Name: Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj kriomiękką tomografię rentgenowską do trójwymiarowego obrazowania całych komórek bez barwienia i skrawania. Ta metoda dostarcza ilościowych danych o ultrastrukturze komórkowej z rozdzielczością do 25-30 nm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z projektu Komisji Europejskiej Horyzont 2020 iNEXT-Discovery oraz programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy grantowej Marie Skłodowska-Curie nr 75439.

<ol><li>Carrascosa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+X-ray+tomography+of+vaccinia+virus+membranes+and+inner+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments.</a> Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> PNAS. 106, 19375-19380 (2009).</li>
<li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 10, 1-3 (2010).</li>
<li>Chichón, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+nano-tomography+of+vaccinia+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells.</a> Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).</li>
<li>Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+landscape+by+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cellular landscape by soft X-ray tomography.</a> Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).</li>
<li>Kepsutlu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+undergo+major+changes+in+the+quantity+of+cytoplasmic+organelles+after+uptake+of+gold+nanoparticles+with+biologically+relevant+surface+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings.</a> ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).</li>
<li>Natterer, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatterer%2C+F+%22The+mathematics+of+computerized+tomography%22">The mathematics of computerized tomography</a>. , Wiley. New York. (1986).</li>
<li>Weiss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computed+tomography+of+cryogenic+biological+specimens+based+on+X-ray+microscopic+images%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images.</a> Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).</li>
<li>Clowney, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+aggregation+of+olfactory+receptor+genes+governs+their+monogenic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression.</a> Cell. 151, 724-737 (2012).</li>
<li>Duke, E. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+endosomes+and+autophagosomes+in+whole+mammalian+cells+using+correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+microscopy+%28cryo-CLXM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM).</a> Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).</li>
<li>Cinquin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+molecules+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Putting molecules in their place.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).</li>
<li>Hagen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nanoparticles+as+alignment+and+correlation+markers+in+fluorescence%2Fsoft+X-ray+cryo-microscopy%2Ftomography+of+nucleoplasmic+reticulum+and+apoptosis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).</li>
<li>Pérez-Berná, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+cells+images+by+soft+X-ray+cryo-tomography+during+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection.</a> ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).</li>
<li>Chiappi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-soft+X-ray+tomography+as+a+quantitative+three-dimensional+tool+to+model+nanoparticle%3Acell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, 15(2016).</li>
<li>Varsano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+correlative+cryo-soft+X-ray+tomography+and+stochastic+reconstruction+microscopy.+A+study+of+cholesterol+crystal+early+formation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).</li>
<li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182, 1-16 (2020).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+of+quinoline+antimalarial+drugs+in+red+blood+cells+infected+by+Plasmodium+falciparum+revealed+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo.</a> PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).</li>
<li>Conesa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unambiguous+intracellular+localization+and+quantification+of+a+potent+iridium+anticancer+compound+by+correlative+3D+cryo+X-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging.</a> Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).</li>
<li>Gal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native-state+imaging+of+calcifying+and+noncalcifying+microalgae+reveals+similarities+in+their+calcium+storage+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles.</a> PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).</li>
<li>Procopio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+fingerprint+of+Zn-hydroxyapatite+in+the+early+stages+of+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation.</a> ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).</li>
<li>Kahil, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+of+calcium+transport+and+concentration+toward+mineral+formation+in+sea+urchin+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae.</a> PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).</li>
<li>Conesa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanoparticles+mass+quantification+by+near-edge+absorption+soft+X-ray+nanotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography.</a> Scientific Reports. 6, 22354(2016).</li>
<li>Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+modulation+transfer+function+of+an+X-ray+microscope+based+on+multiple+Fourier+orders+analysis+of+a+Siemens+star%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star.</a> Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).</li>
<li>Otón, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transfer+function%2C+resolution+and+depth+of+field+of+a+soft+X-ray+microscope+applied+to+tomography+enhancement+by+Wiener+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution.</a> Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).</li>
<li>Messaoudi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+chemical+mapping+by+EFTEM-TomoJ+including+improvement+of+SNR+by+PCA+and+ART+reconstruction+of+volume+by+noise+supression%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression.</a> Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).</li>
<li>Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+tomographic+reconstruction+on+multicore+computers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast tomographic reconstruction on multicore computers.</a> Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).</li>
<li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17, 50-54 (2020).</li>
<li>Attwood, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAttwood%2C+D+%22Soft+X-rays+and+Extreme+Ultraviolet+Radiation.+Principles+and+Applications%22">Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2000).</li>
<li>Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowells%2C+M+%22Principles+and+Applications+of+Zone+Plate+X-ray.+Microscopes.+Science+of+Microscopy%22">Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy</a>. , Springer. New York. (2007).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+image+browser%3A+a+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).</li>
<li>Luengo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SuRVoS%3A+Super-region+volume+segmentation+workbench%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench.</a> Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przygotowanie próbki jest kluczowym krokiem do uzyskania wysokiej jakości miękkich tomogramów rentgenowskich, ponieważ ich jakość zależy bezpośrednio od jakości witryfikacji próbki i grubości warstwy lodu, w której osadzona jest komórka. Projekcje o wysokim stosunku sygnału do szumu będą zbierane w regionach z cienką warstwą lodu, co pozwoli zminimalizować dawkę promieniowania wymaganą do osiągnięcia najwyższej możliwej rozdzielczości. Ponadto zbieg komórek będzie również miał wpływ na końcową jakość tomogramu, ponieważ należy unikać sytuacji, w której sąsiednie komórki wchodzą w pole widzenia podczas rotacji. Wreszcie, właściwa dyspersja znaczników odniesienia Au określi dokładność wyrównania projekcji, a następnie ostatecznie określi jakość końcowej objętości zrekonstruowanej w 3D. Należy pamiętać, że odpowiednie rozproszenie Au fiducials na siatce umożliwia automatyzację kroku wyrównania projekcji, bez którego potrzebna jest wysoka wiedza specjalistyczna dla tak krytycznego kroku.
