Name: Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Naucz się metody CLARITY do barwienia immunologicznego całych siatkówek myszy. Protokół umożliwia trójwymiarowe obrazowanie neuronów siatkówki z rozdzielczością subkomórkową, wspierając badania morfologii neuronalnej w stanach chorobowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Bing Ye, Nathanowi Spix i Hao Liu za wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) oraz Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).

Opieka nad myszami i wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dla zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Oakland (protokół nr 18071).
UWAGA: Nazwy roztworów i ich składy są wymienione w Tabeli 1.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji z przedawkowaniem CO2, a następnie zwichnięciem szyjki macicy.</li>
	<li>Wyłuszczyć oczy zakrzywionymi kleszczami i przenieść je na małą szalkę Petriego z 0,1 M PBS (Tabela 1). Pod mikroskopem preparacyjnym przebij igłą mały otwór wzdłuż połączenia rogówka-twardówka. Przenieś do 4% paraformaldehydu (PFA) na 1 godzinę.</li>
	<li>Przenieś oko z powrotem do naczynia z PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć całe połączenie rogówka-twardówka. Usuń rogówkę i soczewkę. Przeciąć u podstawy nerwu wzrokowego i ostrożnie oderwać twardówkę kleszczami, aby odizolować siatkówkę.</li>
	<li>Wykonaj cztery małe nacięcia równomiernie wokół siatkówki i użyj cienkiej końcówki szczotki zanurzonej w PBS, aby ułożyć ją płasko (GCL stroną do dołu) w kształcie koniczyny na małym kwadracie wyciętym z bibuły filtracyjnej nitrocelulozy, aby ustabilizować siatkówkę.</li>
	<li>Przenieś siatkówkę za pomocą kleszczy, aby przytrzymać róg papieru nitrocelulozowego (bez dotykania zamontowanej siatkówki) i umieść ją na 48-dołkowej płytce z 4% PFA na 1 godzinę.</li>
	<li>Przenieś bibułę filtracyjną i siatkówkę do studzienki z PBS i przepłucz (3x po 5 minut).</li>
	<li>Przenieść do A4P0 (tabela 1) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Odpipetować olej roślinny do studzienki, aby całkowicie pokryć roztwór A4P0. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 40 °C przez 3 godziny bez wstrząsania.</li>
	<li>Umyj (3x po 5 min) w PBS, upewniając się, że cały olej został spłukany. W razie potrzeby użyj pipety, aby ostrożnie usunąć pozostały olej z górnej części studzienki przed ostatnim płukaniem.</li>
	<li>Inkubować w 10% SDS w temperaturze 40 °C przez dwa dni, delikatnie wstrząsając. Zastąp SDS świeżym roztworem na drugi dzień.</li>
	<li>Przenieś bibułę filtracyjną i siatkówkę do PBS za pomocą Triton-X-100 (PBST, Tabela 1) i przepłucz (5x po 1,5 godziny).</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C w PBST z 0,01% azydkiem sodu (NaN 3) lub przejść bezpośrednio do barwienia immunologicznego.</li>
</ol>
2. Barwienie immunologiczne i dopasowanie współczynnika załamania światła
<ol>
	<li>Usuń siatkówkę z bibuły filtracyjnej, delikatnie odklejając ją szczoteczką z cienką końcówką w PBST.</li>
	<li>Inkubować siatkówkę w przeciwciałie pierwszorzędowym (Tabela 2) rozcieńczonym w roztworze blokującym (Tabela 1) przez 2 dni w temperaturze 40 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Prać (5x, po 1,5 h) w PBST.</li>
	<li>Inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (tabela 3) rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez 2 dni w temperaturze 40 °C, delikatnie wstrząsając i chronić przed światłem przez pozostałą część procedury.</li>
	<li>Przemyć (5x, po 1,5 h) w 0,02 M buforze fosforanowym (patrz tabela 1).</li>
	<li>Inkubować w roztworze do dopasowywania współczynnika załamania światła na bazie sorbitolu (sRIMS, patrz Tabela 1) w temperaturze 40 °C przez noc, delikatnie wstrząsając.</li>
</ol>
3. Montaż
<ol>
	<li>Obrysuj szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm x 1,5 mm markerem permanentnym z cienką końcówką, aby zaznaczyć kwadratową granicę na odwrocie szklanego szkiełka mikroskopowego.</li>
	<li>Odwróć szkiełko i za pomocą strzykawki obrysuj granicę cienką linią smaru silikonowego z przodu prowadnicy, pozostawiając niewielką szczelinę w jednym rogu, aby nadmiar roztworu montażowego mógł się wydostać.</li>
	<li>Przenieś siatkówkę do środka ograniczonego obszaru i ułóż ją szczoteczką z cienką końcówką tak, aby leżała płasko stroną fotoreceptora przy szklanym szkiełku.</li>
	<li>Odpipetować około 60 μl sRIMS tak, aby pokrył spłaszczoną siatkówkę i rozciągał się do jednego rogu obudowy, uważając, aby siatkówka pozostała płaska i na swoim miejscu.</li>
	<li>Nałóż szkiełko nakrywkowe, zaczynając od rogu z obręczami sRIMS i powoli opuść, aż dotknie smaru ze wszystkich stron, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Umieść stos 3 szkiełek nakrywkowych po każdej stronie zamontowanej siatkówki jako przekładkę. Użyj dłuższej krawędzi innego szkiełka, aby docisnąć szkiełko nakrywkowe, tak aby mocowanie było płaskie i równe.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać płasko w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Próbki obrazowe można obrazować pod konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym (tabela materiałów). Zacznij od umieszczenia szkiełka na stoliku mikroskopu i zlokalizowania próbki. 
	UWAGA: Jeśli używany jest odwrócony mikroskop obiektywowy, umieść szkiełko do góry nogami na stage, najpierw upewniając się, że odsłonięte obszary szkiełka są wolne od smaru silikonowego i roztworu montażowego.</li>
	<li>Aby uzyskać obrazy ze stosem z, należy najpierw skupić się na sygnale w każdym kanale z osobna i ustawić czas ekspozycji lub prędkość skanowania, odpowiednio dla mikroskopów fluorescencyjnych lub konfokalnych.</li>
	<li>Ustaw zakres dla stosu z, ręcznie ustawiając płaszczyznę ogniskowej na górze i na dole żądanego zakresu lub ustawiając punkt środkowy, a następnie określając zakres wokół punktu środkowego.</li>
	<li>Dostosuj rozmiar kroku lub liczbę plasterków zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Przechwyć obraz i zapisz oryginalny plik, a także wyeksportuj go jako plik TIFF lub inny żądany format.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Użyj wybranego oprogramowania do analizy obrazu (Tabela materiałów), aby dostosować jasność i kontrast w każdym kanale, aż do uzyskania optymalnej klarowności zarówno pojedynczych obrazów, jak i trójwymiarowego renderowania z-stack. 
	UWAGA: Jeśli wybrany rozmiar kroku jest wystarczająco mały, można również przeprowadzić dekonwolucję 3D w celu wzmocnienia sygnału.</li>
</ol>

