Tworzenie ptasich chimer przodomózgowia w celu oceny rozwoju twarzy
18 lutego 2021
Ten artykuł opisuje technikę przeszczepu tkanek, która została zaprojektowana w celu przetestowania właściwości sygnalizacyjnych i wzorcowych podstawy przodomózgowia podczas rozwoju twarzoczaszki.
Metoda ta pozwala badaczom ocenić interakcje tkankowe między podstawną przodomózgowiem a twarzą. Główną zaletą tej techniki jest to, że izoluje ona podstawę przodomózgowia w celu oceny i zapobiega zanieczyszczeniu komórkami grzebienia nerwowego, co mogłoby zakłócić analizę. Najtrudniejszą częścią tej techniki jest usunięcie przodomózgowia z gospodarza i zastąpienie go tkanką dawcy.
Procedurę zademonstruje Diane Hu, naukowiec z laboratorium dr Ralpha Marcucio. Na początek przygotuj podłoże DMEM z neutralną czerwienią, szklaną pipetą transferową i zaostrzonym wolframem. Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 18 usuń 0,5 mililitra albuminy ze spiczastego końca skorupki jajka.
Zrób mały otwór na wierzchu skorupy za pomocą nożyczek. Następnie umieść kawałek taśmy na otworze i wytnij okrągły otwór, aby odsłonić zarodek. Zabarwić zarodek neutralną czerwienią.
Pobieraj przeszczepy tkanek z lewej strony podstawy przodomózgowia zarodków w stadium siódmym lub ósmym. Użyj zakrzywionych, zaostrzonych igieł wolframowych, aby delikatnie naciąć kawałek przodomózgowia. Aby nie obejmować leżącej pod spodem endodermy, wsuń igłę pod przodomózgowie i równolegle do osi cewy nerwowej.
Pobrać przeszczep z zarodka dawcy za pomocą szklanej pipety transferowej i przenieść go do DMEM zawierającego neutralną czerwień na dwie minuty, aby go wybarwić. Następnie umieść wybarwiony przeszczep w DMEM, który nie zawiera neutralnej czerwieni, aż będzie gotowy do wszczepienia. Wysiaduj zapłodnione jaja od białego kurczaka Leghorn w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze, aż do etapu Hamburger-Hamilton od siódmego do ósmego.
Odsłonięte zarodki, jak wykazano wcześniej. Za pomocą zaostrzonych igieł wolframowych przygotuj miejsce przeszczepu, przecinając, a następnie usuwając kawałek podstawy przodomózgowia o wymiarach 0,3 na 0,2 milimetra, aby pomieścić przeszczep. Unikaj nadmiernego uszkodzenia leżącej pod spodem endodermy, które będzie widoczne, gdy granulki żółtka zaczną przeciekać przez każde rozdarcie, które zostanie wykonane.
Po przeniesieniu przeszczepu do żywiciela ustaw przeszczep tak, aby zastąpił wytępioną podstawną przodomózgowie gospodarza. Umieść szczelnie taśmę na otworze i umieść zarodki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do analizy. Początkowo chimery powstawały poprzez przeszczepianie tkanek przepiórczych do zarodków piskląt.
Za pomocą przeciwciała QCPN zwizualizowano komórki przepiórcze i odróżniono je od tkanek gospodarza. System piskląt przepiórczych potwierdził, że cały przeszczep składał się wyłącznie z tkanki nerwowej i nie był zanieczyszczony innymi typami komórek. Przeszczepienie tkanki przepiórczej do zarodków kaczek doprowadziło do poważnie zdeformowanych chimer z powodu szybciej rozwijającego się mózgu przepiórki.
W związku z tym przeprowadzono przeszczep tkanek kaczki do zarodków kurczaków. Powstałe chimery piskląt kaczek sugerują, że mózg uczestniczy w regulacji morfologii. Hybrydyzacja C2 w całej górze została wykorzystana do oceny ekspresji jeża sonicznego w chimerach.
Podobnie jak morfologia, ekspresja jeża sonicznego po kaczej stronie chimery wydawała się bardziej podobna do kaczki. Przygotowanie strony hosta wymaga praktyki. Duża liczba zarodków nie przeżywa, więc stworzenie dużej liczby chimer może pomóc w zapewnieniu odpowiednich próbek do analizy.
Metoda ta pozwoliła ocenić, w jaki sposób sygnały z mózgu kształtują domenę ekspresji Sonic hedgehog w strefie czołowo-nosowej ektodermalnej
.Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która pozwala badaczom ocenić interakcje tkankowe między przednim mózgiem podstawnym a twarzą podczas rozwoju kraniofacialnego. Metoda ta umożliwia izolację przedniego mózgu podstawnego w celu przeprowadzenia analizy, zapobiegając zanieczyszczeniu komórkami grzebienia neuronalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Rozwój kraniofacjalny
- Techniki transplantacji tkanek
Wstęp
- Przedmózgie podstawne odgrywa kluczową rolę w rozwoju kraniofacialnym.
