Name: Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metody oceny kardiotoksyczności zanieczyszczeń środowiskowych w zarodkach kurzych. Wykorzystaj mikroinjekcję i infuzję komórki powietrznej do badania wpływu na rozwój serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 91643203, 91543208, 81502835).

Wszystkie opisane procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Qingdao. W naszym laboratorium jaja inkubowano w dwóch inkubatorach. Jaja trzymano pionowo w inkubatorze i losowo umieszczano na półkach. Warunki inkubacji jaj były następujące: temperatura inkubacji rozpoczęła się od 37,9 °C i stopniowo spadała do 37,1 °C w miarę postępu inkubacji; Wilgotność zaczynała się od 50% i stopniowo wzrastała do 70%.
1. Metody ekspozycji
UWAGA: Narażenie na zanieczyszczenia środowiskowe zarodków kurczaków można osiągnąć na kilka sposobów. W tej sekcji szczegółowo opisano trzy rutynowo stosowane metody.
<ol>
	<li>Wstrzykiwanie komórek powietrznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) 
	UWAGA: Jest to klasyczna metoda ekspozycji na zarodki kurze4,5,6, odpowiednia dla szerokiej gamy materiałów i może być wykonywana w bardzo szerokim oknie czasowym, od początku rozwoju (dzień zarodkowy zero, ED0) aż do dnia poprzedzającego wyklucie (ED20). Jako pojazd używany jest olej słonecznikowy. Wcześniejsze badania wykazały, że nie zaobserwowano znaczących zmian w śmiertelności, wylęgowości lub masie ciała między nieleczonymi zarodkami a zarodkami, którym wstrzyknięto olej słonecznikowy7.
	<ol>
		<li>Przygotuj następujące niezbędne odczynniki/narzędzia: 75% etanol, bibułka, metalowa sonda (może zastąpić dowolną ostrą metalową igłą/patyczkiem/szydłem), stopiona parafina, pędzel, roztwór jodku powidonu, pipeta, końcówki do pipet, lampa świecowa, mieszanina dozująca. Przygotuj mieszaninę dozującą z olejem słonecznikowym (zalecane)4. Aby użyć innych rozcieńczalników, należy przeprowadzić kontrolę nośnika (w porównaniu z nieleczonymi zarodkami).</li>
		<li>Oczyść powierzchnię jaj roztworem jodku powidonu (dostępny w handlu roztwór jodku powidonu w stosunku 1:5 rozcieńczony wodą dejonizowaną) i osusz skorupkę jajka bibułą bez szorowania. Szorowanie spowoduje zerwanie warstwy ochronnej pokrywającej zewnętrzną stronę skorupy.</li>
		<li>Zapal jajka w ciemnym pomieszczeniu i zaznacz komórkę powietrzną ołówkiem. Wyklucz jajka z pęknięciami na skorupce. Wyklucz jaja z komórkami powietrznymi z boku zamiast końcem, ponieważ jest bardzo mało prawdopodobne, aby wykluły się one normalnie.</li>
		<li>Zdezynfekuj obszar komórki powietrznej 75% etanolem, a następnie wywierć mały otwór w środku obszaru komórki powietrznej za pomocą metalowej sondy. Nie wkładaj sondy głęboko w komórkę powietrzną, ponieważ może to spowodować uszkodzenie membrany wewnętrznej, zamiast tego należy tylko przebić obudowę końcówką sondy. Jeśli otwór nie jest wystarczająco duży, aby zmieścić się w cienkiej końcówce do pipet, należy ponownie rozbić osłonę w pobliżu istniejącego otworu, aż otwór będzie wystarczająco duży, aby umożliwić włożenie końcówki do pipety o pojemności 10 μl.</li>
		<li>Energicznie rozmieszać mieszaninę dozującą i natychmiast pobrać roztwór na końcówkę pipety. Zalecana objętość wstrzyknięcia wynosi 1 μl na 10 gramów jaja (np. 5 μl objętości iniekcji na 50-gramowe jajo), ponieważ większe objętości wstrzyknięć mogą stworzyć warunki niedotlenienia lub niedotlenienia rozwijającego się zarodka. Obliczyć stężenie roztworu dozującego dla żądanej dawki mg/kg jaja.</li>
		<li>Włóż końcówkę pipety do otworu tak, aby końcówka dotykała wewnętrznej membrany. Powoli wysuń mieszaninę dozującą, przytrzymaj przez co najmniej dziesięć sekund (poczekaj, aż lepki olej zostanie całkowicie dozowany), a następnie zdejmij końcówkę.</li>
		<li>Uszczelnij otwór pędzlem i kroplą stopionej parafiny. Uważaj, aby nie kapać stopionej parafiny na membranę wewnętrzną.</li>
		<li>Po zamknięciu umieść jaja w inkubatorze, aż osiągną pożądane stadium embrionalne. W przypadku już rozwijających się zarodków należy przeprowadzić cały proces tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec potencjalnej utracie zarodka z powodu niskich temperatur otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroiniekcja (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) 
	UWAGA: Jest to bardziej bezpośrednia metoda ekspozycji, powodująca ostateczną ekspozycję na substancję będącą przedmiotem zainteresowania, a szczególnie odpowiednia dla związków o krótkim czasie działania (np. lentiwirus), ponieważ klasyczne wstrzyknięcie komórek powietrznych wymaga czasu, aby związki przeniknęły przez błonę wewnętrzną. Metodę tę można również wypróbować, jeśli nie można osiągnąć zadowalających wyników przez wstrzyknięcie komórek powietrznych. Metoda ta najlepiej sprawdza się w przypadku wczesnych zarodków (do ED2), ale może być również wykonywana na starszych zarodkach (o wyższym ryzyku utraty zarodków).
	<ol>
		<li>Przygotuj następujące niezbędne odczynniki/narzędzia: 75% etanol, roztwór jodku powidonu, mikroiniektor (5 μL), metalowa sonda (może zastąpić dowolną ostrą metalową igłą/patyczkiem/szydłem), drobne kleszcze, taśma. Przygotować mieszaninę dozującą ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej, który służy również jako kontrola iniekcji, nie wpływając znacząco na wylęgowość. Należy zapewnić sterylność soli fizjologicznej, ponieważ zanieczyszczony zastrzyk znacznie zwiększy śmiertelność.</li>
		<li>Oczyść jaja zgodnie z opisem w ppkt 1.1.2.</li>
		<li>Zapalić jaja zgodnie z opisem w ppkt 1.1.3.</li>
		<li>Zdezynfekuj obszar komórki powietrznej 75% etanolem, a następnie wywierć mały otwór w środku obszaru komórki powietrznej za pomocą metalowej sondy. Nie wkładaj sondy głęboko w komórkę powietrzną, ponieważ może to spowodować uszkodzenie membrany wewnętrznej, zamiast tego należy tylko przebić obudowę końcówką sondy. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie powiększ otwór, aż średnica wyniesie około 2 mm, co pozwoli na wizualne potwierdzenie wewnętrznej membrany.</li>
		<li>Załadować roztwór do mikrowstrzykiwacza (maksymalna objętość wstrzyknięcia: 0,5 μl/10 g jaja. (np. 2,5 μl na jajko o wadze 50 g) i ostrożnie wprowadzić igłę przez otwór w błonę wewnętrzną na około 2-3 mm. Delikatnie dozować roztwór i wyjąć igłę. Trzymać igłę jak najbardziej prostopadle do membrany.</li>
		<li>Uszczelnij otwór małym kawałkiem taśmy. Całkowicie zakryj otwór, aby zapobiec odwodnieniu i śmierci zarodka podczas kolejnej inkubacji. Niemniej jednak unikaj kawałków taśmy, które są zbyt duże, aby zapobiec niedotlenieniu.</li>
		<li>Po zamknięciu umieść jaja w inkubatorze, aż osiągną pożądane stadium embrionalne. W przypadku już rozwijających się zarodków należy przeprowadzić cały proces tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec potencjalnej utracie zarodków z powodu niskiej temperatury otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wdychanie komórek powietrznych (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3) 
	UWAGA: Jest to nowatorska metoda inhalacji wykorzystująca komórkę powietrzną, z której zarodek kurczaka w późnym stadium zacznie oddychać powietrzem. Nadaje się do ekspozycji na gaz lub aerozol i może osiągać bardzo wczesne narażenie inhalacyjne w życiu i napełniać płuca docelowym gazem/aerozolem, gdy otwierają się po raz pierwszy w życiu.
	<ol>
		<li>Przygotuj następujące niezbędne odczynniki/narzędzia: worek do pobierania próbek (worek PVF, do przechowywania próbki gazu/aerozolu przed ekspozycją), igła cewnika, strzykawka, metalowa sonda (może zastąpić dowolną ostrą metalową igłą / sztyftem / szydłem), taśma, okap wyciągowy.</li>
