Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta
12 lutego 2021
Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.
Jest to kompleksowe zaplecze protokołu, generowanie surowych wzmocnień i wykorzystanie specyficznych dla pacjenta kultur z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Ta taktyka jest powtarzalna i łatwa do naśladowania, szczególnie dla początkujących. I nie wymagaj, specjalnej ekspertyzy w balladach o komórkach macierzystych lub medycynie sercowo-naczyniowej.
Nasz protokół może być wykorzystany do generowania specyficznych dla pacjenta kardiomiocytów z pojedynczego pobrania krwi, które można wykorzystać do modelowania chorób sercowo-naczyniowych i testowania toksyczności sercowej nowych leków. Protokół ten wymaga długotrwałego zaangażowania w przeprogramowanie komórek macierzystych, utrzymanie i ukierunkowane różnicowanie. Jednak naprawdę doceniasz swoje starania.
Kiedy widzisz bijące kardiomiocyty w naczyniu. Gdy ludzkie kolonie iPSC osiągną ponad 90% konflufluacji, przepłucz każdą studzienkę trzema mililitrami DPBS, a następnie potraktuj komórki jednym mililitrem 0,5 milimolowego EDTA w DPBS na studzienkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu do ośmiu minutach dodaj jeden mililitr pożywki pasażowej iPSC do każdej studzienki i ręcznie usuń komórki.
Przenieś od 600 do 900 mikrolitrów komórek do poszczególnych studzienek: mają pokrytą membraną podstawną płytkę z sześcioma dołkami do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie odświeżaj kultury dwoma mililitrami kompletnej pożywki E8 codziennie przez trzy do czterech dni. Gdy kultura osiągnie zbieg, zastąp pożywkę dwoma mililitrami pożywki do różnicowania kardiomiocytów, po dwa na dołek.
W drugim dniu zastąp supernatanty dwoma mililitrami pożywki do różnicowania kardiomiocytów jeden. W trzecim dniu zastąp supernatanty dwoma mililitrami pożywki do różnicowania kardiomiocytów trzy. W piątym dniu.
Zastąp supernatant dwoma mililitrami pożywki do różnicowania kardiomiocytów. W dniach od siódmego do dziesiątego zastąp supernatant dwoma mililitrami pożywki do różnicowania kardiomiocytów cztery. W dniach 11 i 13.
Gdy obserwuje się kurczenie się komórek, zastąp supernatant dwoma mililitrami pożywki różnicującej kardiomiocyty pięć. W dniach 15, 17, 19 i 21. Zastąp supernatant dwoma mililitrami pożywki do różnicowania kardiomiocytów cztery.
Po wstępnej hodowli z pełną pożywką krwionośną w ciągu siedmiu dni, PBMC stają się duże z widocznymi jądrami i cytoplazmą, co wskazuje, że są gotowe do transfekcji z czynnikami przeprogramowującymi wirusa Sendai. Po wprowadzeniu do kompletnego podłoża E8. Całkowicie przeprogramowane komórki przyłączą się i zaczną tworzyć kolonie.
Po czterech do pięciu pasażach z przeprogramowanych komórek utworzą się wysoce czyste kolonie iPSC, w których zaobserwowano bardzo niewiele komórek zróżnicowanych. Na tym etapie większość komórek jest dodatnia w OCT4 i NANOG, co wskazuje na ich plurypotenię. Bicie kardiomiocytów obserwuje się zwykle po 12 dniach różnicowania.
Po głodzie glukozy i ponownym posiewie kardiomiocyty iPSC wykazują spontaniczne bicie i wyrównaną strukturę sarkomeru z interkalowaną ekspresją troponiny sercowej T i alfa aktyniny. Kolonie zachowują swoją czystość, o czym świadczy ekspresja troponiny T. Chociaż kardiomiocyty iPSC są stosunkowo niedojrzałe w porównaniu z kardiomiocytami dorosłych.
Wykazują komorowe i przedsionkowe potencjały czynnościowe mierzone za pomocą hurtowej łaty, zacisku. Kardiomiocyty komorowe wykazują ekspresję drugiego łańcucha lekkiego miozyny, podczas gdy kardiomiocyty przedsionkowe iPSC są oznaczone ekspresją NR2F2. Aktywacja Wnt stymuluje podział komórek i wspomaga ekspresję regulatorów cyklu komórkowego.
Co ciekawe, aktywacja Wnt indukuje również silną proliferację wczesnych kardiomiocytów iPSC przez dwa pasaże w porównaniu z grupą kontrolną, chociaż ta zdolność proliferacyjna zmniejsza się z czasem. Upewnij się, że PBMS są powiększone o czystą jądro i cytoplazmę przed wprowadzeniem wektorów przeprogramowania iPSC, ponieważ stan PBM ma kluczowe znaczenie dla przeprogramowania iPSC. Kardiomiocyty specyficzne dla pacjenta są cenne dla modelowania chorób sercowo-naczyniowych in vitro oraz dla dostarczania mnóstwa komórek dawcy do terapii komórkami macierzystymi serca.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia generowanie i ekspansję specyficznych dla pacjenta kardiomiocytów z mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Został on opracowany tak, aby był powtarzalny i dostępny dla badaczy, w szczególności dla osób początkujących.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kardiologia
- Biologia komórek macierzystych
Wstęp
- Kardiomiocyty są kluczowe dla badania chorób serca.
