Przejście śródbłonka do mezenchymalnego za pośrednictwem TGF-β (EndMT) i ocena funkcjonalna efektorów EndMT przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9

Przejście śródbłonka do mezenchymalnego to proces komórkowy, w którym komórki śródbłonka zmieniają morfologię kostki brukowej w fenotyp podobny do fibroblastów. Cytokina TGF-beta, transformujący czynnik wzrostu beta, jest głównym motorem tego przejścia. Analiza zmian w morfologii komórek oraz poziomów ekspresji markerów śródbłonka i mezenchymów pozwala ocenić występowanie przejścia śródbłonka do mezenchymalnego.

Pojawiające się dane łączą proces przejścia śródbłonka do mezenchymalnego z różnymi chorobami, w tym rakiem, chorobami układu krążenia i zwłóknieniem. Dane sugerują, że interwencja może przynieść korzyści terapeutyczne. Stymulując proces przejścia śródbłonka do mezenchymalnego, który zachodzi podczas embriogenezy i rozwoju narządów, możemy być w stanie zregenerować tkanki pochodzące z mezenchymalów, takie jak chrząstki, kości i mięśnie.

Aby wykryć białko wewnątrzkomórkowe za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, konieczna jest permeabilizacja komórek przy użyciu 0,1% Triton X-100, aby umożliwić przeciwciałom przejście przez błony komórkowe. Dzięki tej demonstracji wideo naukowcy będą mogli dobrze zrozumieć, jak badać rolę cytokin, takich jak TGF-beta, w przejściu śródbłonka do mezenchymów. Po pierwsze, wysiewaj 1 x 10 ^ 5 lustrzanych komórek MS1 śródbłonka wysp trzustkowych w DMEM uzupełnionym 10% FBS i 100 jednostkami na mililitr penicyliny i streptomycyny na 0,1% pokrytej żelatyną płytce hodowlanej.

Po całonocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych umyj komórki PBS przed potraktowaniem dwoma mililitrami 0,25% roztworu trypsyny, 0,02% EDTA przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki zaczną się odłączać, wygasić reakcję pięcioma mililitrami kompletnej pożywki hodowlanej i przenieść powstałą zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania. Zawiesić osad w czterech mililitrach świeżego, kompletnego podłoża do liczenia.

I wysiewaj 1 X 10^3 komórki na centymetr sześcienny do nowego pojemnika do hodowli komórkowych. Po całonocnej hodowli potraktuj dwie studzienki pięcioma mikromolowymi inhibitorami kinazy receptora TGF-beta SB-431542 i dwiema studzienkami kontrolą rozpuszczalnika DMSO. I umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut.

Pod koniec inkubacji należy potraktować dwie studzienki kontrolą pojazdu i dwie studzienki TGF-beta 2. Po trzech dniach użyj odwróconego mikroskopu, aby zbadać morfologię komórek każdej grupy leczonej komórkami w obrazowaniu w jasnym polu. Aby ocenić zmiany markerów związanych z endMT za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, należy odłączyć komórki od odpowiedniej hodowli komórek MS1, jak pokazano.

I zasiej komórki w stężeniu komórek 1,9 X 10 ^ 3 na 0,1% pokrytych żelatyną 12-milimetrowych okrągłych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki. Po całonocnej hodowli potraktuj komórki jednym nanogramem mililitra TGF-beta 2 przez trzy dni. Pod koniec inkubacji przemyć komórki PBS i utrwalić poddane działaniu substancji kultury za pomocą 300 mikrolitrów 4% formaldehydu na studzienkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec utrwalania przemyć komórki trzykrotnie PBS, a następnie przepuścić komórki 300 mikrolitrami 0,1% Triton X-100 i PBS na studzienkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie w PBS i zablokuj komórki 3% BSA w PBS. Po 45 minutach w temperaturze pokojowej oznacz komórki pierwszorzędowymi przeciwciałami PECAM-1 i SM22-alfa przez 45 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przepłucz w PBS.

Po ostatnim przemyciu inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 45 minut w temperaturze pokojowej i przemyć komórki trzykrotnie PBS przed zamontowaniem komórek za pomocą pożywki montażowej uzupełnionej DAPI i szkiełka nakrywkowego. Następnie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i zobrazuj ekspresję markera komórkowego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej przy użyciu odpowiednich filtrów zgodnie ze standardowymi protokołami obrazowania. Po trzech dniach leczenia TGF-beta 2 śródbłonkowe komórki MS1 tracą swoją strukturę przypominającą bruk i różnicują się w wrzecionowate komórki mezenchymalne.

To różnicowanie indukowane przez TGF-beta 2 jest tłumione, gdy komórki są wystawione na działanie inhibitora kinazy receptora TGF-beta SB-431542. Ekspresja białka śródbłonka PECAM-1 jest znacznie zmniejszona po stymulacji TGF-beta 2, podczas gdy czynnik mezenchymalny SM-22 alfa jest głęboko regulowany w górę. Ponadto ślimak jest znacznie regulowany w górę przez ekspozycję na TGF-beta 2, podczas gdy ekspresja ślimaka nie jest zaburzona.

Jak zaobserwowano, edycja genów CRISPR-Cas9 może być wykorzystana do ułatwienia wprowadzenia dwóch niezależnych pojedynczych przewodnikowych RNA ślimaka do komórek MS1 eksprymujących Cas9 w celu zakłócenia ekspresji ślimaka. Nokaut ślimaka jest wystarczający do zahamowania morfologii komórek podobnych do fibroblastów napędzanej przez TGF-beta 2 w komórkach MS1 i do zablokowania spadku PECAM-1 za pośrednictwem TGF-beta 2 i wzmocnienia SM-22 alfa. Ocena zmian w morfologii komórek i ekspresji markerów śródbłonka i mezenchymalnych za pomocą immunofluorescencji może być dalej zwalidowana poprzez pomiar ekspresji tych markerów na ilościowym PCR w analizie Western blot.

Ta technika wykrywania przejścia od śródbłonka do mezenchymalnego pozwoliła naukowcom zbadać to pojawiające się znaczenie jako procesu fizjologicznego, który występuje w wielu chorobach.