		<li>Oczyścić jaja zgodnie z opisem w ppkt 1.1.2 i rozpylić je świecą zgodnie z opisem w ppkt 1.1.3 (nie jest konieczne znakowanie komórki powietrznej przed inkubacją), a następnie inkubować jaja bez obróbki do ED17.</li>
		<li>Zapal jajka na ED17, aby zaznaczyć obszar komórki powietrznej.</li>
		<li>Przy ED18 wyjmij jajko z inkubatora, zdezynfekuj obszar komory powietrznej 75% etanolem, a następnie ostrożnie wywierć dwa małe otwory po obu stronach komory powietrznej. Jeden służy do wstrzykiwania gazu/aerozolu, drugi do wydmuchiwania powietrza. Dokładnie kontroluj rozmiar otworów, tak aby rozmiar otworu iniekcyjnego był wystarczający do wprowadzenia igły cewnika, podczas gdy średnica otworu wydalającego była nieco większa (około 1 mm).</li>
		<li>Delikatnie wstrzyknąć 10 ml docelowego gazu/aerozolu z otworu iniekcyjnego za pomocą strzykawki przymocowanej do igły cewnika. Wstrzyknąć powietrze dla grupy kontrolnej po inhalacji, która nie powinna mieć znaczących różnic w stosunku do grupy kontroli negatywnej8. Wywierać nacisk na igłę cewnika (przy odpowiedniej wielkości nacisku elastyczna igła może być dociskana do osłony), aby zminimalizować wyciek z otworu iniekcyjnego. Następnie natychmiast uszczelnij oba otwory taśmą i umieść jajo z powrotem w inkubatorze. 
		UWAGA: Tę procedurę należy wykonywać w dygestorium, aby zapobiec wdychaniu gazu/aerozolu przez operatora.</li>
		<li>Powtórz opisaną procedurę po jednej godzinie, aby upewnić się, że cała komórka powietrzna jest wypełniona gazem/aerozolem docelowym (opcjonalnie).</li>
		<li>Powtórzyć opisaną procedurę ponownie dla ED19 (opcjonalnie). Powtarzanie ekspozycji pomaga zapewnić stałą ekspozycję aż do wyklucia. Zapisz czas wylęgu, aby w przybliżeniu oszacować czas trwania ekspozycji.</li>
		<li>Po wykonaniu i uszczelnieniu żądanych ekspozycji umieść jaja w inkubatorze do wylęgu. Zminimalizuj czas, jaki jajo spędza na zewnątrz inkubatora, aby zapobiec śmierci z powodu niskiej temperatury otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Metody oceny punktów końcowych
UWAGA: Po ekspozycji na badane zanieczyszczenie rozwijającego się zarodka, można ocenić kilka parametrów toksyczności, w tym kardiotoksyczność. W tej sekcji szczegółowo opisano dwie często stosowane specyficzne metody.
<ol>
	<li>Elektrokardiografia (<klasa silna="xfig">Rysunek 4) 
	UWAGA: Niemożliwe jest wykonanie nieinwazyjnej elektrokardiografii u piskląt ze względu na obecność piór. W związku z tym niezbędne jest podskórne wszczepienie elektrod, wymagające znieczulenia. Dawka stosowana w laboratorium wynosi 33 mg/kg pentobarbitalu we wstrzyknięciu dootrzewnowym (niektóre kurczaki mogą wymagać zwiększenia dawki nawet o 50%). Metoda ta pozwoli na stabilną elektrokardiografię u ponad 90% zwierząt, co pozwoli na analizę częstości akcji serca.
	<ol>
		<li>Przygotuj następujące niezbędne odczynniki/narzędzia: 1% (10 mg/ml) roztwór pentobarbitalu w soli fizjologicznej, strzykawka, waga elektryczna, grzałka (jeśli to konieczne), dołączony instrument do elektrokardiografii (np. BL-420E+) z dwukanałowymi metalowymi elektrodami igłowymi.</li>
		<li>Zważyć kurczęta za pomocą wagi i obliczyć niezbędną objętość roztworu pentobarbitalu i wstrzyknąć kurczaki. W przypadku kurczaka o wadze 30 g potrzebne jest 0,1 ml roztworu pentobarbitalu. Należy upewnić się, że wstrzyknięcie jest wykonane po bocznej stronie brzucha, ponieważ żółtko znajduje się pośrodku, a wstrzyknięcie tam może nie być skuteczne.</li>
		<li>Poczekaj, aż wstrzyknięte kurczaki zostaną znieczulone (trzymaj kurczaka w ręku, jeśli szyja nie jest napięta, a głowę można swobodnie kołysać, znieczulenie jest wystarczające). Umieść kurczaki na stole operacyjnym (grzejniki są konieczne, jeśli temperatura w pomieszczeniu jest niższa niż 20 °C).</li>
		<li>Wprowadzić dwie elektrody igłowe z dwóch stron jamy brzusznej, podskórnie. Upewnij się, że igły nie wchodzą do jamy brzusznej, unosząc nieco skórę i wprowadzając stamtąd igłę. Po włożeniu ostrożnie popchnąć igłę do przodu, aż dotrze do boku jamy klatki piersiowej. Upewnij się, że igła nie wchodzi głęboko w ciało ani nie wystaje ze skóry.</li>
		<li>Wykonaj pomiary za pomocą przyrządu do elektrokardiografii. Można zastosować inne podobne instrumenty zdolne do elektrokardiografii.</li>
		<li>Jeśli kurczaki mają zostać złożone w ofierze, należy przeprowadzić eutanazję po elektrokardiografii, ponieważ są one już pod narkozą. Jeśli kurczaki mają przeżyć, umieść je z powrotem w klatkach i ogrzewaj się do momentu przebudzenia. Inną opcją jest zwrócenie ich do inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Histomorfometria (<silna klasa="xfig">Rysunek 5) 
	UWAGA: Opracowano specjalną metodę oceny grubości ściany prawej komory w przekrojach poprzecznych serca. Ocena morfologiczna wymiaru prawej komory za pomocą echokardiografii nie jest w 100% dokładna ze względu na nieregularny kształt prawej komory, a metoda ta może służyć jako dobre uzupełnienie w ocenach morfologicznych prawej komory.
	<ol>
		<li>Przygotuj następujące niezbędne odczynniki/narzędzia: 4% formaldehyd buforowany fosforanem, ostre ostrze, sól fizjologiczna buforowana fosforanami, ręcznik papierowy, waga elektryczna, małe nożyczki, ogólne środki do przetwarzania histologicznego (klasyfikowany etanol, ksylen, parafina).</li>
		<li>Po uśmierceniu zwierząt użyj wody do zmoczenia piór. Ma to na celu zminimalizowanie potencjalnego zanieczyszczenia spowodowanego latającymi piórami podczas otwierania klatki piersiowej.</li>
		<li>Ostrożnie otwórz klatkę piersiową, nie uszkadzając serca. Użyj małych nożyczek, aby przeciąć naczynia krwionośne i delikatnie usuń serce z jamy klatki piersiowej. Pozostaw mały kawałek (około 1-2 mm) układu krwionośnego przyczepiony do serca, ponieważ może to być wygodne do późniejszego obchodzenia się z sercem bez uszkadzania serca.</li>
		<li>Po wyjęciu opłucz serce w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, aby usunąć krew i rozluźnić mięśnie. Następnie zanurz serce w ręczniku papierowym przed ważeniem, aby uzyskać dokładny odczyt masy. Umieść serce w utrwalaczu o 10-krotnej objętości (4% formaldehyd buforowany fosforanem) na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Utrwalone tkanki mogą być następnie przetwarzane na bloki parafinowe lub przechowywane w temperaturze 4 °C przez lata (niezalecane, jeśli planowana jest immunohistochemia).</li>
		<li>Przed osadzeniem przetnij tkanki na około 60% długości serca, licząc od wierzchołka (<silna klasa="xfig">Ryc. 5A), aby ułatwić późniejszą obróbkę. Ostrze mikrotomowe jest zalecane do szybkiego i pionowego, czystego cięcia. W przypadku kurczaków starszych niż jeden dzień należy wykonać kolejne cięcie na około 25-30% długości od wierzchołka, aby ułatwić penetrację parafiny i umożliwić zmieszczenie się tkanki w kasetach tkankowych.</li>
		<li>Przetwarzaj tkanki w następujących warunkach (dostosuj w razie potrzeby): 70% etanolu przez 1 h, 80% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu przez 1 h x2, 100% etanolu przez 30 min x2, ksylenu przez 5 min x2, parafiny (temperatura topnienia 52-54 °C) przez 1,5 h, parafiny (temperatura topnienia 62-64 °C) przez 1 godzinę, a następnie zanurz tkanki w mieszaninie 3:1 parafiny (temperatura topnienia 62-64 °C) i parafiny (temperatura topnienia) i parafiny (temperatura topnienia 52-54 °C).</li>
