Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Tomografia rentgenowska Cryo Soft może dostarczyć cennych informacji ilościowych na poziomie komórkowym, które mogą być wykorzystywane jako samodzielne lub w połączeniu z innymi technikami obrazowania. Obraz z czujnika w stanie zamrożonym, uwodnionym, który wymaga barwienia lub cięcia. Ponadto jest to technika o wysokiej przepustowości, ponieważ każdy tomogram jest zbierany w ciągu zaledwie kilku minut.

Kriotomografia miękkiego promieniowania rentgenowskiego stanowi doskonałą platformę do śledzenia procesu odbudowy komórek w zakażonych lub uszkodzonych komórkach na poziomie pojedynczej komórki. Technika ta może informować o skuteczności nowych leków przeciwwirusowych lub terapii genowej w celu odwrócenia infekcji zredagowanych fenotypów. Aby załadować próbki do transmisyjnego mikroskopu rentgenowskiego, należy schłodzić komorę transferową ciekłym azotem, aż osiągnie temperaturę mniejszą niż 100 kelwinów.

Napełnij stanowisko pracy dodatkowym ciekłym azotem i włącz grzałkę na krawędzi stanowiska pracy. Gdy krawędź stacji roboczej przestanie wrzeć, umieść pojemnik kriogeniczny zawierający kratki w odpowiednich miejscach na stanowisku pracy w warunkach kriogenicznych i załaduj kratki na wcześniej schłodzone uchwyty na próbki. Załaduj uchwyty na wahadłowiec i zabezpiecz je osłonami.

Załaduj czółenko do komory transferowej o temperaturze poniżej 100 kelwinów i przepompuj komorę do niskiej próżni. Przymocuj komorę transferową do mikroskopu i postępuj zgodnie z procedurą próżniową wyświetlaną na ekranie, aby załadować czółenko komory transferowej do mikroskopu. Gdy czółenko znajdzie się w mikroskopie z próbkami, użyj ramienia robota mikroskopu, aby przenieść jeden uchwyt próbki na stolik na próbkę.

Aby zobrazować siatkę w jasnym polu za pomocą mikroskopu światła widzialnego online, wybierz kamerę mikroskopu światła widzialnego i włącz źródło LED mikroskopu światła widzialnego do obrazowania w jasnym polu. Kliknij Motion, Control, Sample i Sample theta, aby obrócić próbkę do minus 60 stopni, tak aby była skierowana w stronę obiektywu mikroskopu światła widzialnego, a następnie wybierz Motion Control i Sample i zmień próbkę X i próbkę Y, aby przesunąć próbkę do oczekiwanych pozycji środkowych. Wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji, Ciągły i Start, a następnie kliknij Sterowanie ruchem i próbka, aby wybrać próbkę Z, aby udoskonalić ostrość mniejszymi krokami w dół do pięciu mikronów, aż komórki i/lub otwory warstwy nośnej węgla będą ostre.

Następnie wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji, Mozaika i Start, aby rozpocząć akwizycję pełnej mapy mozaiki siatki w trybie jasnego pola przy użyciu wartości domyślnych dla mozaiki. W przypadku obrazowania mozaiki w trybie fluorescencji wyłącz źródło LED mikroskopu światła widzialnego do obrazowania w jasnym polu i wybierz źródło światła LED odpowiadające żądanej długości fali wzbudzenia i odpowiedni filtr optyczny ręcznie w konfiguracji. Wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji, Ciągły i Start, a następnie kliknij Sterowanie ruchem i próbka, aby wybrać próbkę Z, aby poprawić ostrość na obrazie fluorescencyjnym.

Następnie kliknij Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji, Mozaika i Start, aby uzyskać mapę mozaiki z zachowaniem pozycyjnych parametrów X i Y z mozaiki jasnego pola. Następnie wyłącz źródło światła LED. W celu akwizycji mozaiki rentgenowskiej zmień szczelinę wylotową na pięć mikronów i użyj jednosekundowej ekspozycji w MISTRAL.

Wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Ustawienia kamery i Binning, aby dostosować ostrość za pomocą translacji Z próbki. Wybierz Motion Control i Sample, aby wybrać próbkę Z. Zaczynając w krokach co pięć mikronów, zawęź ostrość w dół do kroków co 0,5 mikrona, aż komórka lub otwory w folii węglowej będą dobrze ostre. Aby uzyskać mapę mozaikową kwadratu siatki, kliknij Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryb akwizycji, Mozaika i Start.

