Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Nasz protokół opisuje zastosowanie biosensora nadtlenku wodoru w hodowanych neuronach i larwach danio pręgowanego. Protokół ten pomoże naukowcom przeanalizować rolę reaktywnych form tlenu w prawidłowej fizjologii i patofizjologii. Główną zaletą tej techniki jest wykrywanie w czasie rzeczywistym nadtlenku wodoru u żywych zwierząt i hodowanych komórek.

Ta metoda może być stosowana do innych zwierząt, takich jak system modelowania gryzoni. Do przygotowania szkiełek nakrywkowych należy użyć szkiełek nakrywkowych oczyszczonych kwasem przechowywanych w 100% etanolu. Użyj kleszczyków, aby usunąć jedno szkiełko nakrywkowe z pojemnika do przechowywania i podpal go, aby usunąć resztki etanolu.

Całkowicie wysuszyć szkiełko nakrywkowe na powietrzu, umieszczając je pod kątem w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 milimetrów. Przygotuj poli-D-lizynę lub PDL lub roztwór roboczy. Nałożyć PDL na środek każdego szkiełka nakrywkowego, unikając rozprowadzania roztworu na krawędziach i inkubować PDL przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że PDL nie wysycha. Umyj PDL 0,5 mililitra sterylnej wody i pozostaw płytki do całkowitego wyschnięcia. Przygotuj roztwór roboczy z lamininą.

I nałóż go na środek każdego szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie rozlać roztworu na krawędzie. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze przez dwie do sześciu godzin, unikając suszenia roztworu lamininy. Aby przeprowadzić sekcję zarodków w płytkowych komórkach zwojowych siatkówki lub RGC, przygotuj i oznacz cztery 35-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych i napełnij je czterema mililitrami 70% etanolu.

Nośnik E2 jeden. E2 media dwa. I E2 media trzy, w dniu sekcji.

Naczynia przechowuj w lodówce. Gdy zarodki danio pręgowanego znajdą się 34 godziny po zapłodnieniu, wyjmij z inkubatora szalki hodowlane pokryte lamininą. I umyj szkiełka okładkowe trzy razy 0,5 mililitra 1X PBS.

Po ostatnim umyciu dodaj cztery mililitry pożywki ZFCM + do każdej pożywki hodowlanej. Unikaj suszenia talerza. Wyjmij przygotowane schłodzone naczynia hodowlane i pozwól im wyrównać się do temperatury pokojowej.

Napełnij od czterech do sześciu probówek PCR 15 mikrolitrami pożywki ZFCM +. Wyjmij zarodki danio pręgowanego z inkubatora i zanurz je w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych zawierającym 70% etanolu na 5-10 sekund, aby je wysterylizować. Za pomocą pipety przenieś zarodki do pożywki E2 w jednej szalce, zawierającej sterylne podłoże E2 w celu zmycia nadmiaru etanolu.

Następnie przenieś zarodki do dwutorowej pożywki E2 i usuń ich kosmówkę ostrymi kleszczami. Na koniec przenieś zarodki do pożywki E2 trzy szalki w celu przeprowadzenia sekcji. Za pomocą cienkich kleszczy umieść i przytrzymaj zarodki przed żółtkiem za pomocą jednego z kleszczyków.

I usuń ogon z tyłu woreczka żółtkowego za pomocą innych kleszczy. Chwyć szyję kleszczami i zdejmij głowę, aby wystawić mózg i oczy na działanie pożywki E2. Czubkiem cienkich kleszczyków delikatnie przewróć oczy od głowy, jednocześnie przytrzymując tkankę czaszki drugim kleszczem.

Przenieś cztery oczy do jednej z wcześniej przygotowanych probówek zawierających ZFCM + Delikatnie rozcieraj w górę iw dół pipetą p20 około 45 razy, aby zdysocjować komórki. Przenieś ZFCM+ ze zdysocjowanymi komórkami do środka szkiełek nakrywkowych. Utrzymuj kultury na blacie stołu w temperaturze 22 stopni Celsjusza na stojaku z pianki polistyrenowej, aby pochłaniać wibracje.