Niniejszy protokół przedstawia tylko jedną możliwą strategię przygotowania próbki, która jest podobna do tych stosowanych w kriotomografii elektronowej (cryo-ET). W obu przypadkach protokoły poprawiające wymagające przygotowanie próbek w celu uzyskania lepszej odtwarzalności będą miały fundamentalne znaczenie dla powodzenia tych technik i podejmowane są wysiłki w tym kierunku29. Warto wspomnieć, że oprócz obrazowania izolowanych komórek, można również wizualizować wycinki tkanki, pod warunkiem, że sygnał transmisyjny przez przekrój będzie wystarczający przy dużych kątach nachylenia. Zazwyczaj oznacza to przekroje o wielkości kilku mikronów (poniżej 10 μm).
Aby zobrazować określoną strukturę lub zdarzenie wewnątrz komórki, należy upewnić się, że ta konkretna cecha znajduje się wewnątrz pola widzenia serii pochylenia. Ponieważ pole widzenia w cryo-SXT jest ograniczone do 10 x 10 μm2 do 15 x 15 μm2 w zależności od obiektywu i uwzględnia nadpróbkowanie pikseli rozdzielczości do co najmniej współczynnika 2, często jest mniejsze niż pełne rozszerzenie komórki (patrz czerwone kwadraty wskazane na rysunku 5). Dlatego zwrot z inwestycji musi zostać znaleziony i odpowiednio oznaczony. Odbywa się to zwykle za pomocą znaczników fluorescencyjnych i podejść korelacyjnych w świetle widzialnym. Strategie 2D łączące epifluorescencję są proste, ponieważ mikroskop transmisyjny miękkiego promieniowania rentgenowskiego ma zintegrowany mikroskop fluorescencyjny światła widzialnego on-line, ale dostępne są również inne podejścia do sygnału fluorescencji 2D lub 3Do wysokiej rozdzielczości 4,12,13,15,16 . W takich przypadkach siatka musi być najpierw zobrazowana w określonych instrumentach, takich jak mikroskopy o wysokiej rozdzielczości. Należy zauważyć, że najbardziej efektywne podejścia korelacyjne to te, które obejmują gromadzenie danych w warunkach kriogenicznych. Dzieje się tak, ponieważ upływ czasu między temperaturą pokojową (RT), obrazowaniem fluorescencyjnym w świetle widzialnym i witryfikacją próbki, na przykład, utrudni uchwycenie właściwego zdarzenia komórkowego na czas; ponadto procedura witryfikacji może odłączyć komórkę będącą przedmiotem zainteresowania, która została zobrazowana w RT, od siatki. Nawet jeśli większość metod obrazowania korelacyjnego może sugerować, że siatki próbek muszą być manipulowane i transportowane z jednego instrumentu do drugiego, i pomimo zwiększonego ryzyka zanieczyszczenia siatki lub uszkodzenia, jakie to stwarza, nagroda jest jasna: możliwość wskazania określonych zdarzeń lub cząsteczek w krajobrazie komórkowym.
Gdy wymagane jest obrazowanie całych komórek, możliwe jest zszywanie różnych tomogramów, pod warunkiem, że całkowita zastosowana dawka nie przekracza limitu uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Zazwyczaj zdeponowana dawka do pobrania kilku tomogramów na tej samej komórce jest znacznie niższa od limitu w osiągalnej rozdzielczości (109 Gy) i dlatego nie jest wymagana żadna szczególna strategia obniżania dawki, chociaż jest to zależne od próbki i eksperymentu. W przypadku intensywnego gromadzenia danych, takiego jak spektrotomografia, konieczne byłoby zminimalizowanie dawki i zastosowanie wygodnych strategii gromadzenia danych i ich przetwarzania.