		<li>Przeciąć tkankę o grubości 6 μm. Ostrożnie utrzymuj identyczne względne pozycje przekrojów, potwierdzając obecność i wielkość anatomicznego punktu orientacyjnego (beleczka septomarginalna) w prawej komorze. Potwierdź punkt orientacyjny o umiarkowanej długości na każdej sekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B, strzałka).</li>
		<li>Wykonaj dwie elektroniczne linijki za pomocą programatora logo: Linijka 1 to linia prosta z 7 liniami miary o promieniu przymocowanymi do środkowego punktu, z 22,5 ° między dwiema sąsiednimi liniami miary. Linijka 2 to po prostu dwie prostopadłe linie w kształcie litery T (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B).</li>
		<li>Zmierz za pomocą dwóch programów: Adobe Photoshop i ImageJ.
		<ol>
			<li>W Photoshopie zmień rozmiar linijki 1 (BEZ zmiany kształtu), aby umieścić dwa końce linijki na dwóch końcach wolnej ściany prawej komory, tak aby siedem linii miary na linijce 1 spotkało się z wewnętrzną ścianą prawej komory. Następnie użyj linijki 2, aby wykonać prostopadłe pomiary od wewnętrznej do zewnętrznej ściany komory (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B).</li>
			<li>Użyj ImageJ, aby wykonać siedem pomiarów dla każdego serca.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W zależności od konkretnych potrzeb przeanalizuj siedem pomiarów lub uśrednij dla jednej reprezentatywnej grubości ściany prawej komory. Normalizuj do całej masy serca dla określonych zmian grubości ściany komory.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kain, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+as+an+expanding+experimental+model+for+cancer+and+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research.</a> Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).</li>
<li>Menna, T. M., Mortola, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+posture+on+the+respiratory+mechanics+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadmium+effects+on+early+development+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cadmium effects on early development of chick embryos.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).</li>
<li>Lv, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bone+morphogenetic+protein+2+in+perfluorooctanoic+acid+induced+developmental+cardiotoxicity+and+l-carnitine+mediated+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).</li>
<li>Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+evidence+of+neurotoxic+effects+in+chicken+embryos+after+exposure+to+perfluorooctanoic+acid+%28PFOA%29+and+inorganic+cadmium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium.</a> Toxicology. 4227, 152286(2019).</li>
<li>Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perflurooctanoic+acid+induces+developmental+cardiotoxicity+in+chicken+embryos+and+hatchlings%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings.</a> Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).</li>
<li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+very+early-in-life+exposure+to+diesel+exhaust+induced+cardiopulmonary+toxicity+in+a+hatchling+chick+model%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model.</a> Environmental Pollution. 264, 114718(2020).</li>
<li>Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorooctanoic+acid+induced-developmental+cardiotoxicity%3A+are+peroxisome+proliferator+activated+receptor+alpha+%28PPARalpha%29+and+bone+morphorgenic+protein+2+%28BMP2%29+pathways+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health%2C+Part+A%22%5BJournal%5D)">Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).</li>
<li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+levels+of+l-carnitine%2C+acetyl-l-carnitine+and+propionyl-l-carnitine+are+involved+in+perfluorooctanoic+acid+induced+developmental+cardiotoxicity+in+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PPAR+alpha+in+perfluorooctanoic+acid+induced+developmental+cardiotoxicity+and+l-carnitine+mediated+protection-Results+of+in+ovo+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).</li>
<li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particulate+Matter+2.5+Induced+Developmental+Cardiotoxicity+in+Chicken+Embryo+and+Hatchling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling.</a> Front Pharmacol. 11, 841(2020).</li>
<li>Molina, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+air+cell+injection+of+perfluorooctane+sulfonate+before+incubation+on+development+of+the+white+leghorn+chicken+%28Gallus+domesticus%29+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).</li>
<li>Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-%283-allyl-4-hydroxyphenyl%29+sulfone+decreases+embryonic+viability+and+alters+hepatic+mRNA+expression+at+two+distinct+developmental+stages+in+chicken+embryos+exposed+via+egg+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).</li>
<li>Franci, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potency+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+in+chicken+and+Japanese+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).</li>
<li>Rand, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+exposure+to+methylmercury+and+resultant+muscle+mercury+accumulation+and+adult+motor+deficits+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice.</a> Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).</li>
<li>Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+maternal+exposure+to+fungicides+on+behavioral+development+in+F1+-generation+mice%3A+2.+Fixed-dose+study+of+thiabendazole%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research%22%5BJournal%5D)">Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole.</a> Birth Defects Research. , (2020).</li>
<li>Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+social+deficits+and+enhanced+sensitivity+to+prenatal+chlorpyrifos+in+PON1-%2F-+mouse+pups+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults.</a> PLoS One. 15 (9), 0239738(2020).</li>
<li>Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B2+paces+neuronal+production+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 12(2020).</li>
<li>Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-Amniotic+Sildenafil+Treatment+Promotes+Lung+Growth+and+Attenuates+Vascular+Remodeling+in+an+Experimental+Model+of+Congenital+Diaphragmatic+Hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).</li>
<li>Vyslouzil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subchronic+continuous+inhalation+exposure+to+zinc+oxide+nanoparticles+induces+pulmonary+cell+response+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Trace+Elements+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice.</a> Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511(2020).</li>
<li>Wahle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+neurological+effects+of+cerium+dioxide+nanoparticles+doped+with+different+amounts+of+zirconium+following+inhalation+exposure+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer's and vascular disease.</a> Neurochemistry International. 138, 104755(2020).</li>
<li>Tanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Echocardiography-+Role+in+Clinical+Practice+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+J%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions.</a> Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Zarodek kurczaka jest klasycznym modelem w badaniach rozwojowych od 200 lat1. Nasze metody przedstawione w tym manuskrypcie zostały wykorzystane do oceny kilku zanieczyszczeń środowiska, w tym kwasu perfluorooktanowego, cząstek stałych i spalin z silników wysokoprężnych z powodzeniem5, 7,8,9,10,11,12<sup class="xre...

