Ocena nanokryształów moczu u ludzi za pomocą znakowania fluoroforem wapnia i analizy śledzenia nanocząstek

Protokół ten może specyficznie wykrywać nanokryształy zawierające wapń w ludzkim moczu. Technika ta może być potencjalnie przydatna do przewidywania wczesnych etapów tworzenia się kamieni nerkowych, a także innych chorób związanych z krystalicznym mocznikiem. Procedurę zademonstruje dr Parveen Kumar, badacz IV w moim laboratorium.

Niech uczestnicy spożywają dietę o niskiej zawartości szczawianów przez trzy dni i poszczą przez noc. Następnie pobierz 24-godzinną próbkę moczu od uczestników, zanim poprosimy ich o spożycie ładunku szczawianów. Nakarm uczestników koktajlem zawierającym owoce i warzywa o zawartości szczawianów około ośmiu milimoli.

Poproś uczestników, aby zbierali mocz przez 24 godziny po spożyciu szczawianów i zwracali go następnego dnia. Wszystkie próbki moczu należy przechowywać w temperaturze pokojowej przed przetworzeniem. Zmierz i zapisz pH moczu i objętość próbek moczu.

Dokładnie wymieszaj i dodaj 50 mililitrów moczu do oznaczonej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować próbkę w temperaturze 1 200 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki stołowej. Wyrzuć supernatant, a następnie umyj i ponownie zawieś osad z pięcioma mililitrami 100% etanolu.

Odwirować próbkę w temperaturze 1 200 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki stołowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze 100% etanolu. Przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszego przetworzenia lub natychmiast przystąp do barwienia próbek.

Rozcieńczyć nanocząstki złota o wielkości 100 nanometrów w ultraczystej wodzie w stosunku 1:1 000 i wykorzystać je do optymalizacji ustawień w instrumencie. Rozcieńczyć próbki moczu 20 razy w wodzie przed barwieniem pięcioma milimolowymi Fluo-4 AM przez 30 minut w ciemności i przeanalizować próbki za pomocą NTA. Przygotować kryształy szczawianu wapnia i fosforanu wapnia zgodnie z opisem w manuskrypcie przed analizą NTA.

Włącz komputer i instrument, a następnie otwórz oprogramowanie i włącz aparat. Kliknij ikonę przechwytywania w lewym górnym rogu okna, aby uruchomić tryb przechwytywania. Wyczyść platformę, najpierw wpompowując do niej powietrze za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra, aż platforma będzie wyglądać na czystą.

Delikatnie dodaj wodę do aparatu dwa do trzech razy i użyj kolejnej mililitrowej strzykawki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Gdy platforma jest czysta, dodaj wodę i sprawdź, czy na powierzchni nie ma zanieczyszczeń, patrząc na kamerę, a następnie dodaj nanocząsteczki złota jako kontrolę do wtryskiwacza pompy ładującej próbkę, aby skonfigurować urządzenie. Dostosuj poziom kamery na ekranie lub na pokrętle po prawej stronie instrumentu, aż obraz zacznie wyświetlać kolorowe piksele, a następnie zmniejsz poziom kamery.

Następnie dostosuj ekran, aby zoptymalizować obraz. Kliknij lewym przyciskiem myszy na obrazie wideo. Przytrzymaj lewy przycisk myszy i przeciągnij obraz w górę iw dół, aby uzyskać cały widok.

Ustaw prędkość infuzji i ustaw ostrość aparatu tak, aby nanocząsteczki złota były widoczne na ekranie aparatu. Ustaw prędkość infuzji na wysoką dla początkowej konfiguracji, aby upewnić się, że nanocząsteczki złota zostaną wykryte. Po wykryciu zmniejsz prędkość do 50 mikrolitrów na minutę, aby uwidocznić nanocząsteczki złota.

Dostosuj poziom kamery, aby zobrazować cząsteczki. W przypadku próbek niebarwionych wyreguluj wzmocnienie ekranu na poziomie piątym, aby uzyskać ostrość kamery i ustaw poziom kamery na osiem. Po ustawieniu ostrości zapisz próbkę.

Po optymalizacji ponownie wyczyść aparat wodą przed oceną innych próbek, aby upewnić się, że rurka jest czysta i nie ma w niej cząstek. Aby przeanalizować poplamione próbki, ustaw kamerę w pozycji filtra zawierającego odpowiedni filtr fluorescencyjny i załaduj rozcieńczone i zabarwione próbki na wtryskiwacz pompy ładującej próbkę, zmniejszając prędkość do 20 mikrolitrów na minutę do analizy. Ustaw wzmocnienie ekranu na pięć i poziom kamery na 13.

Zapisz dane po każdym pomiarze. Oblicz średnią liczbę nanocząstek dla wszystkich pięciu odczytów dla każdej pojedynczej próbki i przeanalizuj dane przy użyciu odchylenia standardowego lub błędu standardowego średniej. Użyj testów t do analizy sparowanej.

Fluo-4 AM był w stanie związać się zarówno z kryształami szczawianu wapnia, które miały wielkość od 50 do 270 nanometrów i średnie stężenie 1,260 miliona cząstek na mililitr, jak i kryształy fosforanu wapnia, które miały od 30 do 225 nanometrów i miały średnie stężenie 2,220 miliona cząstek na mililitr. 24-godzinne próbki moczu pobrane przed obciążeniem szczawianami zawierały niektóre nanokryształy moczu o wielkości od 110 do 300 nanometrów. Natomiast w próbkach postszczawianowych zaobserwowano znaczny wzrost liczby nanokryształów moczu obecnych w próbkach postszczawianowych.

Aby potwierdzić odtwarzalność metody, próbki mierzono trzykrotnie i nie stwierdzono istotnych różnic w powtórzeniach technicznych. Podczas próby zastosowania tego protokołu mogą wystąpić pewne trudności z dodaniem próbek bez pęcherzyków powietrza do maszyny. Aby temu zapobiec, dodaj powietrze i wodę do urządzenia, a następnie powoli dodawaj próbki.

Upewnij się również, że stale monitorujesz próbki i że nie ma w nich pęcherzyków. Ta nowa metoda będzie testowana u osób z kamicą nerkową szczawianowo-wapniową w celu monitorowania postępu choroby i/lub przewidywania ryzyka wystąpienia kamicy nerkowej.