Name: Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę obrazowania H₂O₂ w żywych neuronach i larwach Danio rerio za pomocą biosensora roGFP2-Orp1. Technika umożliwia wykrywanie reaktywnych form tlenu w czasie rzeczywistym podczas rozwoju układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911), oraz Biuro Wiceprezesa Wykonawczego ds. Badań i Partnerstw na Uniwersytecie Purdue (Grant 210362). Dziękujemy dr Cory'emu J. Weaverowi i Haley Roeder za ustanowienie protokołu hodowli RGC danio pręgowanego. Dziękujemy również Haley Roeder za udostępnienie danych z rysunku 4. Dziękujemy Leah Biasi i Kenny'emu Nguyenowi za pomoc w kulturze RGC. Dziękujemy Gentry Lee za redakcję tekstu. Dziękujemy dr Tobiasowi Dickowi za dostarczenie roGFP2-Orp1 i dr Qing Deng za wektor pCS2+ zawierający roGFP2-Orp1. Rysunek 2 jest tworzony za pomocą Biorender.com.

<ol><li>Bórquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+Physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li>
<li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li>
<li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+of+the+brain%3A+Distribution%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li>
<li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li>
<li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K%2FAkt-dependant+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li>
<li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency%3A+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li>
<li>Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li>
<li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li>
<li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li>
<li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li>
<li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury%3A+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752(2017).</li>
<li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li>
<li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+redox+biology%3A+from+imaging+to+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li>
<li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12(2020).</li>
<li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genomics+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539(2013).</li>
<li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028(2010).</li>
<li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Migration%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li>
<li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nox2%2Fcybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li>
<li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132(2012).</li>
<li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222(2014).</li>
<li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li>
<li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+green+fluorescent+protein%3A+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li>
<li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li>
<li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li>
<li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model%3A+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li>
<li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li>
<li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2%2Frobo2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li>
<li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HyPer+family+probes%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li>
<li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SypHer3s%3A+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Communications%22%5BJournal%5D)">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li>
<li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

W całym tym protokole istnieje kilka krytycznych kroków, które wymagają uwagi. Wierzymy, że uwzględnienie tych punktów poprawi przebieg eksperymentów. W przypadku pierwotnej hodowli RGC sterylność ZFCM(-) jest bardzo ważna, ponieważ pożywka ta nie zawiera antybiotyków i może dojść do zanieczyszczenia przed lub w trakcie obrazowania. Aby tego uniknąć, zalecamy przygotowanie i stosowanie ZFCM(-) wyłącznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego i regularne przygotowywanie świeżych pożywek ZFCM(-) (Krok 1.5). Ponadto zapasy ...

