Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Protokół ten zapewnia powtarzalną i wiarygodną ekstrakcję chromatyny z zamrożonych próbek wątroby do eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny. Na początek umieść probówkę zawierającą zamrożoną tkankę w moździerzu i pozostaw ją tam na pięć minut. Następnie dociśnij próbkę za pomocą wstępnie schłodzonego tłuczka, aż nie będzie już żadnych stałych kruszonek.

Wyjąć probówkę z próbką z moździerza. Dodać 950 mikrolitrów lodowatego PBS z wymaganymi inhibitorami i delikatnie pipetować w górę i w dół, aż próbka zostanie całkowicie ponownie zawieszona. Natychmiast przenieść zawiesinę tkankową do homogenizatora i zastosować od 20 do 30 uderzeń tłuczkiem A, aby uzyskać drobniejszą zawiesinę.

Unikaj przesuwania tłuczka poza fazę ciekłą, aby zapobiec pienieniu. Przenieś homogenat do nowej 1,5-mililitrowej probówki, uprzednio schłodzonej na lodzie. Następnie odwirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 1,300 g i czterech stopniach Celsjusza.

Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić całkowicie granulki w 950 mikrolitrach PBS o temperaturze pokojowej poprzez delikatne pipetowanie. Następnie dodaj 63,6 mikrolitrów 16% formaldehydu wolnego od metanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 1%Natychmiast obracaj rurkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po obróceniu dodaj 113 mikrolitrów glicyny 1,25 molowej w temperaturze pokojowej, aby uzyskać końcowe stężenie 125 milimolowe i obracaj probówkę przez kolejne pięć minut.

Następnie odwirować próbkę o stężeniu 1,300 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ostrożnie zawiesić osad, pipetując 950 mikrolitrów lodowatego PBS z wymaganymi inhibitorami. Ponownie odwirować próbkę i ponownie zawiesić osad, jak wykazano poprzednio.

Powtórzyć etap wirowania jeszcze raz i natychmiast przejść do procedury izolacji chromatyny. Dodać 950 mikrolitrów buforu A z wymaganymi inhibitorami do osadu i delikatnie mieszać pipetując, aż do całkowitego zawieszenia osadu. Następnie obracaj rurkę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po obróceniu odwirować próbkę o stężeniu 2 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć supernatant. Dodać 950 mikrolitrów buforu B z wymaganymi inhibitorami do osadu i delikatnie mieszać pipetując, aż do całkowitego zawieszenia osadu. Następnie obracaj rurkę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po obróceniu ponownie odwirować próbkę. Usunąć supernatant. Następnie dodać 300 mikrolitrów buforu C o temperaturze pokojowej z wymaganymi inhibitorami do osadu i energicznie pipetować.

Wirować próbkę przez 15 do 30 sekund. Następnie krótko obróć tubkę, aby zebrać krople na pokrywce. Po sonikacji próbki chromatyny dodaj 30 mikrolitrów 10% roztworu Triton X-100 i wiruj przez pięć do 10 sekund.

Odwirować próbkę w temperaturze 16 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I przenieś supernatant do czystej 1,5-mililitrowej probówki, wstępnie schłodzonej na lodzie. Przenieś od 10 do 25 mikrolitrów ściętej chromatyny do nowej probówki i dodaj bufor C, aby osiągnąć końcową objętość 200 mikrolitrów.

Podwielokrotność i szok zamrażają resztę chromatyny w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Dodać osiem mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i inkubować przez co najmniej sześć godzin w temperaturze 65 stopni Celsjusza w bloku grzewczym, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min. Jeśli to możliwe, przedłuż inkubację na noc.