Embrion kurczaka to klasyczny model rozwojowy, który jest używany od ponad dwustu lat1. Model zarodka kurczaka ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi modelami. Po pierwsze, już ponad 70 lat temu prawidłowy rozwój zarodka kurzego został bardzo wyraźnie zilustrowany w przewodniku Hamburger-Hamilton2, w którym zdefiniowano łącznie 46 etapów rozwoju zarodka kurzego z dokładnym czasem i charakterystyką morfologiczną, co ułatwiło wykrycie nieprawidłowego rozwoju. Ponadto model zarodka kurzego ma inne cechy, takie jak stosunkowo niski koszt i nadmiarowość pod względem ilości, stosunkowo dokładna kontrola ekspozycji i dawki, niezależny, zamknięty system w skorupce i łatwa manipulacja rozwijającym się zarodkiem, co gwarantuje jego potencjał do wykorzystania jako potężnego modelu oceny toksykologicznej. 
W kardiotoksyczności, zarodek kurczaka ma czterokomorowe serce, podobne do serc ssaków, ale o grubszych ściankach, co pozwala na łatwiejszą ocenę morfologiczną. Dodatkowo zarodek kurczaka pozwala na rozwojową ekspozycję inhalacyjną, co nie jest możliwe w modelach ssaków: w późniejszym etapie rozwoju zarodek kurczaka przejdzie z oddychania wewnętrznego do oddychania zewnętrznego (pobieranie tlenu przez płuca); To ostatnie wymaga, aby zarodek przeniknął dziobem przez błonę komórek powietrznych i zaczął oddychać powietrzem3, czyniąc komórkę powietrzną mini-komorą inhalacyjną. Wykorzystując to zjawisko, można ocenić toksykologiczne skutki zanieczyszczeń gazowych na serce (i inne narządy) bez konieczności stosowania dedykowanych przyrządów do inhalacji. 
W tym manuskrypcie opisano kilka metod oceny ekspozycji/punktów końcowych, z których wszystkie służą do tego, aby zarodek kurczaka stał się potężnym narzędziem w ocenie rozwoju kardiotoksyczności po ekspozycji na zanieczyszczenia środowiska.