Sygnalizacja za pomocą reaktywnych form tlenu (ROS) reguluje rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego1. Ważnym komórkowym źródłem ROS są oksydazy NADPH (NOX), które są białkami transbłonowymi generującymi anion ponadtlenkowy oraz nadtlenek wodoru (H2O2)2. Enzymy NOX występują w całym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), a ROS pochodzące z NOX przyczyniają się do rozwoju neuronów3,4,5,6. Wykazano, że utrzymanie i różnicowanie komórek macierzystych układu nerwowego, ustalanie polarności neuronów, wzrost neurytów oraz plastyczność synaptyczna wymagają odpowiednich poziomów ROS7,8,9,10,11. Z drugiej strony, niekontrolowana produkcja ROS przez NOX przyczynia się do rozwoju schorzeń neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera, stwardnienia rozsianego oraz urazowych obrażeń mózgu12,13,14. Zatem produkcja fizjologicznie istotnych ROS jest kluczowa dla utrzymania stanu zdrowia.
Opracowanie genetycznie kodowanych biosensorów znacznie ułatwiło detekcję komórkowych ROS. Istotną zaletą genetycznie kodowanych biosensorów jest zwiększona rozdzielczość czasowa i przestrzenna sygnału ROS, ponieważ sensory te mogą być specyficznie kierowane do konkretnych lokalizacji. Jednym z rodzajów takich biosensorów ROS jest białko GFP wrażliwe na utlenianie i redukcję (roGFP). Wariant roGFP2-Orp1 specyficznie wykrywa H2O2 za pomocą domeny Orp1, która jest białkiem z rodziny peroksiredoksyn glutationowych pochodzącym z drożdży15,16. Utlenienie białka Orp1 jest przenoszone na roGFP2, co zmienia jego konformację (Rycyna 1A). Sonda wykazuje dwa piki pobudzenia w pobliżu 405 nm i 480 nm oraz pojedynczy pik emisji przy 515 nm. Po utlenieniu zmienia się intensywność fluorescencji wokół pików pobudzenia: podczas gdy pobudzenie przy 405 nm wzrasta, pobudzenie przy 480 nm maleje. W związku z tym roGFP2-Orp1 jest biosensorem ratiometrycznym, a poziomy H2O2 są wykrywane na podstawie stosunku intensywności fluorescencji wzbudzanej przy dwóch różnych długościach fal (Rycina 1B). Ogólnie roGFP2-Orp1 jest wszechstronnym narzędziem do obrazowania ROS, które może być efektywnie wykorzystywane in vivo.
<img alt="Utlenianie Orp1-roGFP2 przez H2O2; zmiana intensywności fluorescencji; schemat utleniania-redukcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny opis i widma wzbudzenia roGFP2-Orp1. (A) Przeniesienie utleniacza zachodzi między Orp1 a roGFP2 w odpowiedzi na H2O2, co prowadzi do zmian konformacyjnych w roGFP2. (B) Widma wzbudzenia roGFP2-Orp1 wykazują dwa piki wzbudzenia przy 405 nm i 480 nm oraz pojedynczy pik emisji przy 515 nm. Po utlenieniu przez H2O2 wzbudzenie przy 405 nm wzrasta, podczas gdy wzbudzenie przy 480 nm spada. Skutkuje to ratiometrycznym odczytem obecności H2O2 . Rysunek został zmodyfikowany na podstawie prac Bilan i Belousov (2017)16 oraz Morgan i wsp. (2011)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Model system Danio rerio (danio pręgowany) posiada szereg zalet w kontekście zastosowania genetycznie kodowanych biosensorów. Przezroczystość optyczna embrionów i larw umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo. Opracowywane są nowe narzędzia obrazowania, aby osiągnąć wyższą rozdzielczość i głębszą penetrację17. Ponadto istnieją sprawdzone narzędzia do manipulacji genetycznych (ektopowa ekspresja mRNA, transgeneza Tol2 itp.) oraz edycji genomu (TALENs, CRISPR/Cas9 itp.), co sprzyja generowaniu zwierząt transgenicznych18. Ponieważ embriony danio pręgowanego rozwijają się poza organizmem matki, system ten zapewnia dodatkowo łatwiejszy dostęp do embrionów i możliwość ich manipulowania. Przykładowo, bez trudu można przeprowadzić iniekcje w stadium jednego komórki oraz podawać leki.
W niniejszej pracy wykorzystaliśmy rybki danio do przejściowej ekspresji specyficznego dla H2O2 biosensora roGFP2-Orp1 poprzez wstrzyknięcie mRNA transkrybowanego in vitro. Embriony te mogą być wykorzystywane zarówno do obrazowania in vitro hodowanych neuronów, jak i obrazowania in vivo (Rysunek 2). Opisujemy protokół preparatyki i wysiewania komórek zwojowych siatkówki (RGCs) z embrionów rybek danio, a następnie ocenę poziomu H2O2 w hodowanych neuronach. Następnie przedstawiamy metodę obrazowania in vivo embrionów i larw wykazujących ekspresję roGFP2-Orp1 przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Podejście to pozwala nie tylko na określenie fizjologicznych poziomów H2O2, ale także na badanie potencjalnych zmian zachodzących w różnych stadiach rozwojowych lub warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, system ten stanowi niezawodną metodę detekcji H2O2 w żywych komórkach i zwierzętach, umożliwiając badanie roli H2O2 w rozwoju, zdrowiu i chorobach.
<img alt="Schemat edycji genów mRNA roGFP2-orp1; eksperyment obrazowania in vitro/in vivo u rybek zebrafish." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Schemat podejścia eksperymentalnego. Krótko mówiąc, po pobraniu zarodków, mRNA roGFP2-Orp1 wstrzykuje się do żółtka zarodków danio pręgowanego w stadium jednego komórki. Rozwijające się zarodki mogą być wykorzystane zarówno do (A) in vitro oraz (B) in vivo obrazowanie. (AZarodki wykazujące pozytywną ekspresję GFP są wykorzystywane do wycięcia siatkówek w celu pobrania komórek zwojowych siatkówki (RGC) w 34. godzinie po zapłodnieniu (hpf). Dysocjowane komórki RGC wysiewa się na szkiełka nakrywkowe pokryte PDL/lamininą w pożywce ZFCM (+). Obrazowanie stożków wzrostu można przeprowadzić w czasie, gdy komórki RGC wydłużają swoje aksony po 6–24 godzinach od wysiania. Komórki można poddać różnym zabiegom w celu pomiaru potencjalnych zmian w H2O2-poziomy. Tutaj zmierzyliśmy H2O2-poziomy w stożkach wzrostu komórek zwoju siatkówkowego (RGC) (czerwone). (B) embriony GFP-dodatnie są wykorzystywane do in vivo obrazowanie. Po osiągnięciu pożądanego wieku zarodki można znieczulić i umieścić na szalkach z szklanym dnem o średnicy 35 mm do obrazowania konfokalnego. W tym przypadku zarodki są montowane stroną brzuszną w celu obrazowania siatkówki. Schemat przedstawia rozwój siatkówki u ryb danio. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) tworzą warstwę komórek zwojowych (GCL), która jest najbardziej wewnętrzną warstwą siatkówki. Aksony RGC przekształcają się w nerw wzrokowy, który przecina linię środkową, tworząc skrzyżowanie wzrokowe. Następnie aksony RGC rosną grzbietowo, tworząc synapsy w wzgórzu optycznym w śródmózgowiu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Naczynie hodowlane 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83-3900</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter/Fisher Scientific</td><td>NC9029378</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego (100 x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-094</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ThermoFisher Scientific</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma Aldich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td> do<td>form wtryskowych</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna</td><td>Zeiss</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 Medium z czerwienią fenolową</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>11-415-064</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>21-083-027</td><td></td></tr><tr><td>Niskotopliwa agaroza</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Zestaw do transkrypcji mMachine SP6</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone/Fisher Scientific</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma Aldich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma Aldich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna (PDL)</td><td>Sigma Aldich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QiaQUICK PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz szczelina2</td><td>R& D Systems</td><td>5444-SL-050</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma Aldich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 0,22 i mikro; m filtr</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Ambion</td><td>AM9860</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Sigma Aldich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do pipet</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek ros podczas rozwoju neuronów