<ol><li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li>
<li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+the+mammalian+retina%3A+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li>
<li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li>
<li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647(2012).</li>
<li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li>
<li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332(2013).</li>
<li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+CLARITY%3A+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li>
<li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+dopaminergic+neurons%3A+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Modyfikacja protokołu CLARITY dla całych siatek siatkówki. Uprościliśmy protokół CLARITY, aby osiągnąć odpowiednią polimeryzację bez konieczności stosowania próżniowej komory opróżniającej lub osuszającej, jak to jest stosowane w większości poprzednich badań 7,9,11. Proces polimeryzacji jest hamowany przez tlen, co wymaga odizolowania próbki od powietrza na etapie polimeryzacji protokołu. Jednak zamiast odg...

Siatkówka kręgowców jest prawdopodobnie najbardziej dostępną częścią ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i służy jako doskonały model do badania rozwoju, struktury i funkcji mózgu. Pięć klas neuronów w siatkówce jest rozmieszczonych w trzech warstwach jądrowych oddzielonych dwiema warstwami splotowatymi. Zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL) składa się z klasycznych fotoreceptorów (pręcików i czopków), które przekształcają światło w sygnały elektryczne. Sygnały elektryczne są przetwarzane przez neurony w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL), w tym w komórkach dwubiegunowych, poziomych i amakrynowych, a następnie przekazywane do komórek zwojowych siatkówki (RGC) w warstwie komórek zwojowych (GCL). RGC są neuronami wyjściowymi siatkówki, z aksonami rzutującymi do mózgu, aby przyczynić się do tworzenia obrazu i nietworzenia obrazu. Ponadto trzy typy komórek glejowych (komórki Mullera, astroglej i mikroglej) dostarczają neuronom składników odżywczych i chronią neurony przed szkodliwymi zmianami w ich środowisku zewnątrzkomórkowym.
Jedna wyspecjalizowana subpopulacja komórek amakrynowych wytwarza i uwalnia dopaminę, ważny neuromodulator w OUN, rekonfigurując obwody nerwowe siatkówki podczas adaptacji światła1,2. Dopaminergiczne komórki amakrynowe (DAC) mają unikalną cechę profili morfologicznych. Ich somaty znajdują się w proksymalnym INL z dendrytami rozgałęziającymi się w najbardziej dystalnej części wewnętrznej warstwy splotowatej (IPL). Procesy podobne do aksonów DAC są niezmielinizowane, cienkie i długie, słabo rozgałęzione i noszą żylaki (miejsca uwalniania dopaminy). Tworzą gęsty splot z dendrytami w IPL, w tym pierścieniowate struktury wokół somatów komórek amakrynowych AII. Aksony biegną również przez INL w kierunku OPL, tworząc ścieżkę odśrodkową w poprzek siatkówki3. Wykazaliśmy, że procesy DAC wyrażają receptory w odpowiedzi na uwalnianie glutaminianu z neuronów presynaptycznych, w tym komórek dwubiegunowych i wewnętrznie światłoczułych komórek zwojowych siatkówki (ipRGC)4,5,6. Nie jest jednak jasne, czy receptory glutaminianu wyrażają się na aksonach, dendrytach, czy na obu, ponieważ są one odcięte w pionowych odcinkach siatkówki i nie można ich od siebie odróżnić5,6. Barwienie immunologiczne musi być przeprowadzone w całych siatkówkach, aby ujawnić trójwymiarowe rozgałęzienia DAC i obecność receptorów glutaminianu na przedziałach subkomórkowych. Chociaż siatkówka jest stosunkowo przezroczysta, grubość całej siatkówki myszy wynosi około 200 μm, co ogranicza przenikanie przeciwciał do głębokich tkanek, a także zmniejsza penetrację światła w przypadku obrazowania w wysokiej rozdzielczości z powodu rozpraszania światła w tkankach. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, dostosowaliśmy metodę delipidacji hydrożelowej tkanek zgodną z barwieniem immunologicznym (CLARITY) opracowaną niedawno dla grubych odcinków mózgu do całych siatek myszy siatkówek7.
Metoda CLARITY została pierwotnie opracowana przez laboratorium Deisseroth do barwienia immunologicznego i obrazowania grubych próbek mózgu7. Wykorzystuje silny detergent, dodecylosiarczan sodu (SDS) i elektroforezę w celu usunięcia składników lipidowych (które powodują rozpraszanie światła w tkankach), pozostawiając białka i kwasy nukleinowe na miejscu. Usunięte lipidy są zastępowane przezroczystym rusztowaniem składającym się z monomerów hydrożelowych, takich jak akrylamid, w celu wsparcia pozostałej struktury białka. Oczyszczoną tkankę można oznaczyć za pomocą immunohistochemii i zobrazować ze znacznie zwiększoną głębokością przenikania światła przez tkankę (do kilku milimetrów poniżej powierzchni tkanki). Od tego czasu metoda CLARITY została zoptymalizowana i uproszczona przez kilka grup badawczych8,9,10. Zmodyfikowany protokół CLARITY wykorzystuje technikę pasywnego oczyszczania, aby uniknąć możliwego uszkodzenia tkanek spowodowanego elektroforezą w celu oczyszczenia całego mózgu i innych nienaruszonych narządów11. Jednak metoda ta nie została jeszcze zastosowana do całych siatek siatkówki. W tym przypadku dostosowaliśmy pasywną technikę CLARITY do całych siatkówek, aby uczynić je bardziej przezroczystymi dla immunohistochemii i obrazowania. Odkryliśmy, że większość badanych białek siatkówki została zachowana podczas tego procesu dla immunohistochemii. Korzystając z rozwiązania do dopasowywania współczynnika załamania światła, byliśmy w stanie zobrazować neurony siatkówki o grubości około 200 μm od ONL do GCL w całych siatkówkach.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Utrwalacz</td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP170</td><td>Monomer hydrożelowy</td></tr><tr><td>Axio Imager.Z2</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BSA Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td>Środek blokujący</td></tr><tr><td>Eclipse Ti</td><td>Nikon Instrumenty</td><td></td><td>skaningowe konfokalne mikroskop</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td>Element buforowy</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S9763</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S2002</td><td>Bakteriostatyczny środek konserwujący</td></tr><tr><td>NDS</td><td>Aurion</td><td>900.122</td><td>Środek blokujący</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Środek delipidacyjny</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51876</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>Surfaktant</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td>011-19365</td><td>Inicjator termiczny</td></tr></tbody></table>

barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą clarity tissue clearing

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Metoda delipidacji hydrożelowej (CLARITY), pierwotnie opracowana przez laboratorium Deisseroth, została zmodyfikowana i szeroko stosowana do barwienia immunologicznego i obrazowania grubych próbek mózgu. Jednak ta zaawansowana technologia nie została jeszcze zastosowana w przypadku całych siatek siatkówki. Chociaż siatkówka jest częściowo przezroczysta, jej grubość około 200 μm (u myszy) nadal ogranicza przenikanie przeciwciał do głębokich tkanek, a także zmniejsza penetrację światła w przypadku obrazowania w wysokiej rozdzielczości. W tym przypadku dostosowaliśmy metodę CLARITY do całych siatkówek myszy, polimeryzując je monomerem akrylamidu w celu utworzenia nanoporowatego hydrożelu, a następnie oczyszczając je w dodecylosiarczanie sodu, aby zminimalizować utratę białka i uniknąć uszkodzenia tkanek. Siatkówki przetworzone w ramach projektu CLARITY poddano barwieniu immunologicznemu przeciwciałami przeciwko neuronom siatkówki, komórkom glejowym i białkom synaptycznym, zamontowano w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła i zobrazowano. Nasze dane pokazują, że projekt CLARITY może poprawić jakość standardowego barwienia i obrazowania immunohistochemicznego neuronów siatkówki i komórek glejowych w preparacji typu full-mount. Na przykład w ramach projektu CLARITY znacznie poprawiono rozdzielczość 3D drobnych aksonów i dendrytycznych struktur dopaminergicznych komórek amakrynowych. W porównaniu z nieprzetworzonymi siatkówkami typu full-mount, projekt CLARITY może ujawnić barwienie immunologiczne białek synaptycznych, takich jak białko o gęstości postsynaptycznej 95. Nasze wyniki pokazują, że CLARITY sprawia, że siatkówka staje się bardziej optycznie przezroczysta po usunięciu lipidów i zachowuje drobne struktury neuronów siatkówki i ich białek, które mogą być rutynowo wykorzystywane do uzyskiwania obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych w preparacji do montażu całościowego.

Siatkówki przetworzone zmodyfikowaną metodą CLARITY są tkankami optycznie przezroczystymi. 
Aby opracować metodę utrudniania (klarowania) tkanki, która byłaby kompatybilna z zastosowaniami immunohistochemicznymi w siatkówce, zapewniając jednocześnie odpowiednią delipidację i zachowanie integralności strukturalnej białek komórkowych, dostosowaliśmy metodę klarowania tkanki CLARITY do całych preparatów siatkówek mysich. Udało nam się uprościć protokół i zmodyfikować go dla całych preparatów siatkówek ...

Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.

Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Protokół ten pozwala na badanie drobnej morfologii neuronów siatkówki i może dać wgląd w komórkowe i subkomórkowe zmiany morfologiczne, które zachodzą w stanach chorobowych. Metoda ta znacznie poprawia przezroczystość optyczną siatkówki i pozwala na trójwymiarowe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, okablowanie obwodów i drobne struktury subkomórkowe neuronów siatkówki w preparatyce hormonalnej siatkówki. Enukleować oczy myszy za pomocą zakrzywionych kleszczy i przenieść je na małą szalkę Petriego z 0,1 M PBS.Zrób mały otwór wzdłuż połączenia twardówki rogówki z igłą pod mikroskopem preparacyjnym, a następnie przenieś oko do 4% formaldehydu na godzinę. Przenieś oko z powrotem do naczynia z PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć całe okolice połączenia rogówkowo-twardówkowego.Usuń rogówkę i soczewkę. Następnie przeciąć go u podstawy nerwu wzrokowego i ostrożnie oderwać twardówkę kleszczami, aby wyizolować siatkówkę. Wykonaj cztery małe nacięcia równomiernie wokół siatkówki i użyj cienkiej końcówki szczotki zanurzonej w PBS, aby ułożyć ją płasko GCL stroną do dołu w kształcie koniczyny na małym kwadracie wyciętym z nitrocelulozowej bibuły filtracyjnej.Podnieś róg bibuły nitrocelulozowej za pomocą kleszczyków i umieść go na 48-dołkowej płytce z 4% formaldehydem na jedną godzinę, a następnie przenieś bibułę filtracyjną i siatkówkę do studzienki z PBS i umyj trzy razy przez pięć minut każdy. Rozmrozić roztwór A4P0 na lodzie. Następnie przenieś siatkówkę do roztworu A4P0 i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem.Dodaj olej roślinny do studzienki, aby całkowicie pokryć roztwór A4P0. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez trzy godziny bez wstrząsania. Następnie umyj trzy razy w PBS przez pięć minut na pranie.Inkubować siatkówkę w 10% dodecylosiarczanie sodu w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez dwa dni, delikatnie wstrząsając, a następnie przenieść bibułę filtracyjną i siatkówkę do PBS za pomocą Triton X-100 i przemyć pięć razy przez 90 minut na pranie. Po ostatnim płukaniu przechowuj siatkówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBS-T z 0,01% azydkiem sodu lub przejdź bezpośrednio do barwienia immunologicznego. Usuń siatkówkę z bibuły filtracyjnej, delikatnie odklejając ją szczoteczką z cienką końcówką w PBS-T.Inkubowany w przeciwciałie pierwszorzędowym rozcieńczony w roztworze blokującym przez dwa dni w temperaturze 40 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Po inkubacji przemyć pięć razy przez 90 minut w PBS-T. Inkubować siatkówkę z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez dwa dni w temperaturze 40 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając.Próbki należy chronić przed światłem przez pozostałą część procedury. Przemyj siatkówkę pięć razy przez 90 minut w 0,02 M buforze fosforanowym. Na koniec inkubuj siatkówkę w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła na bazie sorbitolu w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez noc, delikatnie wstrząsając.Obrysuj szklane szkiełko nakrywkowe markerem permanentnym z cienką końcówką, aby zaznaczyć kwadratową granicę na odwrocie szklanego szkiełka mikroskopowego. Odwróć szkiełko i za pomocą strzykawki narysuj granicę za pomocą cienkiej linii smaru silikonowego z przodu szkiełka. Pozostaw niewielką