- Zrozumienie interakcji tkankowych jest niezbędne dla biologii rozwoju.
- Zanieczyszczenie komórkami grzebienia neuronalnego może utrudnić analizę.
- Izolacja przedmózgia podstawnego pozwala na dokładniejszą ocenę jego właściwości sygnałowych.
Cel badania
- Aby zbadać właściwości sygnalizacyjne i wzorcujące przedniego brzusznego mózgowia.
- Aby opracować niezawodną metodę transplantacji tkanek.
- Aby pogłębić zrozumienie mechanizmów rozwoju kraniofacjalnego.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywki DMEM z czerwienią neutralną.
- Użycie szklanej pipety transferowej i zaostrzonego wolframu.
- Usunięcie albuminy z zaostrzonego końca skorupki jaja za pomocą strzykawki.
- Zastąpienie przedmózgu biorcy tkanką dawcy.
Główne wyniki
- Technika ta pozwala na skuteczną izolację przedniego brzusznego mózgowia do analizy.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez naukowca.
- Pomyślna ocena interakcji tkankowych bez zanieczyszczeń.
- Wgląd w rolę przedniego brzusznego mózgowia w rozwoju kraniofacjalnym.
Wnioski
- Technika transplantacji jest cennym narzędziem do badania rozwoju kraniofacjalnego.
- Izolacja podstawy przedmózgowia zwiększa dokładność ocen rozwojowych.
- Metodę tę można zastosować w dalszych badaniach z zakresu neuronauki rozwojowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjną ocenę sygnalizacji tkankowej w rozwoju kraniofacjalnym poprzez izolację podstawy przedmózgowia od zakłócających wpływów pochodzących z grzebienia neuronalnego. Wspiera ona redukcję ryzyka mechanistycznego w walidacji celów terapeutycznych, wyjaśniając, w jaki sposób sygnały pochodzące z mózgu regulują szlaki morfogenetyczne, takie jak Sonic hedgehog w ektodermalnej strefie czołowo-nosowej. Podejście to zapewnia istotny w kontekście chorób system do oceny szlaków rozwojowych z pewnością prognostyczną w wczesnej fazie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących oddziaływań między tkankami mózgu a twarzy w rozwoju kręgowców.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez izolację właściwości sygnalizacyjnych podstawnego przedmózgowia.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez powiązanie manipulacji w obrębie podstawnego przedmózgowia ze zmianami w domenie ekspresji SHH.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów chimerycznych do ilościowej oceny ekspresji morfogenów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja transplantacji tkanek w celu uzyskania powtarzalnych wyników testów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Skalowalność: Umożliwienie generowania wielu chimer w celu zniwelowania niskich wskaźników przeżywalności i zapewnienia wiarygodności analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy mechanistyczne spostrzeżenia z etapu odkryć z modelami przedklinicznymi wzorowania kraniofacialnego.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Wyjaśnia działanie regulatorów upstream dla SHH, kluczowej ścieżki w modelowaniu wad wrodzonych.
- System istotny dla chorób: Wykorzystuje chimery ptasie do badania konserwatywnych mechanizmów rozwoju twarzy kręgowców.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, w których testy interakcji z tkankami pozwalają ocenić pewność wyboru celu terapeutycznego przed podjęciem działań zmierzających do identyfikacji związku wiodącego.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących centrów sygnalizacyjnych w morfogenezie kraniofacjalnej.
- Gotowość do analizy: Tworzy standaryzowane systemy biologiczne do ilościowej analizy ekspresji SHH.
- Analityka: Umożliwia przeprowadzenie hybrydyzacji in situ całego preparatu w celu pomiaru przestrzennych zmian ekspresji genów jako kluczowego odczytu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość mechanistyczną od przeszczepiania tkanki nerwowej do efektów fenotypowych twarzy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia platformę wielokrotnego użytku do oceny tkankowo specyficznego wkładu w szlaki rozwojowe.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację sygnałów z przedniej części mózgu w rozwoju twarzy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym technikom przeszczepiania i przygotowania gospodarza.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wyjaśnienie regulatorów nadrzędnych dla szlaków możliwych do celowania terapeutycznego, takich jak SHH.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane dane dotyczące oddziaływań tkankowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikroschirurgicznym obchodzeniu się z tkankami oraz manipulacji zarodkami ptaków.
- Zależne od specjalistycznych narzędzi, w tym zaostrzonych igieł wolframowych i szklanych pipet transferowych.
- Wymaga standaryzowanych protokołów inkubacji i określania stadium rozwoju dla zarodków biorcy i dawcy.
- Obejmuje optymalizację przygotowania miejsca przeszczepu w celu zapobiegania wyciekowi żółtka i zapewnienia żywotności biorcy.
- Ograniczone niską przeżywalnością zarodków, co wymusza zastosowanie dużej liczby próbek dla uzyskania wiarygodnej analizy.