Po pozostawieniu próbek do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez pięć minut, dodaj dwa mikrolitry RNazy A i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min. Wyjmij próbki z bloku grzewczego i dodaj siedem mikrolitrów 300-milimolowego chlorku wapnia i dwa mikrolitry proteinazy K. Inkubuj próbki w bloku grzewczym w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min. W międzyczasie przygotuj jedną probówkę do separacji faz dla każdej próbki, odwirowując je do 16 000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po wyjęciu probówek z bloku grzewczego i pozostawieniu ich do równowagi w temperaturze pokojowej przez trzy minuty, przenieść 400 mikrolitrów próbki do uprzednio odwirowanej probówki do separacji faz. Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu alkoholu fenolowo-chloroformowego izoamylu i wiruj przez pięć sekund. Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 400 mikrolitrów chloroformu i wiruj przez pięć sekund. Odwiruj probówkę przez kolejne pięć minut i przenieś 400 mikrolitrów górnej fazy do nowej 1,5 mililitrowej probówki, która zawiera 24 mikrolitry pięciomolowego chlorku sodu i 0,75 mikrolitra glikogenu. Następnie krótko przekręć rurkę w wir.

Dodaj 1 055 mikrolitrów 100% etanolu. Następnie dokładnie wymieszać i inkubować próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Po zakończeniu inkubacji odwirować próbkę o stężeniu 16 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć supernatant bez przemieszczania osadu.

Dodaj 500 mikrolitrów zimnego 70% etanolu i delikatnie przechyl rurkę, aby upewnić się, że granulat został umyty. Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć cały sklarat i pozostawić osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

Alternatywnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby przyspieszyć suszenie. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu Tris-EDTA i umieść rurkę na bloku grzewczym na pięć do 10 minut pod wstrząsaniem z prędkością 300 obr./min. Następnie przeanalizuj DNA na 1% żelu agarozowym.

Po rozsieciowaniu chromatyny i uwidocznieniu DNA na żelu agarozowym, udane ścinanie można rozpoznać po obecności fragmentów w zakresie od 100 do 300 par zasad. Chromatynę udało się wytrącić trimetylacją H3K4, acetylacją H3K27 i przeciwciałami trimetylacji H3 K27, a następnie poddać dalszej analizie metodą qPCR. Chromosom pierwszy otwarta ramka odczytu 43, podjednostka proteasomu 20S beta druga i regiony promotora dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej, które są aktywnie transkrybowane w wątrobie, wykazały wzbogacenie w trimetylację H3K4 i acetylację H3K27.

Dla porównania, homeobox C13, homeobox C12 i mysie regiony promotora czynnika transkrypcyjnego mieliny one, które są wyciszone w wątrobie, nie zostały wzbogacone zgodnie z oczekiwaniami. Trimetylacja H3 K27 wykazuje odwrotne zachowanie, potwierdzając w ten sposób sukces immunoprecypitacji chromatyny lub testu ChIP. Chromatynę z powodzeniem poddano działaniu ChIP-Seq.

Po sekwencjonowaniu stroiki wyrównano do wcześniej przygotowanego indeksu i rozdzielono według gatunków. Osadzanie trimetylacji H3K4 i acetylacji H3K27 w miejscach wyjściowych transkrypcji genów antagonizowanych z depozycją trimetylacji H3K27 zgodnie z oczekiwaniami. Klaster Hox C jest znany z tego, że jest nieaktywny transkrypcyjnie zarówno w wątrobie myszy, jak i człowieka.

Profilowanie trimetylacji H3K4 i acetylacji H3K27 pokazuje piki dla tych dwóch modyfikacji potranslacyjnych poza klastrem, podczas gdy intensywność sygnału trimetylacji H3K27 ma tendencję do zwiększania się w klastrze genów. Ekstrakcja chromatyny z zamrożonych próbek tkanek ma wysoką zmienność wewnętrzną, silnie zależną od stopnia rozdrobnienia zawiesiny komórek i temperatury podczas sieciowania. Zapewnienie stałych warunków laboratoryjnych pomaga w utrzymaniu odtwarzalności zakresu wielkości fragmentów.