Cryo-SXT ma kilka ograniczeń, o których należy tutaj wspomnieć. Pierwszym z nich jest dobrze znany brakujący klin, który jest nieodłącznym elementem stosowania płaskich podpór próbek. Kapilarne nośniki próbek umożliwiające obrót o 180 stopni były stosowane w przeszłości i nadal są stosowane w niektórych obiektach, ale mają również wady, takie jak zubożony kontrast spowodowany absorpcją szkła i ograniczenie stosowania komórek w zawiesinie. Sposobem na zmniejszenie efektu brakującego klina jest wykonanie tomografii z podwójnym pochyleniem. Jest to obecnie możliwe na linii badawczej Mistral. Drugim ograniczeniem jest stosowana w tego typu mikroskopach soczewka ze strefą Fresnela. Ten obiektyw ustawia najwyższą osiągalną rozdzielczość i głębię ostrości (DoF), które są ze sobą ściśle powiązane. Oznacza to, że zwiększenie rozdzielczości zmniejszy głębię ostrości, podczas gdy grubość komórki będzie często większa. Na przykład obiektyw 40 nm będzie miał teoretycznie głębię ostrości 3 μm i rozdzielczość 24,4 nm o połowie skoku. Kompromis między rozdzielczością a DoF jest więc strategiczny, a wybór obiektywu będzie zależał od typu ogniwa30,31. Wreszcie, działające TXM na całym świecie są dalekie od bycia idealnymi mikroskopami i podejmowane są wysiłki w celu ulepszenia systemów optycznych, aby spełniały teoretyczne oczekiwania. Wreszcie, wizualizację i segmentację zrekonstruowanych woluminów można przeprowadzić za pomocą specjalnych narzędzi programowych 25,32,33,34.
Podsumowując, cryo-SXT pozwala na obrazowanie komórek ilościowo w średniej rozdzielczości (25-30 nm half pitch) i w liczbach statystycznych (kilkadziesiąt tomogramów dziennie). Pozwala to na uzyskanie organizacji, rozmieszczenia i wymiaru organelli w określonych warunkach, na przykład podczas infekcji patogenami lub chorobami, w określonych punktach czasowych lub po określonych zabiegach. Jest to zatem użyteczna technika obrazowania biologicznego uzupełniająca bardziej powszechne mikroskopy elektronowe i mikroskopy światła widzialnego, z których każda zajmuje się określonym zakresem wymiarów i rozdzielczości próbki. Cryo-SXT jest często stosowany w podejściach korelacyjnych obejmujących fluorescencję światła widzialnego, ale możliwe są również inne strategie kriokorelacji.

Krio-SXT może odgrywać kluczową rolę w badaniach nad obrazowaniem biologicznym, ponieważ umożliwia uzyskiwanie trójwymiarowych wolumenów nawodnionych całych komórek o średniej rozdzielczości (half pitch 25-30 nm)1,2,3,4,5,6. W zakresie energii okna wodnego, pomiędzy krawędziami K absorpcji węgla i tlenu (4,4-2,3 nm), bogate w węgiel struktury komórkowe absorbują 10 razy więcej niż bogate w tlen medium, które je przenika i otacza. W tym zakresie energii można obrazować witryfikowane komórki o grubości do 10 µm bez konieczności sekcjonowania lub barwienia, co prowadzi do uzyskania ilościowych projekcji o wysokim kontraście absorpcyjnym, które w połączeniu z możliwością rotacji próbki pozwalają na tomograficzną rekonstrukcję struktury komórkowej. Krio-SXT wypełnia niszę w zakresie wymiarów preparatów i rozdzielczości przestrzennej, która nie jest łatwo dostępna za pomocą żadnej innej techniki obrazowania.
Krótko mówiąc, kontrast absorpcyjny w cryo-SXT jest ilościowy, ponieważ tłumienie fotonów przechodzących przez próbkę o grubości t wynika z prawa Beera-Lamberta w następujący sposób: <img alt="Wzór na zanik wykładniczy, I(t)=I₀e^(-μlt), w analizie optyki i fotoniki." src="/files/ftp_upload/62190/62190eq01.jpg" style="margin:-.4em 0;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">, gdzie I0 reprezentuje intensywność padającą, a µl liniowy współczynnik absorpcji, który zależy od długości fali λ oraz części urojonej β współczynnika załamania światła próbki (<img alt="Równanie przenikalności magnetycznej, \( μ_l = 4πβ/λ \), wzór naukowy." src="/files/ftp_upload/62190/62190eq02.jpg" style="margin:-.4em 0;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">). Tłumienie jest funkcją składu biochemicznego i grubości obrazowanych struktur, przy czym każdy składnik biochemiczny posiada specyficzny liniowy współczynnik absorpcji promieni rentgenowskich µl (LAC). Oznacza to, że wartość każdego woksela tomograficznego zależy od pierwiastków chemicznych i ich stężenia w tym wokselu7. Pozwala to na naturalne rozróżnienie różnych organelli, takich jak jądra, jąderka, ciała lipidowe lub mitochondria, bądź różnych stanów kondensacji chromatyny, wyłącznie na podstawie zrekonstruowanych wartości ich wrodzonego LAC2,8,9.