szczelinę w jednym rogu, aby nadmiar roztworu montażowego mógł się wydostać.Przenieś siatkówkę do środka ograniczonego obszaru i ustaw ją za pomocą cienkiej końcówki pędzelka tak, aby leżała płasko stroną fotoreceptora przy szklanym szkiełku. Odpipetować około 60 mikrolitrów sRIMS tak, aby pokrył spłaszczoną siatkówkę i rozciągał się do jednego rogu obudowy. Upewnij się, że siatkówka pozostaje płaska i na swoim miejscu.Nałóż szkiełko nakrywkowe, zaczynając od rogu z felgami i powoli opuść je, aż dotknie smaru ze wszystkich stron. Umieść stos trzech szkiełek nakrywkowych po każdej stronie zamontowanej siatkówki jako przekładkę. Użyj dłuższej krawędzi innego suwaka, aby docisnąć szkiełko nakrywkowe, tak aby uchwyt był płaski i równy.Przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu obrazowania. Zacznij od umieszczenia szkiełka na stoliku mikroskopu i zlokalizowania próbki. Aby uzyskać obrazy warstwowe Z próbek, najpierw ustaw ostrość na sygnale w każdym kanale z osobna i ustaw czas ekspozycji lub prędkość skanowania odpowiednio dla mikroskopów fluorescencyjnych lub konfokalnych.Ustaw zakres stosu Z, ręcznie ustawiając płaszczyznę ogniskowej u góry i u dołu żądanego zakresu lub ustawiając punkt środkowy, a następnie określając zakres wokół punktu środkowego. Dostosuj rozmiar kroku lub liczbę plasterków zgodnie z potrzebami. Przechwyć obraz i zapisz oryginalny plik.Następnie eksportowany jako plik TIF lub w innym żądanym formacie. Użyj analizy obrazu, wybranego oprogramowania, aby dostosować jasność i kontrast w każdym kanale, aż do uzyskania optymalnej klarowności zarówno w pojedynczych obrazach, jak i w trójwymiarowym renderowaniu stosu Z. Podczas przetwarzania za pomocą zmodyfikowanego protokołu CLARITY zaobserwowano pełną przezroczystość optyczną na całej grubości siatkówki w porównaniu z nieprzetworzonymi siatkówkami kontrolnymi.Obrazy ułożone w stos Z dla stożków oznaczonych Arrestin w ONL, przetworników cyfrowo-analogowych oznaczonych TH w INL i RBPMS oznaczonych RGC w GCL są pokazane tutaj. Na obrazie nakładkowym zaobserwowano względne położenie neuronów na całej grubości siatkówki. Barwienie TH i CLARITY przetworzone całe siatkówki Mount porównano z obrazami uzyskanymi z preparatu standardowego.Dendryty i aksonowe procesy przetworników cyfrowo-analogowych były wyraźniej widoczne w klarownie przetworzonej siatkówce niż w standardowej siatkówce. Procesy podobne do aksonów przetworników cyfrowo-analogowych wykazywały kompletne struktury przypominające pierścień w czystej siatkówce w porównaniu ze standardową siatkówką. Pierścieniowate struktury siatkówki CLARITY pobrane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej były niemal identyczne z tymi obserwowanymi za pomocą mikroskopii konfokalnej.Wyrostki podobne do aksonów przebiegały również w kierunku zewnętrznej siatkówki. Barwienie immunologiczne przeciwko GluA2 i PSD-95 wykazało wyraźną punktację, ujawniając odpowiednio pojedyncze receptory AMPA zawierające GluA2 i domniemane miejsca postsynaptyczne. Obraz nakładki pokazywał pewne puncta w procesach DAC.Punkty przypuszczalnej kolokalizacji zostały przedstawione w płaszczyznach XZ, YZ i XY, a TH wyraźnie kolokalizowane zarówno z GluA2, jak i PSD-95. Ważne jest, aby siatkówka pozostała płaska podczas procesu polimeryzacji hydrożelowej, tak aby oczyszczona siatkówka mogła leżeć płasko w procesie montażu i obrazowania.

