Dysocjacja komórek z nabłonka języka i mezenchymy/tkanki łącznej myszy w wieku 12,5 dnia zarodkowego i 8 tygodni

Wysoka wydajność i jakość komórek ze złożonych tkanek są niezbędne do powszechnie stosowanych analiz eksperymentalnych, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek i hodowle pierwotnych komórek macierzystych. Protokół ten generuje zdrowe komórki o wysokiej wydajności i jakości z różnych regionów i przedziałów tkankowych języka ssaków, w tym nabłonka języka i tkanki łącznej. Aby oddzielić nabłonek od mezenchymy języka myszy E 12,5, przenieś uśpioną ciężarną samicę myszy na obszar operacyjny i zwilż brzuch myszy 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się futra do miejsca operacji.

Otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek preparacyjnych, aby odsłonić rogi macicy zawierające zarodki, wypreparuj rogi macicy i przenieś je do 15 mililitrów świeżego roztworu Tyrode'a w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj mini nożyczek i cienkich kleszczyków, aby wypreparować zarodki z rogów macicy. Otwórz jamę ustną cienkimi kleszczami i odetnij język od żuchwy za pomocą mini nożyczek.

Umyj języki 15 mililitrami świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Następnie przenieś tkanki do dwóch mililitrów mieszaniny enzymów dyspazy i kolagenu w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś języki do 15 mililitrów świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a i delikatnie oddziel mezenchymę i nabłonek od strony brzusznej za pomocą cienkich kleszczy.

Przemyć oddzielony nabłonek i mezenchymę dwukrotnie w 15 mililitrach świeżego sterylnego roztworu Tyrode. Aby oddzielić nabłonek języka od leżącej poniżej tkanki łącznej dorosłej myszy, przenieś uśpioną mysz na obszar chirurgiczny i zwilż głowę myszy za pomocą 70% etanolu, aby zapobiec przedostawaniu się futra do jamy ustnej. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przyciąć kąciki ust wzdłuż policzka, aby otworzyć jamę ustną.

Rozetnij język żuchwą, umyj go i umieść w plastikowym naczyniu z warstwą folii. Używając kleszczy chirurgicznych do przytrzymania języka, wstrzyknij mieszaninę enzymów dyspazy i kolagenazy w przestrzeń podnabłonkową języka przez krawędź tnącą tylnego języka. Wstrzyknąć jeden mililitr mieszaniny enzymów równomiernie do całego języka w celu pobrania tkanki, a następnie wstrzyknąć 0,5 mililitra mieszaniny enzymów lokalnie do przedniego języka w celu pobrania tkanki z czubka języka lub do tylnego języka w celu pobrania tkanki brodawki obwodowej.

Owiń język folią spożywczą i inkubuj go przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj mini nożyczek, aby wypreparować brodawkę obwodową i końcówkę języka. Następnie przenieś tkankę do 15 mililitrów świeżego sterylnego roztworu Tyrode.

Oddziel nabłonek od leżącej poniżej tkanki łącznej w trawionej enzymatycznie przestrzeni podnabłonkowej za pomocą mini nożyczek i przytnij tkanki do odpowiedniego rozmiaru, zgodnie z wymaganiami dalszych eksperymentów. Umyj oddzielony nabłonek i leżącą pod nim tkankę łączną dwukrotnie w 15 mililitrach świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Przenieś tkanki do trzech mililitrów 0,25% trypsyny EDTA w nowym 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym.

Inkubuj naczynie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając tkanki co pięć minut za pomocą jednomililitrowych końcówek pipety. Dodaj 500 mikrolitrów 5% FBS w DMEM F12, aby zatrzymać reakcję i przenieść pożywkę do pięciomililitrowej probówki wirówkowej o niskim stopniu wiązania. Odwirować zawiesinę komórkową o ciśnieniu 200 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.

Delikatnie ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach DMEM F12 zawierającym 10% FBS i 1% BSA, a następnie przefiltruj komórki za pomocą sitka o długości 70 mikrometrów, a następnie sitka o długości 35 mikrometrów. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 200 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć większość pożywki, pozostawiając od 50 do 300 mikrolitrów jako końcową objętość do ponownego zawieszenia komórek. W zarodkowym języku myszy po prawidłowym trawieniu enzymatycznym widoczna jest przerwa w przestrzeni podnabłonkowej.

W języku dorosłej myszy na udane wstrzyknięcie enzymu wskazuje obrzęk w wstrzykniętych obszarach, co sugeruje, że enzym może być trzymany przez język. Po połączeniu arkuszy nabłonka języków E12,5 i cienkich warstw mezenchymy, ręczne liczenie komórek wykazało, że protokół dał łącznie 63 917 komórek o żywotności 95,2% z arkuszy nabłonka i łącznie 294 333 komórki o żywotności 96,3% z mezenchymy. Kiedy użyto 10 dorosłych języków w wieku ośmiu tygodni, protokół dał 187 333 komórki o żywotności 95,4% z arkuszy nabłonka końca języka, 544 000 komórek o żywotności 96,3% z arkuszy nabłonkowych brodawek okołobrzegowych i 150 500 komórek o żywotności 93% z tkanek łącznych.

Zgodnie z tym protokołem, zdysocjowane komórki mogą być wykorzystane do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i hodowli organoidów testowych 3D w celu zdefiniowania nierozpoznanych testowych komórek progenitorowych pod nabłonkiem językowym.