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reaktywne formy tlenu (ROS) są dobrze znanymi cząsteczkami sygnałowymi, które są ważne w prawidłowym rozwoju, homeostazie i fizjologii. Spośród różnych ROT nadtlenek wodoru (H2O2) jest najlepiej scharakteryzowany pod względem ról w sygnalizacji komórkowej. H2O2 został zaangażowany podczas rozwoju u kilku gatunków. Na przykład przejściowy wzrostH2O2 wykryto w zarodkach danio pręgowanego w pierwszych dniach po zapłodnieniu. Ponadto wyczerpanie ważnego komórkowego źródłaH2O2, oksydazy NADPH (NOX), upośledza rozwój układu nerwowego, taki jak różnicowanie, wzrost aksonów i kierowanie komórkami zwojowymi siatkówki (RGC) zarówno in vivo, jak i in vitro. W tym miejscu opisujemy metodę obrazowania wewnątrzkomórkowych poziomówH2O2w hodowanych neuronach danio pręgowanego i całych larwach podczas rozwoju przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora specyficznego dlaH2O2, roGFP2-Orp1. Sonda ta może być przejściowo lub stabilnie wyrażana w larwach danio pręgowanego. Co więcej, odczyt ratiometryczny zmniejsza prawdopodobieństwo wykrycia artefaktów z powodu różnicowej ekspresji genów lub efektów objętościowych. Po pierwsze, pokazujemy, jak izolować i hodować RGC pochodzące z zarodków zebry danio pręgowanego, które przejściowo eksprymują roGFP2-Orp1. Następnie używamy całych larw do monitorowania poziomuH2O2na poziomie tkanki. Czujnik został zwalidowany przez dodanieH2O2. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do pomiaru poziomówH2O2w określonych typach komórek i tkankach poprzez generowanie zwierząt transgenicznych z ekspresją biosensorów specyficzną dla danej tkanki. Ponieważ danio pręgowany ułatwia manipulacje genetyczne i rozwojowe, zademonstrowane tutaj podejście może posłużyć jako narzędzie do testowania roliH2O2podczas rozwoju neuronalnego i ogólnego rozwoju embrionalnego u kręgowców.