Po pobraniu mapy kliknij opcje Motion Control i Sample (Sterowanie ruchem) i Sample (Próbka), a następnie zmień próbkę X i próbkę Y, aby przesunąć próbkę do pozycji płaskiego pola. Ustaw czas ekspozycji na jedną sekundę w MISTRAL. Następnie znormalizuj uzyskaną mozaikę za pomocą obrazu płaskiego pola, aby uzyskać transmisję i zapisać znormalizowaną mozaikę.

Aby wyrównać próbkę na osi obrotu z obrotem o zero stopni, wybierz opcje Sterowanie ruchem i próbka, a następnie zmień próbkę X, próbkę Y i próbkę Z, aby skupić się na funkcji komórki, która ma zostać umieszczona na osi obrotu. Aby obrócić próbkę do dodatniej pozycji theta, wybierz Motion Control i Sample i zmień Sample theta na dodatnie theta. Użyj narzędzia Linia, aby narysować linię na elemencie komórki, która ma zostać umieszczona na osi obrotu.

Aby obrócić próbkę do ujemnej pozycji theta, wybierz Motion Control i Sample (Próbka) i zmień Sample theta (Próbka) theta (Próbka) na ujemne theta. Użyj narzędzia Linia, aby narysować linię na elemencie komórki, która ma zostać umieszczona na osi obrotu. Będąc w dodatniej lub ujemnej pozycji theta, użyj translacji Z próbki, aby przesunąć wybrany element do pozycji środkowej między obiema liniami i powtarzaj obrót próbki, aż do uzyskania minimalnej odległości między liniami.

Gdy próbka theta jest równa zero, przesuń próbkę X o dwukrotność odległości potrzebnej do umieszczenia wybranego elementu w środku pola widzenia i przesuń płytkę strefy X, aby przywrócić obiekt do środka pola widzenia. Aby ponownie zoptymalizować położenie Z płyty strefy w odniesieniu do nowej osi obrotu, wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji i Seria ogniskowych, a następnie kliknij przycisk Start, aby zarejestrować serię ogniskowych Z płyty strefy. Następnie kliknij opcję Sterowanie ruchem i Blacha strefy i wybierz płytę strefy Z, aby przesunąć płytkę strefy Z do pozycji, w której próbka jest aktywna.

Aby uzyskać tomogram, kliknij Motion Control and Sample (Sterowanie ruchem i próbka), a następnie wybierz opcję Sample theta, aby przesunąć ujemny kąt maksymalny do wartości plus 0,1. Kliknij opcję Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji i Tomografia, aby ustawić liczbę obrazów jako całkowitą liczbę kątów, biorąc pod uwagę obraz pod kątem zerowym i zakres kątowy, a następnie ustaw liczbę obrazów. Wybierz Kąt początkowy i końcowy kąta, kliknij Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Ustawienia kamery i ustaw czas ekspozycji.

Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć nabywanie serii tomografii pochylenia. Idealna próbka powinna mieć pojedyncze komórki w środku kwadratowej siatki osadzonej w cienkiej warstwie lodu i otoczonej dobrze rozproszonymi złotymi znacznikami odniesienia. Wiele różnych organelli, takich jak mitochondria, retikula endoplazmatyczna, wakuole i jądro, powinno być w stanie rozróżnić na końcowym zrekonstruowanym tomogramie, dzięki ilościowej rekonstrukcji liniowych współczynników absorpcji.

Na tym obrazie można zaobserwować kwadrat o większej gęstości komórek. W tym przykładzie blotting był mniej wydajny, co prowadziło do grubszej warstwy lodu z pęknięciami. Mimo że w tym preparacie można rozpoznać niektóre większe struktury, drobne szczegóły zostały utracone w szumie i ziarnistej teksturze z powodu złej jakości zeszklenia grubego lodu.

Z próbką zakonserwowaną kriogenicznie należy obchodzić się w minimalnym stopniu, ponieważ większość artefaktów jest indukowana, gdy próbki znajdują się na tym etapie. Zwykle, korelacyjną fotomikroskopię krio-w świetle widzialnym, stosuje się przed kriosubstratem tomografię. Ponadto mikroskopia spektralna może być wykonana na odpowiednich pierwiastkach chemicznych.

Protokół ten wypełnia niszę, działając w reżimie próbki i rozdzielczości, które nie są łatwo dostępne za pomocą żadnej innej techniki bezpośredniego obrazowania, umożliwiając uzyskanie kilku mikronów i 30-nanometrowej rozdzielczości połowy podziału.