdefiniowania nierozpoznanych testowych komórek progenitorowych pod nabłonkiem językowym.

cell-dissociation-from-tongue-epithelium-mesenchymeconnective-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

W tym filmie opisujemy izolację komórek nabłonkowych z mysiego języka. Komórki te mogą być dalej hodowane, aby dać początek koloniom komórkowym.

Izolacja i hodowla komórek nabłonka języka myszy: procedura izolacji i hodowli komórek nabłonka języka z modelu mysiego

Ten film demonstruje przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej mysiego języka za pomocą metody decelularyzacji, która polega na poddaniu pobranego języka serii fizycznych, chemicznych i enzymatycznych zabiegów. Powstałe rusztowanie TEM zachowuje swój natywny skład macierzy zewnątrzkomórkowej, usuwając składniki komórkowe.

Wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej z modelu mysiego: skuteczna procedura przygotowania bezkomórkowej macierzy zewnątrzkomórkowej języka z języka mysiego

W tym filmie opisujemy izolację nabłonka brodawek okołokolacyjnych (CVP) od mysiego języka.

Izolacja nabłonka brodawek obwodowych (CVP) z modelu mysiego: procedura enzymatyczna mająca na celu oddzielenie nabłonka CVP od języka myszy

Ten film demonstruje protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek kory mózgowej z grzbietowo-bocznego kresomózgowia embrionów myszy.

Izolacja i hodowla komórek z zarodka myszy Grzbietowo-boczne kresomózgowie

Opisano protokół separacji ektodermy twarzy i mezenchymy zarodka. Używamy Dispase II do leczenia najpierw całych zarodków, następnie wycinamy całe wypukłości twarzy, a następnie oddzielamy ektodermę twarzy i mezenchymę.

Oddzielenie embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy

Ciągle rosnący siekacz myszy dostarcza modelu do badania odnawiania tkanek zębowych z komórek macierzystych nabłonka zębów (DESCs). Przedstawiono solidny system do konsekwentnego i niezawodnego pozyskiwania tych komórek z siekacza i namnażania ich in vitro.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z różnymi fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych oraz z inhibitorami szlaków w celu uzyskania wglądu mechanistycznego. Protokół ten może być zaadaptowany do obrazowania na żywo w innych systemach rozwojowych.

Obrazowanie na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Protokół przedstawia metodę hodowli i przetwarzania organoidów językowych pochodzących z komórek macierzystych wyizolowanych z tylnej brodawki smakowej dorosłych myszy.

Wytwarzanie i hodowla organoidów językowych pochodzących z komórek macierzystych smakowych dorosłych myszy

Poznaj metodę dysocjacji komórek z nabłonka i mezenchymy języka myszy. Protokół zapewnia wysoką wydajność i jakość komórek do analiz RNA-seq i hodowli organoidów.

Dysocjacja komórek z nabłonka języka i mezenchymy/tkanki łącznej myszy w wieku 12,5 dnia zarodkowego i 8 tygodni

Przeglądaj więcej filmów