Hodowlane komórki zwoju siatkówkowego (RGCs) rybki zebrafish wydłużają aksony w ciągu 1d. Reprezentatywny obraz stosunku 405/480 biosensora H2O2 przedstawiono na Rysunku 4A. W poszczególnych neuronach wyraźnie widoczne są ciało komórki, akson oraz stożki wzrostu. Neurony te mogą być poddawane różnym zabiegom w czasie w celu monitorowania zmian stężenia H2O2. Wcześniej wykazaliśmy, że dodanie 100 µM H2O2 do pożywki zwiększa war...

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Nasz protokół opisuje zastosowanie biosensora nadtlenku wodoru w hodowanych neuronach i larwach danio pręgowanego. Protokół ten pomoże naukowcom przeanalizować rolę reaktywnych form tlenu w prawidłowej fizjologii i patofizjologii. Główną zaletą tej techniki jest wykrywanie w czasie rzeczywistym nadtlenku wodoru u żywych zwierząt i hodowanych komórek.Ta metoda może być stosowana do innych zwierząt, takich jak system modelowania gryzoni. Do przygotowania szkiełek nakrywkowych należy użyć szkiełek nakrywkowych oczyszczonych kwasem przechowywanych w 100% etanolu. Użyj kleszczyków, aby usunąć jedno szkiełko nakrywkowe z pojemnika do przechowywania i podpal go, aby usunąć resztki etanolu.Całkowicie wysuszyć szkiełko nakrywkowe na powietrzu, umieszczając je pod kątem w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 milimetrów. Przygotuj poli-D-lizynę lub PDL lub roztwór roboczy. Nałożyć PDL na środek każdego szkiełka nakrywkowego, unikając rozprowadzania roztworu na krawędziach i inkubować PDL przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej.Upewnij się, że PDL nie wysycha. Umyj PDL 0,5 mililitra sterylnej wody i pozostaw płytki do całkowitego wyschnięcia. Przygotuj roztwór roboczy z lamininą.I nałóż go na środek każdego szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie rozlać roztworu na krawędzie. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze przez dwie do sześciu godzin, unikając suszenia roztworu lamininy. Aby przeprowadzić sekcję zarodków w płytkowych komórkach zwojowych siatkówki lub RGC, przygotuj i oznacz cztery 35-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych i napełnij je czterema mililitrami 70% etanolu.Nośnik E2 jeden. E2 media dwa. I E2 media trzy, w dniu sekcji.Naczynia przechowuj w lodówce. Gdy zarodki danio pręgowanego znajdą się 34 godziny po zapłodnieniu, wyjmij z inkubatora szalki hodowlane pokryte lamininą. I umyj szkiełka okładkowe trzy razy 0,5 mililitra 1X PBS.Po ostatnim umyciu dodaj cztery mililitry pożywki ZFCM + do każdej pożywki hodowlanej. Unikaj suszenia talerza. Wyjmij przygotowane schłodzone naczynia hodowlane i pozwól im wyrównać się do temperatury pokojowej.Napełnij od czterech do sześciu probówek PCR 15 mikrolitrami pożywki ZFCM +. Wyjmij zarodki danio pręgowanego z inkubatora i zanurz je w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych zawierającym 70% etanolu na 5-10 sekund, aby je wysterylizować. Za pomocą pipety przenieś zarodki do pożywki E2 w jednej szalce, zawierającej sterylne podłoże E2 w celu zmycia nadmiaru etanolu.Następnie przenieś zarodki do dwutorowej pożywki E2 i usuń ich kosmówkę ostrymi kleszczami. Na koniec przenieś zarodki do pożywki E2 trzy szalki w celu przeprowadzenia sekcji. Za pomocą cienkich kleszczy umieść i przytrzymaj zarodki przed żółtkiem za pomocą jednego z kleszczyków.I usuń ogon z tyłu woreczka żółtkowego za pomocą innych kleszczy. Chwyć szyję kleszczami i zdejmij głowę, aby wystawić mózg i oczy na działanie pożywki E2. Czubkiem cienkich kleszczyków delikatnie przewróć oczy od głowy, jednocześnie przytrzymując tkankę czaszki drugim kleszczem.Przenieś cztery