Ponadto cryo-SXT jest techniką o wysokiej przepustowości, w której tomogramy są zbierane w ciągu kilku minut. Pozwala to w szczególności na obrazowanie w skali mezoskopowej populacji komórek, które można uchwycić w kluczowych punktach czasowych, takich jak podział, różnicowanie i apoptoza, a także w różnych stanach odpowiedzi, na przykład tych wywołanych ekspozycją chemiczną na konkretne terapie lekowe lub infekcje patogenne. Dane zebrane w tych kluczowych punktach dostarczą trójwymiarowego opisu układu z wiernym zapisem organizacji przestrzennej różnych organelli komórkowych w tych konkretnych momentach.
Zazwyczaj cryo-SXT stosuje się w połączeniu z innymi technikami, wykorzystując podejścia korelacyjne, które pozwalają na lokalizację specyficznych cech, zdarzeń lub makrocząsteczek w trójwymiarowym środowisku komórkowym4,10,11,12,13,14,15,16, lub dane z fluorescencji twardego promieniowania rentgenowskiego17,18. Podejścia korelacyjne w warunkach kriogenicznych są niezwykle istotne dla uzyskania możliwie najpełniejszego i najcenniejszego obrazu badanego układu. Zwięzły schemat typowego przebiegu pracy na liniach beamline Mistral (Alba) i B24 (Diamond) dla cryo-SXT przedstawiono na Rysunku 1.
Ponadto, wykorzystując możliwość dostrajania długości fali w ośrodkach synchrotronowych, oprócz informacji strukturalnych można uzyskać dane spektroskopowe, wykorzystując specyficzną absorpcję różnicową poszczególnych pierwiastków zawartych w próbce. Przykładem takiego zastosowania jest lokalizacja wapnia w badaniach procesów biomineralizacji w komórkach19,20,21. Poprzez wykonanie obrazów 2D przy różnych energiach fotonów (widma) lub tomogramów poniżej i na krawędzi absorpcji promieni rentgenowskich interesującego pierwiastka, można zidentyfikować piksele lub voksele zawierające wybrany element. Widma pozwalają również na rozróżnienie stanów chemicznych (np. przemiany bezpostaciowego wapnia w hydroksyapatyt, jak w poprzednim przykładzie biomineralizacji20). Ilościowe oznaczenie różnych pierwiastków jest możliwe w 2D i 3D. Obrazowanie spektroskopowe witryfikowanych komórek wykonuje się zazwyczaj w tzw. oknie wodnym, ale jest ono możliwe również w innych zakresach energii, jeśli zawartość wody jest wystarczająco niska lub jeśli zastosowano inne protokoły przygotowania próbek, w tym odwadnianie22. Szczegółowy protokół spektroskopowy krok po kroku wykracza poza zakres niniejszego opracowania.
W dalszej części protokół koncentruje się na zwięzłym omówieniu głównych etapów przygotowania próbek, przy czym każdy system może wymagać indywidualnej optymalizacji, a następnie przedstawia szczegółową procedurę zbierania danych krok po kroku dla krio-tomografii miękkim promieniowaniem rentgenowskim.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie Amira</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>do segmentacji</td></tr><tr><td>Au Holey Carbon Films&nbsp; siatki szukające</td><td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td><td>&nbsp; R 2/2 Au G200F1</td><td>Au Holey Carbon Films szukaj siatek</td></tr><tr><td>Au nanocząstki</td><td>&nbsp; BBI Group, Cardiff, Wielka Brytania</td><td>Nanocząstki Au 100nm</td><td>100nm Nanocząstki Au (NPs) w nanocząstkach Mistral (Alba)</td></tr><tr><td>Au</td><td>&nbsp; BBI Group, Cardiff, Wielka Brytania</td><td>Nanocząstki Au 250nm</td><td>250 nm Nanocząstki Au (NPs) przy B24 (Diament)</td></tr><tr><td>Axio Scope A1</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>430035 9060</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Bloksy nr 1</td><td>Whatman</td><td>WHA10010155</td><td>Filtr bibułowy</td></tr><tr><td>Bsoft</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do wyrównywania, rekonstrukcji i wizualizacji projekcji (Heymann i in., 2008)</td></tr><tr><td>Chimera</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do segmentacji (Pettersen i wsp. 2004)</td></tr><tr><td>Zestaw