<table><tbody><tr><td>4% buforowany fosforanem formaldehydefiksative</td><td>Biosharp, Hefei, Chiny</td><td>REF: BL539A</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Guoyao, Szanghaj, Chiny</td><td>CAS: 64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Monitor biosygnalizacji BL-420E +</td> <td>Taimeng, Chengdu, Chiny</td><td>BL-420E+</td><td></td></tr><tr><td>Lampa świecowa</td><td>Zhenwei, Dezhou, Chiny</td><td>WZ-001</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka</td><td>Zhiyu, Jiangsu, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator jaj</td><td>Keyu, Dezhou, Chiny</td><td>KFX</td><td></td></tr><tr><td>Bilans elektryczny</td><td>OHAUS, Szanghaj, Chiny</td> AR <td>224CN</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator elektrotermiczny</td><td>Shenxian, Szanghaj, Chiny</td><td>DHP-9022</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu</td><td>Guoyao, Szanghaj, Chiny</td><td>CAS: 64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Płodne jajo</td> <td>kurzeJianuo, Jining, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny</td><td>Beyotime, Pekin, Chiny</td><td>C0105</td><td></td></tr><tr><td>Histologia parafina</td><td>Aladyn, Szanghaj, Chiny</td><td>P100928-500g</td><td>Temperatura topnienia 52 ~ 54&deg; C</td></tr><tr><td>Parafina histologiczna</td><td>Aladdin, Szanghaj, Chiny</td><td>P100936-500g</td><td>Temperatura topnienia 62 ~ 64&deg; </td></tr><tr><td>Cewnik C IV</td><td>KDL, Zhejiang, Chiny</td><td></td><td>Cewniki muszą być miękkie, plastikowe.</td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Genechem, Szanghaj, Chiny</td><td></td><td>lentiwirusy zostały indywidualnie zaprojektowane/zsyntetyzowane przez Genechem.</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia trichromów Massona</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>Metalowa sonda G1340</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jinuotai, Pekin, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz (5 uL)</td><td>Anting, Szanghaj, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop CAIKON, Szanghaj, Chiny</td><td>XSP-500</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Niemcy</td><td>HistoCore BIOCUT</td><td></td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Leica,Niemcy</td><td>Leica 819</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitual sodu</td><td>Yitai Technology Co. Ltd.,&nbsp; Wuhan, Chiny</td><td>CAS: 57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>Piper (10ul)</td> <td>Sartorius, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jodek powidonu</td><td>Longyuquan, Taian, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Anqisheng, Suzhou, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>Kelun, Chengdu, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olej słonecznikowy</td><td>Mighty Jiage, Jiangsu, Chiny</td><td></td><td>Każdy komercyjny olej słonecznikowy do spożycia przez ludzi powinien działać</td></tr><tr><td>Taśma</td><td>M& G, Szanghaj, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torba PVF Tedlar (5L)</td> <td>Delin, Dalian, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikser Vortex</td><td>SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US</td><td>MX-F</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Guoyao, Szanghaj, Chiny</td><td>CAS: 1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