W dniu obrazowania sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić wzrost aksonów RGC. W przypadku obrazowania żywych komórek przenieś szkiełka nakrywkowe z szalki hodowlanej do komory obrazowania żywych komórek. Użyj odwróconego mikroskopu wyposażonego w czerwony filtr DIC obiektyw OG-590 Longpass i kamerę EMCCD.

Przed obrazowaniem zastąp ZFCM+medium na ZFCM - Po ustawieniu komórek za pomocą obiektywu 10X, uzyskaj obrazy w powiększeniu 60X za pomocą obiektywu immersyjnego z olejkiem. Użyj dodatkowego powiększenia 1,5x. Najpierw uzyskaj obrazy DIC.

Następnie zobrazuj roGFP2-Orp1, używając odpowiedniego zestawu filtrów. Po wykonaniu pierwszego zestawu obrazów należy wymienić pożywkę na pożywkę zawierającą różne roztwory do obróbki. Pożywki należy wymieniać co 30 minut obrazowania, aby uniknąć zmian pH i osmolarności.

W przypadku obrazowania in vivo należy przechowywać zarodki w pożywce E3 przez 22 do 24 godzin po zapłodnieniu, zawierającej 0,003% tiomocznika fenylowego bez błękitu metylenowego. Wymieniaj się pożywką i codziennie usuwaj martwe zarodki. W pożądanym wieku znieczulić i zamontować zarodki w 1% agarozie na 35-milimetrowych szklanych naczyniach hodowlanych.

Zarodki mogą być zorientowane grzbietowo, brzusznie lub bocznie, w zależności od obszaru zainteresowania do obrazowania. Po zestaleniu się agarozy napełnij naczynia pożywką E3 bez błękitu metylenowego, ale z 0,016% trikainą. Ustaw mikroskop do obrazowania.

Użyj odwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować zarodki zamontowane na dnie kropli agarozy. Wzbudz roGFP2-Orp1 i uzyskaj odpowiednie obrazy z żądanymi filtrami emisyjnymi. Zdobądź stosy z sekcją o grubości pięciu mikrometrów przez żądaną część zarodków.

Po obrazowaniu usuń zarodki z agarozy za pomocą cienkich kleszczyków i trzymaj je w inkubatorze i pożywce wolnej od błękitu metylenowego z tiomocznikiem fenylowym do pożądanego wieku. Reprezentatywny obraz biosensora nadtlenku wodoru i rozszerzonych aksonów RGC hodowanego danio pręgowanego pokazano tutaj. Ciało komórki, akson i stożki wzrostu są wyraźnie widoczne w poszczególnych neuronach.

Dodanie nadtlenku wodoru do pożywki hodowlanej zwiększa wartości proporcji, co pokazuje, że za pomocą tego systemu można wykryć zmiany w czasie rzeczywistym. Kwantyfikacja poziomów nadtlenku wodoru jest pokazana w panelu B.To określenie poziomu nadtlenku wodoru w całych zarodkach danio pręgowanego, mRNA wstrzyknięto podczas jednego etapu komórkowego, powodując ekspresję biosensora roGFP2-Orp1 we wszystkich tkankach. Obszar głowy larw danio pręgowanego jest pokazany w dwóch różnych punktach czasowych, skupiając się na poziomach nadtlenku wodoru w siatkówce.

Zmierzono podstawowe poziomy nadtlenku wodoru w zarodkach danio pręgowanego dwa dni po zapłodnieniu i pięć dni po zapłodnieniu. Po dwóch dniach od zapłodnienia wartości współczynnika były znacznie niższe niż po pięciu dniach od zapłodnienia. Co więcej, każde zwierzę wykazywało inny poziom wzrostu zawartości nadtlenku wodoru w siatkówce.

Użycie cienkich kleszczyków do usunięcia oczu i delikatne oddzielenie oczu od pipety to najważniejsze kroki w tej procedurze. Protokół ten może być stosowany w leczeniu farmakologicznym w celu zbadania czynników zaangażowanych w sygnalizację ROS.