do wyładowywania jarzeniowego</td><td>Cryo-EM PELCO easiGlow</td><td>91000S</td><td>System czyszczenia wyładowań jarzeniowych</td></tr><tr><td>Cu Holey Carbon Films&nbsp; siatki szukacza</td> <td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td><td>&nbsp; R 2/2Cu G200F1</td><td>Cu Holey Carbon Films siatki szukacza</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Inaktywowana termicznie, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów w języku Java (NIH & LOCI University of Wisconsin)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie IMOD</td><td></td><td></td><td>do wyrównywania, rekonstrukcji i wizualizacji projekcji (Kremer et al., 1996)</td></tr><tr><td>Tłok siatkowy Leica EM GP</td><td>Automatyczna zamrażarka wgłębna Leica</td><td></td><td>16706401</td></tr><tr><td>Stolik kriogeniczny EM LINKAM</td><td>Linkam Scientific Instruments</td><td>CMS 196</td><td>Mikroskopia kriokorelacyjna, podstawa</td></tr><tr><td>MIB</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do segmentacji (Belevich i wsp. 2016)</td></tr><tr><td>P100 szalka Petriego</td><td>Sigma</td><td>P6106</td><td>Poddana obróbce do hodowli komórkowych i sterylna</td></tr><tr><td>P60 szalka Petriego</td><td>Sigma</td><td>D8054</td><td>Poddana obróbce do hodowli komórkowych i sterylna</td></tr><tr><td>Polilizyna</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>Roztwór poli-L-lizyny 0,01%, sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>miękki mikroskop rentgenowski 0,25-1,2keV</td><td>Xradia</td><td>NCT-SB</td><td>Transmisja miękka Mikroskop rentgenowski</td></tr><tr><td>SURVOS</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do segmentacji&nbsp; (Luengo i wsp. 2017)</td></tr><tr><td>Tomo3d</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do rekonstrukcji (SIRT, WBP) (Agulleiro i wsp. 2011)</td></tr><tr><td>TomoJ</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do rekonstrukcji (ART) (Messaoudi i wsp., 2007)</td></tr><tr><td>XM Data Explorer</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td></td><td>TXM</td></tr></tbody></table>

kartograficzny opis 3d komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Techniki obrazowania są niezbędne do zrozumienia organizacji i maszynerii komórek w badaniach biologicznych i pokrewnych dziedzinach. Wśród tych technik krio-miękka tomografia rentgenowska (SXT) umożliwia obrazowanie całych komórek kriokonserwowanych w zakresie energii promieniowania rentgenowskiego okna wodnego (284-543 eV), w których struktury węglowe mają z natury wyższą absorpcję niż woda, co pozwala na rekonstrukcję 3D liniowego współczynnika absorpcji materiału zawartego w każdym wokselu. W ten sposób można uzyskać ilościowe informacje strukturalne na poziomie całych komórek o grubości do 10 μm, z wysoką przepustowością i rozdzielczością przestrzenną do połowy podziałki 25-30 nm. Cryo-SXT okazał się istotny dla obecnych badań biomedycznych, dostarczając informacji 3D na temat procesów infekcji komórkowych (wirusów, bakterii lub pasożytów), zmian morfologicznych spowodowanych chorobami (takimi jak recesywne choroby genetyczne) i pomagając nam zrozumieć działanie leku na poziomie komórkowym lub lokalizując określone struktury w środowisku komórkowym 3D. Ponadto, wykorzystując przestrajalną długość fali w obiektach synchrotronowych, spektromikroskopia lub jej odpowiednik 3D, spektrotomografia, może być również wykorzystywana do obrazowania i ilościowego oznaczania określonych pierwiastków w komórce, takich jak wapń w procesach biomineralizacji. Cryo-SXT dostarcza informacji uzupełniających do innych technik obrazowania biologicznego, takich jak mikroskopia elektronowa, fluorescencja rentgenowska lub fluorescencja światła widzialnego, i jest zwykle stosowana jako metoda partnerska do obrazowania korelacyjnego 2D lub 3D w warunkach kriogenicznych w celu powiązania funkcji, lokalizacji i morfologii.

