Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.

Protokół ten pozwala na badanie drobnej morfologii neuronów siatkówki i może dać wgląd w komórkowe i subkomórkowe zmiany morfologiczne, które zachodzą w stanach chorobowych. Metoda ta znacznie poprawia przezroczystość optyczną siatkówki i pozwala na trójwymiarowe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, okablowanie obwodów i drobne struktury subkomórkowe neuronów siatkówki w preparatyce hormonalnej siatkówki. Enukleować oczy myszy za pomocą zakrzywionych kleszczy i przenieść je na małą szalkę Petriego z 0,1 M PBS.

Zrób mały otwór wzdłuż połączenia twardówki rogówki z igłą pod mikroskopem preparacyjnym, a następnie przenieś oko do 4% formaldehydu na godzinę. Przenieś oko z powrotem do naczynia z PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć całe okolice połączenia rogówkowo-twardówkowego.

Usuń rogówkę i soczewkę. Następnie przeciąć go u podstawy nerwu wzrokowego i ostrożnie oderwać twardówkę kleszczami, aby wyizolować siatkówkę. Wykonaj cztery małe nacięcia równomiernie wokół siatkówki i użyj cienkiej końcówki szczotki zanurzonej w PBS, aby ułożyć ją płasko GCL stroną do dołu w kształcie koniczyny na małym kwadracie wyciętym z nitrocelulozowej bibuły filtracyjnej.

Podnieś róg bibuły nitrocelulozowej za pomocą kleszczyków i umieść go na 48-dołkowej płytce z 4% formaldehydem na jedną godzinę, a następnie przenieś bibułę filtracyjną i siatkówkę do studzienki z PBS i umyj trzy razy przez pięć minut każdy. Rozmrozić roztwór A4P0 na lodzie. Następnie przenieś siatkówkę do roztworu A4P0 i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem.

Dodaj olej roślinny do studzienki, aby całkowicie pokryć roztwór A4P0. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez trzy godziny bez wstrząsania. Następnie umyj trzy razy w PBS przez pięć minut na pranie.

Inkubować siatkówkę w 10% dodecylosiarczanie sodu w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez dwa dni, delikatnie wstrząsając, a następnie przenieść bibułę filtracyjną i siatkówkę do PBS za pomocą Triton X-100 i przemyć pięć razy przez 90 minut na pranie. Po ostatnim płukaniu przechowuj siatkówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBS-T z 0,01% azydkiem sodu lub przejdź bezpośrednio do barwienia immunologicznego. Usuń siatkówkę z bibuły filtracyjnej, delikatnie odklejając ją szczoteczką z cienką końcówką w PBS-T.

Inkubowany w przeciwciałie pierwszorzędowym rozcieńczony w roztworze blokującym przez dwa dni w temperaturze 40 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Po inkubacji przemyć pięć razy przez 90 minut w PBS-T. Inkubować siatkówkę z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez dwa dni w temperaturze 40 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając.

Próbki należy chronić przed światłem przez pozostałą część procedury. Przemyj siatkówkę pięć razy przez 90 minut w 0,02 M buforze fosforanowym. Na koniec inkubuj siatkówkę w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła na bazie sorbitolu w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez noc, delikatnie wstrząsając.

Obrysuj szklane szkiełko nakrywkowe markerem permanentnym z cienką końcówką, aby zaznaczyć kwadratową granicę na odwrocie szklanego szkiełka mikroskopowego. Odwróć szkiełko i za pomocą strzykawki narysuj granicę za pomocą cienkiej linii smaru silikonowego z przodu szkiełka. Pozostaw niewielką szczelinę w jednym rogu, aby nadmiar roztworu montażowego mógł się wydostać.

Przenieś siatkówkę do środka ograniczonego obszaru i ustaw ją za pomocą cienkiej końcówki pędzelka tak, aby leżała płasko stroną fotoreceptora przy szklanym szkiełku. Odpipetować około 60 mikrolitrów sRIMS tak, aby pokrył spłaszczoną siatkówkę i rozciągał się do jednego rogu obudowy. Upewnij się, że siatkówka pozostaje płaska i na swoim miejscu.

Nałóż szkiełko nakrywkowe, zaczynając od rogu z felgami i powoli opuść je, aż dotknie smaru ze wszystkich stron. Umieść stos trzech szkiełek nakrywkowych po każdej stronie zamontowanej siatkówki jako przekładkę. Użyj dłuższej krawędzi innego suwaka, aby docisnąć szkiełko nakrywkowe, tak aby uchwyt był płaski i równy.

Przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu obrazowania. Zacznij od umieszczenia szkiełka na stoliku mikroskopu i zlokalizowania próbki. Aby uzyskać obrazy warstwowe Z próbek, najpierw ustaw ostrość na sygnale w każdym kanale z osobna i ustaw czas ekspozycji lub prędkość skanowania odpowiednio dla mikroskopów fluorescencyjnych lub konfokalnych.

Ustaw zakres stosu Z, ręcznie ustawiając płaszczyznę ogniskowej u góry i u dołu żądanego zakresu lub ustawiając punkt środkowy, a następnie określając zakres wokół punktu środkowego. Dostosuj rozmiar kroku lub liczbę plasterków zgodnie z potrzebami. Przechwyć obraz i zapisz oryginalny plik.

Następnie eksportowany jako plik TIF lub w innym żądanym formacie. Użyj analizy obrazu, wybranego oprogramowania, aby dostosować jasność i kontrast w każdym kanale, aż do uzyskania optymalnej klarowności zarówno w pojedynczych obrazach, jak i w trójwymiarowym renderowaniu stosu Z. Podczas przetwarzania za pomocą zmodyfikowanego protokołu CLARITY zaobserwowano pełną przezroczystość optyczną na całej grubości siatkówki w porównaniu z nieprzetworzonymi siatkówkami kontrolnymi.

Obrazy ułożone w stos Z dla stożków oznaczonych Arrestin w ONL, przetworników cyfrowo-analogowych oznaczonych TH w INL i RBPMS oznaczonych RGC w GCL są pokazane tutaj. Na obrazie nakładkowym zaobserwowano względne położenie neuronów na całej grubości siatkówki. Barwienie TH i CLARITY przetworzone całe siatkówki Mount porównano z obrazami uzyskanymi z preparatu standardowego.

Dendryty i aksonowe procesy przetworników cyfrowo-analogowych były wyraźniej widoczne w klarownie przetworzonej siatkówce niż w standardowej siatkówce. Procesy podobne do aksonów przetworników cyfrowo-analogowych wykazywały kompletne struktury przypominające pierścień w czystej siatkówce w porównaniu ze standardową siatkówką. Pierścieniowate struktury siatkówki CLARITY pobrane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej były niemal identyczne z tymi obserwowanymi za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wyrostki podobne do aksonów przebiegały również w kierunku zewnętrznej siatkówki. Barwienie immunologiczne przeciwko GluA2 i PSD-95 wykazało wyraźną punktację, ujawniając odpowiednio pojedyncze receptory AMPA zawierające GluA2 i domniemane miejsca postsynaptyczne. Obraz nakładki pokazywał pewne puncta w procesach DAC.

Punkty przypuszczalnej kolokalizacji zostały przedstawione w płaszczyznach XZ, YZ i XY, a TH wyraźnie kolokalizowane zarówno z GluA2, jak i PSD-95. Ważne jest, aby siatkówka pozostała płaska podczas procesu polimeryzacji hydrożelowej, tak aby oczyszczona siatkówka mogła leżeć płasko w procesie montażu i obrazowania.