immunostaining-whole-mount-retinas-with-clarity-tissue-clearing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

ACT-PRESTO (technika aktywnej przejrzystości - efektywny i stabilny transfer makrocząsteczek do organów związany z ciśnieniem) umożliwia szybkie, skuteczne, ale niedrogie oczyszczanie tkanek i szybką penetrację przeciwciał do oczyszczonych tkanek poprzez pasywną dyfuzję lub dostarczanie wspomagane ciśnieniem. Za pomocą tej metody można oczyścić szeroki zakres tkanek, znakować immunologicznie wieloma przeciwciałami i obrazować objętość.

ACT-PRESTO: Biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.

Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Immunocytochemiczna identyfikacja podtypów włókien obwodowych nerwów czuciowych (oraz wykrywanie ekspresji białek w ich obrębie) jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw czucia obwodowego. W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowania próbek tkanek obwodowych i trzewnych, takich jak skóra i kości kończyn, do specyficznego barwienia immunologicznego obwodowych włókien nerwów czuciowych.

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Naucz się metody CLARITY do barwienia immunologicznego całych siatkówek myszy. Protokół umożliwia trójwymiarowe obrazowanie neuronów siatkówki z rozdzielczością subkomórkową, wspierając badania morfologii neuronalnej w stanach chorobowych.

Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

Przeglądaj więcej filmów