Przygotowanie próbek do cryo-SXT może być wymagające. Nawet w obrębie tej samej siatki z próbką mogą występować obszary idealne oraz obszary nieidealne, co pokazano na Rysunku 5, przedstawiającym dwa kwadraty z tej samej złotej siatki pomocniczej (Au finder grid). Idealna próbka powinna zawierać pojedyncze komórki w centrum kwadratowego oczka, zatopione w cienkiej warstwie lodu i otoczone dobrze rozproszonymi złotymi znacznikami fiducjalnymi (Au), które służą do wyrównywania projekcji pod różnymi kątami przed rekonstrukcją tomograficzną. Rysunek 5A przedstawia komórkę fibroblastopodobną (NIH 3T3), która spełnia wiele z tych kryteriów. Pojedynczy przekrój z rekonstrukcji 3D wykonanej przy użyciu ART27 z obszaru oznaczonego czerwonym prostokątem wskazującym pole widzenia (FoV) pokazano na Rysunku 5B. Dzięki ilościowej rekonstrukcji LAC można rozróżnić wiele różnych organelli, takich jak mitochondria (M), retikulum endoplazmatyczne (ER), pęcherzyki (V) oraz jądro komórkowe (N). Ponadto stosunek sygnału do szumu w rekonstrukcji jest bardzo wysoki, co pozwala na uzyskanie wysokiego kontrastu cech komórkowych. Z drugiej strony Rysunek 5C przedstawia kwadrat o wyższej gęstości komórek. W takim przypadku osuszanie (blotting) jest zazwyczaj mniej efektywne, co prowadzi do powstania grubszej warstwy lodu, a nawet problemów z witryfikacją. W niektórych przypadkach można to zaobserwować już podczas badania siatki za pomocą mapowania epifluorescencyjnego przed obrazowaniem rentgenowskim; takich siatek należy bezwzględnie unikać. Na Rysunku 5C widoczne jest pęknięcie w obrębie siatki i witryfikowanego lodu, przebiegające przez cały kwadrat oczka (oznaczone czerwonymi strzałkami). Należy unikać obrazowania w pobliżu pęknięć ze względu na prawdopodobną niestabilność siatki podczas ekspozycji na wiązkę. Ponadto pęknięcia mogą świadczyć o grubości lodu, co miało miejsce w tym obszarze. Seria nachyleń została zarejestrowana w obszarze oznaczonym czerwonym prostokątem. Na Rysunku 5D pokazano pojedynczy przekrój z odpowiadającej mu rekonstrukcji 3D. Mimo że można rozpoznać niektóre większe struktury, drobne szczegóły giną w szumie i ziarnistej teksturze z powodu słabej jakości witryfikacji grubego lodu, co widać szczególnie np. na górnej mitochondrium wskazanej strzałką.
<img alt="Proces krioobrazowania: witryfikacja, światło widzialne, tomografia rentgenowska; schemat układu eksperymentalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat postępowania. Schematyczny przebieg prac przed gromadzeniem danych cryo-SXT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment wzrostu komórek: hodowla w szalce Petriego, obserwacja komórek pod mikroskopem, siatka do liczenia komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Hodowla komórek na siatkach. (A) Komórki rosnące w szalce Petriego P100 z konfluencją około 80%-90%. (B) Szalka Petriego P60 z kilkoma siatkami po wysianiu komórek. (C) Komórki rosnące na siatce po 24 h. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ kriomikroskopii elektronowej do analizy struktury białek, przedstawiający uchwyt próbek i mikroskop." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ładowanie siatek do uchwytów próbek i do komory transferowej. (A) Stanowisko robocze wypełnione ciekłym azotem z wahadłem i kriopudełkami przygotowanymi do ładowania siatek. (B) Uchwyt próbki włożony do ładowarki z załadowaną siatką. (C) Wahadło z uchwytem próbki w pozycji 3 bez pokrywy. (D) Stanowisko robocze z podłączoną komorą transferową. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="System ultrawysokiej próżni, układ spektroskopowy, pomiar optyczny, sprzęt do analizy powierzchni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Załadunek próbek do TXM (A) Podłączenie komory transferowej do TXM. (B) Element transportowy (shuttle) wewnątrz TXM. (C) Ramię robota TXM wprowadzające uchwyt próbki do stolika pomiarowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa struktur komórkowych; widoczne mitochondria i jądro; analiza mikrografii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przykład kriotomogramów miękkiego promieniowania rentgenowskiego. Górny rząd: idealna próbka, (A) 2D widok mozaikowy pola siatki przedstawiający pojedynczą komórkę w centrum. (B) Pojedynczy przekrój z zrekonstruowanej objętości 3D pokazujący obszar zaznaczony czerwoną ramką (A). W porównaniu do (D) obraz jest znacznie gładszy i widocznych jest więcej szczegółów. Dolny rząd: próbki nieidealne, (C) 2D widok mozaikowy pola siatki przedstawiający zbyt wysoką konfluencję komórek oraz pęknięcia w lodzie i folii siatki (czerwone strzałki). (D) Pojedynczy