- Komórki specyficzne dla pacjenta mogą usprawnić modelowanie chorób.
- Mononuklearne komórki krwi obwodowej stanowią nieinwazyjne źródło materiału.
- Reprogramowanie komórek macierzystych wymaga starannej hodowli.
Cel badania
- Opracowanie protokołu generowania kardiomiocytów z próbek krwi.
- Umożliwienie modelowania chorób układu sercowo-naczyniowego.
- Testowanie kardiotoksyczności nowych leków.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie mononuklearnych komórek krwi obwodowej.
- Techniki przeprogramowania komórek macierzystych.
- Kierowana różnicowanie w kardiomiocyty.
- Protokoły długoterminowego utrzymywania hodowli.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie kardiomiocytów specyficznych dla pacjenta.
- Powtarzalność protokołu dla różnych próbek.
- Wykonalność procedury dla osób początkujących bez szerokiego doświadczenia.
- Potencjalne zastosowania w testowaniu leków i modelowaniu chorób.
Wnioski
- Niniejszy protokół oferuje praktyczne podejście dla badaczy.
- Wspiera on postępy w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Generowanie kardiomiocytów specyficznych dla pacjenta z mononuklearnych komórek krwi obwodowej umożliwia skalowalne i powtarzalne modelowanie chorób oraz testowanie kardiotoksyczności. Podejście to wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych i identyfikację związków wiodących poprzez dostarczenie systemów komórkowych istotnych dla człowieka. Pozwala ono na zmniejszenie zależności od modeli zwierzęcych i zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznych badaniach sercowo-naczyniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych przy użyciu kardiomiocytów pochodzących od pacjentów, które odzwierciedlają genetyczne podłoże choroby.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną ocenę kurczliwości i właściwości elektrofizjologicznych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych i mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku celów kardio-naczyniowych przed optymalizacją związku wiodącego.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymywanie skalowalnych populacji bijących kardiomiocytów, odpowiednich do wysokoprzepustowych analiz funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty, w tym przejściowe zmiany stężenia wapnia oraz czas trwania potencjału polowego, w celu przesiewania związków chemicznych.
- Gotowość testowa: Umożliwia stworzenie zestandaryzowanych platform opartych na monowarstwie, kompatybilnych z systemami automatycznego obrazowania i elektrofizjologii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje fenotypy kardiomiocytów komorowych i przedsionkowych człowieka na potrzeby badań nad mechanizmami istotnymi dla chorób.
- Wartość operacyjna: Wspiera długoterminową ekspansję z wykorzystaniem CHIR99021 w celu wygenerowania odpowiedniej liczby komórek do badań umożliwiających złożenie wniosku IND.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez zastosowanie spójnych, specyficznych dla pacjenta systemów komórkowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczną ocenę bezpieczeństwa.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez poprzez ukierunkowane różnicowanie iPSC w funkcjonalnie dojrzałe podtypy kardiomiocytów.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, elektrycznie aktywne kardiomiocyty do profilowania kanałów jonowych i kurczliwości.
- Analityka: Generuje dane dotyczące potencjału czynnościowego i gospodarki wapniowej w celu wsparcia porównawczej analizy związków.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność fenotypową od etapu pochodzenia iPSC, poprzez ich ekspansję i charakterystykę.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny, nieinwazyjny proces pozyskiwania komórek, który można zastosować w wielu programach kardiologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez zastosowanie istotnych dla ludzi, genetycznie dopasowanych modeli komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym protokołom różnicowania i ekspansji z użyciem małych cząsteczek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania ryzyka kardiotoksyczności.
- Wpływ na portfolio: Wspiera rozwój projektów z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez ograniczenie niepowodzeń translacyjnych w wskazaniach sercowo-naczyniowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, reprogramowaniu iPSC oraz różnicowaniu kardiocytarnym.
- Zależne od zdefiniowanych pożywek, małych cząsteczek (CHIR99021) oraz platform powlekanych macierzą zewnątrzkomórkową.
- Wymaga standaryzowanych procedur operacyjnych w zakresie pasażowania, czasu różnicowania oraz kontroli jakości.
- Wymaga monitorowania adaptacji podczas skalowania procesu dla różnych linii iPSC pochodzących od pacjentów.
- Ograniczone przez względną niedojrzałość kardiomiocytów pochodzących z iPSC w porównaniu z ich dorosłymi ludzkimi odpowiednikami.