Using Chicken Embryo as a Powerful Tool in Assessment of Developmental Cardiotoxicities

Embriony kurczaka są klasycznym modelem w badaniach rozwojowych. Podczas rozwoju zarodków kurzych okno czasowe rozwoju serca jest dobrze określone i stosunkowo łatwo jest osiągnąć precyzyjną i terminową ekspozycję za pomocą wielu metod. Co więcej, proces rozwoju serca w zarodkach kurcząt jest podobny do procesu ssaków, co również prowadzi do powstania czterokomorowego serca, co czyni go cennym modelem alternatywnym w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej. W naszym laboratorium model zarodka kurzego jest rutynowo stosowany do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po narażeniu na różne zanieczyszczenia środowiska, w tym substancje per- i polifluoroalkilowe (PFAS), cząstki stałe (PM), spaliny z silników wysokoprężnych (DE) i nanomateriały. Czas ekspozycji można dowolnie dobierać w zależności od potrzeb, od początku rozwoju (dzień embrionalny 0, ED0) aż do dnia poprzedzającego wyklucie. Główne metody ekspozycji obejmują wstrzyknięcie komórek powietrznych, bezpośrednie mikroiniekcje i inhalacje komórek powietrznych (pierwotnie opracowane w naszym laboratorium), a obecnie dostępne punkty końcowe obejmują czynność serca (elektrokardiografia), morfologię (oceny histologiczne) i oceny biologii molekularnej (immunohistochemia, qRT-PCR, western blotting itp.). Oczywiście model zarodka kurzego ma swoje ograniczenia, takie jak ograniczona dostępność przeciwciał. Niemniej jednak, wraz z coraz większą liczbą laboratoriów zaczynających korzystać z tego modelu, może on zostać wykorzystany do wniesienia znaczącego wkładu w badania nad kardiotoksycznością rozwojową.

Wyniki ekspozycji 
Iniekcja do komory powietrznej 
Iniekcja do komory powietrznej pozwala na skuteczne narażenie rozwijających się zarodków kurzych na różne substancje, które mogą zostać następnie wykryte w pobranych próbkach (surowica, tkanki itp.) zarodków lub wyklutych kurcząt. Poniżej przedstawiono przykład, w którym do komory powietrznej wstrzyknięto kwas perfluorooktanowy (PFOA), a następnie oznaczono stężenia PFOA w surowicy za pomocą ultra-wydajnej chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas. St...

Kurze zarodki, jako klasyczny model rozwojowy, są używane w naszym laboratorium do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po ekspozycji na różne zanieczyszczenia środowiska. Metody ekspozycji i metody oceny morfologicznej/funkcjonalnej zostały opisane w niniejszym manuskrypcie.

Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

Chicken embryos are a classical model in developmental studies. During the development of chicken embryos, the time window of heart development is ...