przekrój z zrekonstruowanej objętości 3D pokazujący obszar zaznaczony czerwoną ramką w (C). Słaba lub nieoptymalna witryfikacja jest możliwa do zidentyfikowania po ziarnistej teksturze obrazu. N: Jądro; M: Mitochondria; ER: Retikulum endoplazmatyczne; MV: Ciałka wielkopęcherzykowe; V: Wakuola; Paski skali: A i C 20 µm; B i D 2 µm.V<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig05large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Tomografia rentgenowska Cryo Soft może dostarczyć cennych informacji ilościowych na poziomie komórkowym, które mogą być wykorzystywane jako samodzielne lub w połączeniu z innymi technikami obrazowania. Obraz z czujnika w stanie zamrożonym, uwodnionym, który wymaga barwienia lub cięcia. Ponadto jest to technika o wysokiej przepustowości, ponieważ każdy tomogram jest zbierany w ciągu zaledwie kilku minut.Kriotomografia miękkiego promieniowania rentgenowskiego stanowi doskonałą platformę do śledzenia procesu odbudowy komórek w zakażonych lub uszkodzonych komórkach na poziomie pojedynczej komórki. Technika ta może informować o skuteczności nowych leków przeciwwirusowych lub terapii genowej w celu odwrócenia infekcji zredagowanych fenotypów. Aby załadować próbki do transmisyjnego mikroskopu rentgenowskiego, należy schłodzić komorę transferową ciekłym azotem, aż osiągnie temperaturę mniejszą niż 100 kelwinów.Napełnij stanowisko pracy dodatkowym ciekłym azotem i włącz grzałkę na krawędzi stanowiska pracy. Gdy krawędź stacji roboczej przestanie wrzeć, umieść pojemnik kriogeniczny zawierający kratki w odpowiednich miejscach na stanowisku pracy w warunkach kriogenicznych i załaduj kratki na wcześniej schłodzone uchwyty na próbki. Załaduj uchwyty na wahadłowiec i zabezpiecz je osłonami.Załaduj czółenko do komory transferowej o temperaturze poniżej 100 kelwinów i przepompuj komorę do niskiej próżni. Przymocuj komorę transferową do mikroskopu i postępuj zgodnie z procedurą próżniową wyświetlaną na ekranie, aby załadować czółenko komory transferowej do mikroskopu. Gdy czółenko znajdzie się w mikroskopie z próbkami, użyj ramienia robota mikroskopu, aby przenieść jeden uchwyt próbki na stolik na próbkę.Aby zobrazować siatkę w jasnym polu za pomocą mikroskopu światła widzialnego online, wybierz kamerę mikroskopu światła widzialnego i włącz źródło LED mikroskopu światła widzialnego do obrazowania w jasnym polu. Kliknij Motion, Control, Sample i Sample theta, aby obrócić próbkę do minus 60 stopni, tak aby była skierowana w stronę obiektywu mikroskopu światła widzialnego, a następnie wybierz Motion Control i Sample i zmień próbkę X i próbkę Y, aby przesunąć próbkę do oczekiwanych pozycji środkowych. Wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji, Ciągły i Start, a następnie kliknij Sterowanie ruchem i próbka, aby wybrać próbkę Z, aby udoskonalić ostrość mniejszymi krokami w dół do pięciu mikronów, aż komórki i/lub otwory warstwy nośnej węgla będą ostre.Następnie wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji, Mozaika i Start, aby rozpocząć akwizycję pełnej mapy mozaiki siatki w trybie jasnego pola przy użyciu wartości domyślnych dla mozaiki. W przypadku obrazowania mozaiki w trybie fluorescencji wyłącz źródło LED mikroskopu światła widzialnego do obrazowania w jasnym polu i wybierz źródło światła LED odpowiadające żądanej długości fali wzbudzenia i odpowiedni filtr optyczny ręcznie w konfiguracji. Wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji, Ciągły i Start, a następnie kliknij Sterowanie ruchem i próbka, aby wybrać próbkę Z, aby poprawić ostrość na obrazie fluorescencyjnym.Następnie kliknij Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji, Mozaika i Start, aby uzyskać mapę mozaiki z zachowaniem pozycyjnych parametrów X i Y z mozaiki jasnego pola. Następnie wyłącz źródło światła LED. W celu akwizycji mozaiki rentgenowskiej zmień szczelinę wylotową na pięć mikronów i użyj jednosekundowej ekspozycji w MISTRAL.Wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Ustawienia kamery i Binning, aby dostosować ostrość za pomocą translacji Z próbki. Wybierz Motion Control i Sample, aby wybrać próbkę Z. Zaczynając w krokach co pięć mikronów, zawęź ostrość w dół do kroków co 0,5 mikrona, aż komórka lub otwory w folii węglowej będą dobrze ostre. Aby uzyskać mapę mozaikową kwadratu siatki, kliknij Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryb akwizycji, Mozaika i Start.Po pobraniu mapy kliknij opcje Motion Control i Sample (Sterowanie ruchem) i Sample (Próbka), a następnie zmień próbkę X i próbkę Y, aby przesunąć próbkę do pozycji płaskiego pola. Ustaw czas ekspozycji na jedną sekundę w MISTRAL. Następnie