Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Metoda ta pozwala na wizualizację mózgu danio pręgowanego w późniejszych stadiach larwalnych, co pozwala na obserwację architektury neuronalnej w bardzo szczegółowy sposób in vivo, co wcześniej nie było możliwe. Komórki barwnikowe, które pojawiły się podczas późniejszego rozwoju larwalnego i uniemożliwiają mózgowi wyraźne obrazowanie, nie stanowią problemu w tej metodzie, ponieważ są po prostu usuwane. Dzięki tej metodzie powinno możliwe badanie procesów zachodzących na późniejszych etapach rozwoju larwalnego mózgu, procesów wpływających na plastyczność synaptyczną, degenerację neuronów lub ich regenerację.

Przed rozpoczęciem eksperymentu za pomocą ściągacza do mikropipet należy przygotować ostre, cienkie, szklane igły ze szklanych naczyń włosowatych. Następnie za pomocą plastikowej pipety Pasteura należy zebrać larwy na szalkę Petriego o średnicy 90 milimetrów zawierającą odpowiedni roztwór. Przenieś wybraną larwę na szalkę Petriego o średnicy 35 milimetrów zawierającą ACSF i umieść kwadratową, szklaną szkiełko o wymiarach 24 na 24 milimetry w pokrywie szalki Petriego.

Następnie porcjować objętość ACSF potrzebną do eksperymentu do odpowiedniej fiolki do natleniania karbogenem. Aby osadzić larwę, użyj pipety Pasteura, aby przenieść znieczuloną larwę do komory montażowej pod mikroskopem stereoskopowym. Jeśli jakakolwiek larwa jest nadal w stanie się poruszać, nie używaj ryb do eksperymentu, dopóki ryby nie będą całkowicie niezdolne do poruszania się.

Gdy larwy są nieruchome, ostrożnie usuń nadmiar pożywki i natychmiast dodaj na larwę co najmniej jeden mililitr niskotopliwej agarozy. Ustaw danio pręgowanego tak, aby obszar grzbietowy był skierowany do góry jak najbliżej powierzchni agarozy. Jeśli larwa zostanie zobrazowana za pomocą odwróconego mikroskopu, po zestaleniu należy przyciąć agarozę zawierającą larwę do małego prostopadłościennego bloku.

Aby wystawić mózg do obrazowania, w razie potrzeby odetnij nadmiar agarozy nad obszarem mózgu będącym przedmiotem zainteresowania i użyj szklanej igły, aby wykonać małe nacięcie przez skórę w pobliżu, ale nie nad obszarem zainteresowania, nie wnikając zbyt głęboko w tkankę. Ledwo przesuwając igłę tuż pod powierzchnią skóry, kontynuuj ostrożne wykonywanie bardzo małych nacięć wokół obszaru zainteresowania, aż skóra nad obszarem zainteresowania będzie mogła zostać usunięta lub odsunięta na bok. Po usunięciu tkanki ze wszystkich zarodków dodaj małą kroplę niskotopliwej agarozy do wcześniej przygotowanej komory obrazowania mikroskopu odwróconego i za pomocą małej szpatułki obróć prostopadłościenny blok agarozy o 180 stopni na kroplę agarozy w komorze obrazowania.

Gdy agaroza zastygnie, napełnij komorę obrazowania świeżym ACSF i rozpocznij obrazowanie larwy. Tutaj można zaobserwować nienaruszoną transgeniczną larwę 14 dni po zapłodnieniu z nienaruszoną czaszką. Jak pokazano, komórki pigmentowe w nakładającej się skórze są rozmieszczone po całej głowie, zakłócając sygnał fluorescencyjny w obszarze zainteresowania.

Po operacji otwartej czaszki obszar zainteresowania staje się swobodnie dostępny do szczegółowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Bariera skórna, czaszka i/lub krew-mózg również utrudniają przenikanie substancji do mózgu, co ilustruje silne barwienie barwnikiem jądrowym obserwowane w tych komórkach mózgowych dopiero po operacji otwartej czaszki. Zalety te obserwuje się również po 30 dniach od zapłodnienia.

U transgenicznych ryb zawierających fluorescencyjne unaczynienie mózgu spowodowane ekspresją czerwonego białka fluorescencyjnego, mCherry, w komórkach śródbłonka, kodowanie kolorami na wartościach głębokości stosu obrazów pokazuje, że nawet naczynia krwionośne głęboko zakopane w mózgu do prawie 250 mikronów są nadal wyraźnie widoczne i możliwe do prześledzenia. Wykonując tę procedurę, należy zawsze pamiętać, że jest to operacja na żywym zwierzęciu. Dlatego wymaga szacunku i skoncentrowanego umysłu.

Po tej procedurze można przeprowadzić rejestrację morfologii neuronów, w tym struktur synaptycznych, fizjologicznych i zdarzeń transportu wewnątrzkomórkowego u larw starszych niż siedem dni po zapłodnieniu. Mamy nadzieję, że dzięki tej technice uda nam się uzyskać podejście, które pozwoli na badanie również procesów komórkowych w mózgu, które zachodzą w późniejszych stadiach larwalnych i które są zaangażowane w ustalanie, na przykład, tak złożonych zachowań, jak zachowania społeczne lub podejmowanie decyzji.