Monitorowanie aktywności elastazy neutrofilowej i katepsyny G w próbkach ludzkiej plwociny

Nasza sonda i protokoły FRET umożliwiają szybką i czułą ocenę ilościową aktywności wolnej i powierzchniowo związanej elastazy i cetespinu G w plwocinie od pacjentów z neutrofilowymi chorobami dróg oddechowych. Metody te umożliwiają poznanie różnych aspektów patofizjologii proteaz. Wymiary czytnika płytek pozwalają na wykonywanie dużych przesiewów.

Mikroskopia konfokalna obrazuje aktywność enzymu z roztworem subkomórkowym. Natomiast cytometria przepływowa umożliwia fenotypowanie pojedynczych komórek i kwantyfikację aktywności proteazy w spersonalizowany sposób. Technikę tę można rozszerzyć na różne choroby dróg oddechowych, takie jak mukowiscydoza, rozstrzenie oskrzeli lub POChP.

I można go dostosować do różnych próbek biologicznych, takich jak próbki krwi lub pęcherzyków płucnych lub oskrzeli, lawaszu lub myszy. Przed rozpoczęciem procedury indukcji plwociny należy wdychać 200 mikrogramów antagonistów receptora beta 2 salbutamolu. Następnie wdychaj hipertoniczny 6% roztwór soli fizjologicznej przez 15 minut za pomocą nebulizatora.

Zbierz odkrztuszoną plwocinę na szalce Petriego. Oddziel grudki śluzu ze śliny na szalkę Petriego za pomocą końcówki pipety. Zważyć śluz, a następnie dodać do plwociny cztery części objętości na masę 10% sputolizyny i PBS.

Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej na kołyszącym się shakerze przez 15 minut, aby rozpuścić śluz. Ugasić reakcję, dodając jeden mililitr zimnego PBS na każdy mililitr 10% sputolizyny. Odpipetować mieszaninę, aby uzyskać jednorodny roztwór.

Przefiltruj mieszaninę przez sitko nylonowe o grubości 100 mikronów do 50-mililitrowej probówki. Powtórz etap filtracji przez sitko o średnicy 40 mikronów, a następnie odwiruj przez 10 minut w temperaturze 300 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do świeżej probówki i przechowywać go na lodzie.

Delikatnie zawieś ponownie osad komórkowy w 500 mikrolitrach zimnego PBS i umieść go na lodzie. Rozmrozić enzymy na lodzie i ustawić krzywą wzorcową enzymu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Równolegle z preparatem wzorcowym rozcieńczyć próbki plwociny w buforze aktywacyjnym.

Na czytniku płytek ustaw długość fali wzbudzenia dla sondy NE FRET NEmo-1 na 354 nanometry, a długość fali emisji na 400 nanometrów dla donora i 490 nanometrów dla akceptora. Dla sondy CG FRET sSam ustawił długość fali wzbudzenia na 405 nanometrów, a emisję na 485 nanometrów dla donora i 580 nanometrów dla akceptora. Dodaj 40 mikrolitrów próbek, wzorców lub półfabrykatów do studzienek czarnej 96-dołkowej płytki o połowie powierzchni i dodaj mieszankę główną.

Uruchomić czytnik płytek i rejestrować wzrost stosunku dawców do akceptorów co 60 do 90 sekund przez co najmniej 20 minut lub do momentu, gdy wzrost sygnału osiągnie plateau. Wyeksportuj dane i oblicz stosunek dawcy do akceptora, dzieląc RFU dawcy przez RFU akceptora dla każdego punktu czasowego i próbki. Następnie oblicz średni stosunek donorów do akceptorów i odchylenie standardowe.