Witam wszystkich. Nazywam się Qixiao Jiang i jestem profesorem nadzwyczajnym na Wydziale Toksykologii Szkoły Zdrowia Publicznego na Uniwersytecie Qingdao. W imieniu mojej grupy badawczej zamierzam przedstawić korzyści płynące z wykorzystania zarodka kurzego w procesie oceny naszej kardiotoksyczności.Zarodek kurczaka to klasyczny model rozwojowy, który ma wiele zalet, takich jak łatwa manipulacja, wysoka dostępność, zamknięty niezależny system i tak dalej. Praca z wieloma zanieczyszczeniami środowiska, takimi jak fenolowy kwas garbnikowy. Spaliny z silników wysokoprężnych, szczególnie materia na nanorurkach węglowych.W laboratorium opracowaliśmy wiele metod ekspozycji, ale w przypadku większych przypadków rutynowo przeprowadza się również oceny funkcjonalne. W tym filmie pokażę Wam szczegóły dotyczące metod ekspozycji i metod morfologicznej oceny funkcjonalnej. Jeśli jesteś zainteresowany, skontaktuj się z nami.Dziękuję. Oto nasze metody ekspozycji, które mogę Ci przedstawić. Pierwszą metodą, którą zamierzam przedstawić, jest wstrzyknięcie komórki powietrznej, w której bezpośrednio wstrzykniesz do komórki powietrznej.Oczyść powierzchnię jaj roztworem polijodku. Jest to dostępny w handlu roztwór polijodku, rozcieńczony wodą dejonizowaną w 1/5. A następnie suszę skorupkę jajka bibułą, bez szorowania.Jest to ważne, ponieważ szorowanie spowoduje zerwanie powłoki warstwy ochronnej na zewnątrz skorupy. Oczyściłem wszystkie jajka w ciemnym pokoju i zaznacz komórkę powietrzną ołówkiem. Wyklucz jajka z pęknięciami na skorupce.Wyklucz również jaja z komórkami powietrznymi z boku. Jeśli ma końcówkę, jest bardzo mało prawdopodobne, że wyklują się normalnie. Zdezynfekuj obszar komórki powietrznej, a także metalową sondę, 75% alkoholem.Wytrzyj je do sucha, a następnie wywierć mały otwór w środku obszaru komórki powietrznej za pomocą sondy. Nie wkładaj sondy głęboko w komórkę powietrzną. Zamiast tego rozbij skorupę tylko końcówką sondy.Jeśli otwór nadal nie jest wystarczająco duży, ponownie rozbij skorupę w pobliżu istniejącego otworu, aż będzie wystarczająco duża, aby umożliwić włożenie końcówki. Włóż końcówkę pipety do otworu tak, aby końcówka dotykała wewnętrznej membrany. Powoli wstrzykiwać mieszaninę i przytrzymać ją w tym miejscu przez co najmniej 10 sekund.Ma to na celu umożliwienie pełnego dozowania dozowanego oleju. A następnie usuń końcówkę. Teraz uszczelnij otwór pędzlem i kroplą stopionej parafiny.Uważaj, aby nie kapać stopionej parafiny na pamięć wewnętrzną. Po zamknięciu umieść jaja w inkubatorze, aż osiągną pożądane stadium embrionalne. Drugą, metodą, którą zamierzam przedstawić, jest mikroiniekcja.Przede wszystkim jaja należy oczyścić i obchodzić się z nimi zgodnie z opisem w sekcji dotyczącej wtrysku powietrza. Ta procedura musi być wykonywana w wysterylizowanym kapturze. Wysterylizuj obszar komórek powietrznych i narzędzia acetonem.Wywierć mały otwór w środku obszaru komórki powietrznej za pomocą metalowej sondy. Nie wkładaj sondy głęboko w komórkę powietrzną, ponieważ może to spowodować uszkodzenie pamięci wewnętrznej. Następnie użyj tego samego procesu, aby ostrożnie powiększyć otwór, aż średnica wyniesie około dwóch milimetrów.Może to pozwolić na potwierdzenie proporcji pamięci wewnętrznej. Następnie załaduj roztwór do mikrowtryskiwacza i ostrożnie włóż igłę przez otwór do wewnętrznej membrany na łączną odległość około trzech milimetrów. Delikatnie dozować roztwór, a następnie wyjąć igłę.Igła powinna być ustawiona jak najbardziej prostopadle. Cienko uszczelnij otwór małym kawałkiem taśmy. Całkowicie zakryj otwór, aby zapobiec odwodnieniu i śmierci zarodka podczas kolejnej inkubacji.Trzecią metodą, którą zamierzam przedstawić, jest infuzja komórek powietrznych, w której wkraplacz zanieczyszczenie gazowe do komórki powietrznej. Oczyść jaja i obchodź się z nimi zgodnie z opisem w sekcji dotyczącej wstrzykiwania komórek powietrznych.A potem możesz czytać z jaj aż do 17 dnia embrionalnego. Z jajami należy obchodzić się w 17 dniu embrionalnym, aby oznaczyć obszar komórek powietrznych. W 18 dniu embrionalnym wyjmij jaja z inkubatora, wysterylizuj obszar komórek powietrznych i narzędzia acetonem.A następnie ostrożnie wywierć dwa małe otwory po dwóch stronach komórki powietrznej. Jeden z nich służy do wstrzykiwania gazu lub aerozolu. Drugi służy do rozszerzania naszego powietrza.Dokładnie kontroluj wielkość otworów, tak aby bok otworu iniekcyjnego był wystarczający tylko do wprowadzenia igły cewnika, natomiast średnica otworu rozszerzającego się powinna być nieco większa. Około jednego milimetra średnicy. To jest worek na próbki, którego używamy do przechowywania docelowego gazu lub aerozolu.Możesz zastąpić go dowolnym urządzeniem, którego używasz. Delikatnie wlej 10 ml gazu lub aerozolu do strzykawki. A następnie ostrożnie przymocuj strzykawkę do naszej igły cewnika za pomocą wewnętrznego pilota igły, aby była miękka.Delikatnie wprowadzić igłę cewnika do otworu infuzyjnego. Gdy już się tam znajdzie, dociśnij igłę cewnika. Ma to na celu zminimalizowanie wycieku z miejsca wstrzyknięcia.Drugi palec można umieścić wokół otworu wydalającego w celu potwierdzenia infuzji. Jeśli napar wykonasz delikatnie, przepływ powietrza z otworu wydalniczego powinien być łatwo wyczuwalny. To jest pierwotne powietrze w komórce powietrznej, które jest wydmuchiwane.Po zakończeniu naparu należy natychmiast uszczelnić oba otwory. Te taśmy i jaja wracają do inkubatora. Mogę przedstawić nasz proces oceny punktów końcowych.W pełni znieczulić zwierzęta pentobarbitalem 33 mg/kg. Wtrysk IP testowany przez otwarcia. Następnie umieść kurczaki na stole operacyjnym.Wysterylizuj obszar brzucha i elektrody etanolem. Następnie wprowadź dwie elektrody igłowe z dwóch stron brzucha podciągle. Upewnij się, że igły nie wchodzą do jamy brzusznej, lekko unosząc skórę.I włóż igłę stamtąd. Po włożeniu ostrożnie popchnąć igłę do przodu, aż dotrze do boku jamy klatki piersiowej. Upewnij się, że igła nie wchodzi głęboko w ciało ani nie wystaje ze skóry.Następnie wykonaj pomiary za pomocą przyrządu elektrokardiograficznego. Można również korzystać z innych instrumentów seminaryjnych zdolnych do EKG. Jest to nasza druga metoda oceny punktu końcowego, która polega na mapowaniu dla Motrin.Jest to przekrój serca na drodze HME. To jest prawa komora, którą będziemy mierzyć. Aby to zrobić, używamy dwóch linijek.Linijka 1 i linijka 2. Teraz po prostu kopiujemy linijkę na ekran i zmieniamy jej rozmiar do odpowiedniego rozmiaru, a następnie obracamy. I przesuwamy go tak, aby dwa końce linii poziomej spoczywały na 2 końcach 3 ścian prawej komory.A teraz mamy siedem linii pomiarowych, które przechodzą przez ścianę naszych trzech prawych komór. Teraz kopiujemy również linijkę pomocniczą do obrazu. Zmieniamy również nieco jego rozmiar, obracamy i zastępujemy, aby był umieszczony podobnie.Ta pozioma linia biegnie równolegle do zewnętrznej ściany prawej komory. A prostopadła przechodziłaby przez punkt, w którym linie istoty białej linijki stykają się z wewnętrzną ścianą lub prawą komorą. A następnie wykonujemy kropki pomiarowe, aby można je było później zmierzyć za pomocą obrazu J. Powtarzamy ten proces 7 razy na próbkę, tak aby nasz reprezentatywny pomiar prawej komory.Pokażę Ci podsumowanie obecnych wyników. Jest to wstrzyknięcie PFOA do komórki jajowej przed inkubacją i można zauważyć, że wraz ze wzrostem stężenia LPF w surowicy skutecznie wzrosło. Zgodnie z demonstracją, skutecznością mikroiniekcji.Widać, że A to kontrola, a B to miejsce, w którym wstrzyknięto białko q wyrażające się w doskonałej fluorescencji. Widać silną fluorescencję. I to jest demonstracja skuteczności naparu z nabłonka.Widać, że po infuzji zaobserwowano dramatyczne zmiany światłowodowe w tkance mięśnia sercowego. Porządku. Widać też, że odstępy R-R kurczaków wylęgowych wynoszą 0, 1 i 2 tygodnie. Znacząco zmieniło się to również po infuzji ze spalinami z silników Diesla.Wskazując, że bierzesz pod uwagę to, tę metodę. Tutaj również widać, że skuteczność naparu z nabłonka w tym przykładzie. można zauważyć, że prawa komora serca skutecznie zwiększyła się po nasyceniu aerozolem ze spalinami z silników Diesla.I oczywiście również tutaj używamy metod histomorfometrycznych. Po prostu pokazujemy ci. Jest to dość skuteczne. Porządku.To są wszystkie metody, które zamierzam Ci przedstawić. Mam nadzieję, że ułatwi to innym ludziom pracę z zarodkiem kurzym jako potężnym narzędziem badawczym w toksykologii rozwojowej. Miłego dnia.