oczy do jednej z wcześniej przygotowanych probówek zawierających ZFCM + Delikatnie rozcieraj w górę iw dół pipetą p20 około 45 razy, aby zdysocjować komórki. Przenieś ZFCM+ ze zdysocjowanymi komórkami do środka szkiełek nakrywkowych. Utrzymuj kultury na blacie stołu w temperaturze 22 stopni Celsjusza na stojaku z pianki polistyrenowej, aby pochłaniać wibracje.W dniu obrazowania sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić wzrost aksonów RGC. W przypadku obrazowania żywych komórek przenieś szkiełka nakrywkowe z szalki hodowlanej do komory obrazowania żywych komórek. Użyj odwróconego mikroskopu wyposażonego w czerwony filtr DIC obiektyw OG-590 Longpass i kamerę EMCCD.Przed obrazowaniem zastąp ZFCM+medium na ZFCM - Po ustawieniu komórek za pomocą obiektywu 10X, uzyskaj obrazy w powiększeniu 60X za pomocą obiektywu immersyjnego z olejkiem. Użyj dodatkowego powiększenia 1,5x. Najpierw uzyskaj obrazy DIC.Następnie zobrazuj roGFP2-Orp1, używając odpowiedniego zestawu filtrów. Po wykonaniu pierwszego zestawu obrazów należy wymienić pożywkę na pożywkę zawierającą różne roztwory do obróbki. Pożywki należy wymieniać co 30 minut obrazowania, aby uniknąć zmian pH i osmolarności.W przypadku obrazowania in vivo należy przechowywać zarodki w pożywce E3 przez 22 do 24 godzin po zapłodnieniu, zawierającej 0,003% tiomocznika fenylowego bez błękitu metylenowego. Wymieniaj się pożywką i codziennie usuwaj martwe zarodki. W pożądanym wieku znieczulić i zamontować zarodki w 1% agarozie na 35-milimetrowych szklanych naczyniach hodowlanych.Zarodki mogą być zorientowane grzbietowo, brzusznie lub bocznie, w zależności od obszaru zainteresowania do obrazowania. Po zestaleniu się agarozy napełnij naczynia pożywką E3 bez błękitu metylenowego, ale z 0,016% trikainą. Ustaw mikroskop do obrazowania.Użyj odwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować zarodki zamontowane na dnie kropli agarozy. Wzbudz roGFP2-Orp1 i uzyskaj odpowiednie obrazy z żądanymi filtrami emisyjnymi. Zdobądź stosy z sekcją o grubości pięciu mikrometrów przez żądaną część zarodków.Po obrazowaniu usuń zarodki z agarozy za pomocą cienkich kleszczyków i trzymaj je w inkubatorze i pożywce wolnej od błękitu metylenowego z tiomocznikiem fenylowym do pożądanego wieku. Reprezentatywny obraz biosensora nadtlenku wodoru i rozszerzonych aksonów RGC hodowanego danio pręgowanego pokazano tutaj. Ciało komórki, akson i stożki wzrostu są wyraźnie widoczne w poszczególnych neuronach.Dodanie nadtlenku wodoru do pożywki hodowlanej zwiększa wartości proporcji, co pokazuje, że za pomocą tego systemu można wykryć zmiany w czasie rzeczywistym. Kwantyfikacja poziomów nadtlenku wodoru jest pokazana w panelu B.To określenie poziomu nadtlenku wodoru w całych zarodkach danio pręgowanego, mRNA wstrzyknięto podczas jednego etapu komórkowego, powodując ekspresję biosensora roGFP2-Orp1 we wszystkich tkankach. Obszar głowy larw danio pręgowanego jest pokazany w dwóch różnych punktach czasowych, skupiając się na poziomach nadtlenku wodoru w siatkówce.Zmierzono podstawowe poziomy nadtlenku wodoru w zarodkach danio pręgowanego dwa dni po zapłodnieniu i pięć dni po zapłodnieniu. Po dwóch dniach od zapłodnienia wartości współczynnika były znacznie niższe niż po pięciu dniach od zapłodnienia. Co więcej, każde zwierzę wykazywało inny poziom wzrostu zawartości nadtlenku wodoru w siatkówce.Użycie cienkich kleszczyków do usunięcia oczu i delikatne oddzielenie oczu od pipety to najważniejsze kroki w tej procedurze. Protokół ten może być stosowany w leczeniu farmakologicznym w celu zbadania czynników zaangażowanych w sygnalizację ROS.