Określ nachylenie w obrębie liniowego wzrostu zmiany stosunku dawcy do akceptora. Do każdego pomiaru należy ponownie zawiesić 30 000 komórek plwociny w objętości 50 mikrolitrów PBS w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Inkubować komórki plwociny ze specyficznym inhibitorem jako kontrolą ujemną i odpowiednim enzymem jako kontrolą pozytywną przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Dodaj 50 mikrolitrów PBS zawierającego reporter FRET i plamę jądrową do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mikromolowe. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 do 20 minut. Ugasić reakcję, dodając 100 mikrolitrów lodowatego PBS i umieścić próbki na lodzie.

Cytowirować mieszaninę na szkiełkach mikroskopowych. Następnie wysusz na powietrzu i utrwal komórki lodowatym 10% metanolem przez 10 minut. Po utrwaleniu wysuszyć na powietrzu i zamocować próbkę za pomocą odpowiedniego medium mocującego.

Uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wyobraź sobie co najmniej 100 komórek na warunek, aby uzyskać rozstrzygające statystyki. Zawieś ponownie 1 milion komórek w 100 mikrolitrach PBS w pięciomililitrowej probówce z okrągłym dnem z polistyrenu FACS i umieść probówkę na lodzie.

Dodaj dwa mikrolitry bloku FC do każdej próbki. Następnie inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj przeciwciało do każdej probówki i inkubuj na lodzie w ciemności przez 30 minut.

Umyj komórki dwoma mililitrami zimnego PBS i odwiruj w temperaturze 300 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Na koniec ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach PBS. Podziel zawiesinę na dwie probówki, każda po 100 mikrolitrów i dodaj pięć mikrolitrów barwnika żywotności komórek.

Dodać odpowiedni specyficzny inhibitor NSP do probówki kontroli ujemnej i inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj PBS do próbki i przefiltruj ją przez filtr 40 mikronów do czystej probówki FACS. Dodać reporter do próbki kontroli ujemnej i delikatnie odwirować.

Rozpocznij pobieranie komórek inkubowanych z tym specyficznym inhibitorem i, jeśli to konieczne, nieznacznie dostosuj bramki, a także napięcia reporterowe PMT. Aby zarejestrować zmiany w dawcy, aby zaakceptować stosunek wynikający z aktywności proteazy związanej z błoną, rejestruj 1000 neutrofili z każdej probówki, co pięć do 10 minut. Obliczyć współczynnik FRET, dzieląc donor przez wartości kanału akceptorowego dla próbek mierzonych na bramkowanych żywotnych pojedynczych neutrofilach.

Obrazy neutrofili wstępnie inkubowanych ze 100 mikromolowym Sivilestetatem lub pozostawionych nieleczonych przed dodaniem reporterowego NEmo-2 są pokazane tutaj. Sygnał jądrowy wykorzystano do identyfikacji neutrofili na podstawie ich charakterystyki segmentowanych jąder, a ROI wybrano ręcznie. Wykreślono dawcę, który zaakceptowałby stosunek neutrofili plwociny.

Każda kropka reprezentuje średnią jednego zwrotu z inwestycji. Bramkowanie cytometrią przepływową umożliwia rozróżnianie i badanie neutrofili w plwocinie. Rozkład MIF po zerze i 10 minutach zaobserwowano po dodaniu reportera.

Obliczono średnie wartości MFI dawcy i akceptora dla 1000 neutrofili plwociny. Wskaźnik D/A osiągnął plateau po początkowym wzroście. Indukcja plwociny u zdrowych dawców wymaga pewnej praktyki przed doskonałością.

Pamiętaj, aby się zrelaksować i wdychać aerozol przez 10 do 15 minut przed odkrztuszaniem. Ponadto zawsze utrzymuje komórki plwociny na lodzie i przetwarza je tak szybko, jak to możliwe po odkrztuszeniu. Odkryliśmy, że aktywność proteazy związanej z powierzchnią koreluje z wczesnym uszkodzeniem płuc u dzieci i z ciężkością choroby płuc u dorosłych pacjentów z mukowiscydozą.

W związku z tym metody te umożliwiają badanie proteaz jako wczesnych biomarkerów stanu zapalnego w neutrofilowych chorobach dróg oddechowych.