using-chicken-embryo-as-powerful-tool-assessment-developmental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę transplantacji ludzkich komórek macierzystych do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego zarodka kurczaka. Stanowi to model in vivo do oceny proliferacji i różnicowania różnych typów ludzkich komórek macierzystych w środowisku tkanki embrionalnej.

Ksenotransplantacja ludzkich komórek macierzystych do zarodka kurczaka

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Po raz pierwszy prezentujemy tutaj powtarzalną procedurę bandingu zmieniającą hemodynamikę w rozwijającym się sercu ex ovo. Osiąga się to poprzez częściowe zwężenie drogi odpływu (OFT).

Nowatorska technika pasmowania ex ovo w celu zmiany hemodynamiki wewnątrzsercowej w embrionalnym układzie kurcząt

W tym badaniu opisujemy system in-ovo jako obiecujące narzędzie do testowania związków insulinomimetycznych w żywym organizmie. Do głównych zalet należy zaliczyć odpowiednie przepustowości i akceptowalne koszty, które umożliwiają identyfikację fitozwiązków o właściwościach insulinomimetycznych.

Model in ovo do badania związków insulinomimetycznych

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Ten protokół opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurczaków w wieku od 5 do 8 dni oraz ich błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Metoda ta przedstawia zarodek kurczaka jako prosty i opłacalny model in vivo do przywrócenia patogenu bakteryjnego L. monocytogenes ze stanu żywotnego, ale nienadającego się do hodowli (VBNC) i z potencjalnymi dalszymi zastosowaniami w zrozumieniu mechanizmów spoczynku bakteryjnego.

Zarodek kurczaka jako model in vivo do ożywiania żywotnych, ale nienadających się do hodowli patogenów

Poznaj metody oceny kardiotoksyczności zanieczyszczeń środowiskowych w zarodkach kurzych. Wykorzystaj mikroinjekcję i infuzję komórki powietrznej do badania wpływu na rozwój serca.

Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

Przeglądaj więcej filmów