znormalizuj uzyskaną mozaikę za pomocą obrazu płaskiego pola, aby uzyskać transmisję i zapisać znormalizowaną mozaikę.Aby wyrównać próbkę na osi obrotu z obrotem o zero stopni, wybierz opcje Sterowanie ruchem i próbka, a następnie zmień próbkę X, próbkę Y i próbkę Z, aby skupić się na funkcji komórki, która ma zostać umieszczona na osi obrotu. Aby obrócić próbkę do dodatniej pozycji theta, wybierz Motion Control i Sample i zmień Sample theta na dodatnie theta. Użyj narzędzia Linia, aby narysować linię na elemencie komórki, która ma zostać umieszczona na osi obrotu.Aby obrócić próbkę do ujemnej pozycji theta, wybierz Motion Control i Sample (Próbka) i zmień Sample theta (Próbka) theta (Próbka) na ujemne theta. Użyj narzędzia Linia, aby narysować linię na elemencie komórki, która ma zostać umieszczona na osi obrotu. Będąc w dodatniej lub ujemnej pozycji theta, użyj translacji Z próbki, aby przesunąć wybrany element do pozycji środkowej między obiema liniami i powtarzaj obrót próbki, aż do uzyskania minimalnej odległości między liniami.Gdy próbka theta jest równa zero, przesuń próbkę X o dwukrotność odległości potrzebnej do umieszczenia wybranego elementu w środku pola widzenia i przesuń płytkę strefy X, aby przywrócić obiekt do środka pola widzenia. Aby ponownie zoptymalizować położenie Z płyty strefy w odniesieniu do nowej osi obrotu, wybierz Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji i Seria ogniskowych, a następnie kliknij przycisk Start, aby zarejestrować serię ogniskowych Z płyty strefy. Następnie kliknij opcję Sterowanie ruchem i Blacha strefy i wybierz płytę strefy Z, aby przesunąć płytkę strefy Z do pozycji, w której próbka jest aktywna.Aby uzyskać tomogram, kliknij Motion Control and Sample (Sterowanie ruchem i próbka), a następnie wybierz opcję Sample theta, aby przesunąć ujemny kąt maksymalny do wartości plus 0,1. Kliknij opcję Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Tryby akwizycji i Tomografia, aby ustawić liczbę obrazów jako całkowitą liczbę kątów, biorąc pod uwagę obraz pod kątem zerowym i zakres kątowy, a następnie ustaw liczbę obrazów. Wybierz Kąt początkowy i końcowy kąta, kliknij Mikroskop, Akwizycja, Ustawienia akwizycji, Ustawienia kamery i ustaw czas ekspozycji.Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć nabywanie serii tomografii pochylenia. Idealna próbka powinna mieć pojedyncze komórki w środku kwadratowej siatki osadzonej w cienkiej warstwie lodu i otoczonej dobrze rozproszonymi złotymi znacznikami odniesienia. Wiele różnych organelli, takich jak mitochondria, retikula endoplazmatyczna, wakuole i jądro, powinno być w stanie rozróżnić na końcowym zrekonstruowanym tomogramie, dzięki ilościowej rekonstrukcji liniowych współczynników absorpcji.Na tym obrazie można zaobserwować kwadrat o większej gęstości komórek. W tym przykładzie blotting był mniej wydajny, co prowadziło do grubszej warstwy lodu z pęknięciami. Mimo że w tym preparacie można rozpoznać niektóre większe struktury, drobne szczegóły zostały utracone w szumie i ziarnistej teksturze z powodu złej jakości zeszklenia grubego lodu.Z próbką zakonserwowaną kriogenicznie należy obchodzić się w minimalnym stopniu, ponieważ większość artefaktów jest indukowana, gdy próbki znajdują się na tym etapie. Zwykle, korelacyjną fotomikroskopię krio-w świetle widzialnym, stosuje się przed kriosubstratem tomografię. Ponadto mikroskopia spektralna może być wykonana na odpowiednich pierwiastkach chemicznych.Protokół ten wypełnia niszę, działając w reżimie próbki i rozdzielczości, które nie są łatwo dostępne za pomocą żadnej innej techniki bezpośredniego obrazowania, umożliwiając uzyskanie kilku mikronów i 30-nanometrowej rozdzielczości połowy podziału.

a-3d-cartographic-description-cell-cryo-soft-x-ray

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Tomografia krioelektronowa (cryo-ET) umożliwia wizualizację 3D ultrastruktury komórkowej w rozdzielczości nanometrów, ale ręczna segmentacja pozostaje czasochłonna i skomplikowana. Przedstawiamy nowatorski przepływ pracy, który integruje zaawansowane oprogramowanie rzeczywistości wirtualnej do segmentacji tomogramów krio-ET, pokazując jego skuteczność poprzez segmentację mitochondriów w komórkach ssaków.

Wykorzystanie rzeczywistości wirtualnej do immersyjnej segmentacji i analizy danych z tomografii krioelektronowej

Poznaj kriomiękką tomografię rentgenowską do trójwymiarowego obrazowania całych komórek bez barwienia i skrawania. Ta metoda dostarcza ilościowych danych o ultrastrukturze komórkowej z rozdzielczością do 25-30 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Przeglądaj więcej filmów