ros-live-cell-imaging-during-neuronal-development

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Ten film demonstruje technikę wykrywania poziomów nadtlenku wodoru w czasie rzeczywistym w komórkach zwojowych siatkówki za pomocą biosensora roGFP2-Orp1 i technik obrazowania żywych komórek. Przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek, obrazowaniem fluorescencyjnym i ilościowym oznaczaniem poziomów nadtlenku wodoru.

Wykrywanie poziomu nadtlenku wodoru w hodowanych neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek

Źródło: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronów. J. vis. exp. (2017){{}} . Film przedstawia proces przygotowania, obrazowania i śledzenia dorosłych nerwowych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w celu zbadania zachowań komórek, w tym podziału i różnicowania.

 Obrazowanie na żywo i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania linii neuronalnej w dorosłych nerwowych komórkach macierzystych

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie do badania zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym. W tym miejscu opisujemy protokół wideomikroskopii poklatkowej pierwotnych komórek kory mózgowej, który umożliwia szczegółowe badanie faz odgrywanych podczas progresji linii od pierwotnych nerwowych komórek macierzystych do zróżnicowanych neuronów i gleju.

Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Poznaj metodę obrazowania H₂O₂ w żywych neuronach i larwach Danio rerio za pomocą biosensora roGFP2-Orp1. Technika umożliwia wykrywanie reaktywnych form tlenu w czasie rzeczywistym podczas rozwoju układu nerwowego.

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Przeglądaj więcej filmów