Name: Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj przesiewowe badanie fragmentów krystalograficznych w celu odkrywania leków przy użyciu krystalografii rentgenowskiej. Ta metoda pozwala identyfikować małe cząsteczki wiążące się z białkami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy licznym grupom użytkowników, które przeprowadziły kampanie CFS w HZB. Ich opinie doprowadziły do stopniowego ulepszania naszego przepływu pracy. Pragniemy podziękować grupie zajmującej się projektowaniem leków na Uniwersytecie w Marburgu oraz grupie FragMAX przy projekcie MAX IV, ponieważ ścisła współpraca była podstawą do kilku skoków rozwojowych w kierunku poprawy CFS. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Nauki (BMBF) za pośrednictwem projektów Frag2Xtal i Frag4Lead (numery 05K13M1 i 05K16M1). Jesteśmy również wdzięczni za wsparcie za pośrednictwem iNEXT-Discovery, projektu numer 871037, finansowanego z programu Horyzont 2020 Komisji Europejskiej.

1.Moczenie kryształów
<ol>
	<li>Weź płytkę sitową (tutaj, płytkę F2X-Entry Screen, <silna klasa="xfig">Rysunek 2) z zamrażarki -20 °C i umieść ją na ławce/stole na około 30 minut, aby wstępnie ogrzać ją do temperatury pokojowej, unikając w ten sposób wilgoci kondensacyjnej.</li>
	<li>Ułóż miejsce pracy z dwoma ściśle rozmieszczonymi mikroskopami i wszystkimi potrzebnymi narzędziami (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Materiały są wymienione w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Wybierz 3-4 pętle o odpowiedniej wielkości do transferu kryształów, które mają być nasączone i umieść je blisko mikroskopów.</li>
	<li>Napełnij wnęki szklanych płytek punktowych wodą dejonizowaną lub destylowaną.</li>
	<li>Przygotuj 5 ml roztworu do namaczania.</li>
	<li>Rozciąć worek z płytą sitową wstępnie podgrzaną do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Zdejmij pokrywkę i folię z płyty sitowej, trzymając talerz umieszczony na ławie/stole. </li>
	<li>Zdekantować 5 ml roztworu do namaczania w zbiorniku odczynnika.</li>
	<li>Napełnij każdy z 96 zbiorników 40 μl roztworu do namaczania za pomocą 12-kanałowej pipety.</li>
	<li>Umieść ramkę EasyAccess na górze płyty ekranującej i zabezpiecz ją za pomocą dołączonych zacisków, wsuwając je na lewą i prawą stronę urządzenia. 
	UWAGA: Ramka EasyAccess to specjalne urządzenie do obsługi wielu kryształów, które zostało opracowane w klasie HZB<sup="xref">14. Umożliwia łatwy dostęp do każdej studni poprzez przesunięcie ruchomych płytek, jednocześnie chroniąc pozostałe studnie przed parowaniem.</li>
	<li>Umieść płytkę przesiewową (wraz z ramką EasyAccess) pod pierwszym mikroskopem, a płytkę krystalizacyjną wraz z kryształami, które mają być nasączone pod drugim mikroskopem.</li>
	<li>Dobrze rozsuń A1 płyty ekranującej, przesuwając odpowiednią płytkę ze szkła akrylowego ramki EasyAccess palcem lub dołączonym narzędziem piórowym. </li>
	<li>Dodać 0,4 μl roztworu do namaczania ze zbiornika do fragmentu zawierającego studzienkę (lewa górna soczewka) za pomocą świeżej końcówki pipety. Sprawdź pod mikroskopem, czy kropla zakrywa zaschnięty fragment, aby mógł się rozpuścić. 
	UWAGA: Alternatywnie ten krok można wykonać za pomocą robota pipetującego przed montażem ramki EasyAccess. W ten sposób krople do namaczania ze wszystkich studzienek można było umieścić w jednej automatycznej procedurze. Jednak autorzy zalecają dodanie roztworu do namaczania bezpośrednio przed etapem namaczania, zgodnie z opisem, aby zapewnić, że fragment rozpuszcza się powoli i w obecności kryształu. Pozwala to uniknąć sytuacji, w której kryształ doświadcza nagłego wstrząsu po przeniesieniu do kropli o wysokim stężeniu fragmentów.</li>
	<li>Pod drugim mikroskopem rozciąć folię uszczelniającą płytki krystalizacyjnej w jednym z dołków, w którym znajdują się docelowe kryształy.</li>
	<li>Przenieś dwa kryształy za pomocą pętli o odpowiedniej wielkości zamontowanej na kryształowej różdżce do dołka A1 płytki przesiewowej pod pierwszym mikroskopem.</li>
	<li>Umyj pętlę w przygotowanej szklanej płytce punktowej i osusz ją, delikatnie dotykając chusteczki. Rób to po każdym przeniesieniu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego roztworami do namaczania zawierającymi fragmenty.</li>
	<li>Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy kryształy zostały prawidłowo umieszczone.</li>
	<li>Przejdź do następnego dołka (np. B1).</li>
	<li>Powtórz kroki 1.13-1.18 ze wszystkimi 96 dołkami płytki przesiewającej, aż każda kropla do namaczania będzie zawierała dwa kryształy.</li>
	<li>Wyjmij płytkę sitową (wraz z ramką EasyAccess) spod mikroskopu i umieść ją na ławce/stole.</li>
	<li>Zdejmij ramkę EasyAccess z płyty ekranującej.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę sitową folią uszczelniającą i umieścić ją odpowiednio w inkubatorze do krystalizacji lub szafce, w której hodowano kryształy.</li>
	<li>Inkubować przez optymalny czas namaczania. Nocleg jest zazwyczaj wygodny.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przygotowanie około 40 kryształów apo (tj. udawane moczenie)
	<ol>
		<li>Weź 3-soczewkową, 96-dołkową, niskoprofilową płytkę krystalizacyjną MRC i napełnij dwie kolumny 40 μl roztworu do namaczania na studzienkę za pomocą 12-kanałowej pipety.</li>
		<li>Umieść ramkę EasyAccess na płycie krystalizacyjnej i zabezpiecz ją dołączonymi zaciskami, wsuwając je na lewą i prawą stronę urządzenia.</li>
		<li>Otwórz płytkę ze szkła akrylowego studni A1.</li>
		<li>Umieść 0,4 μl roztworu do namaczania w każdej z dwóch lewych soczewek studzienki.</li>
		<li>Przenieś 2-3 kryształy do każdej kropli. Po każdym transferze umyj pętlę w przygotowanej szklanej płytce punktowej i wysusz, delikatnie dotykając chusteczki.</li>
		<li>Przejdź do następnego dołka (np. B1).</li>
		<li>Powtarzaj kroki 1.24.4-1.24.6, aż około 40 kryształów będzie gotowych do inkubacji.</li>
		<li>Wyjmij płytkę krystalizacyjną (wraz z ramką EasyAccess) spod mikroskopu na ławkę/stół i wyjmij ramkę EasyAccess.</li>
		<li>Uszczelnij płytkę krystalizacyjną folią uszczelniającą i umieść ją we wspomnianym wcześniej inkubatorze lub szafce do krystalizacji.</li>
		<li>Inkubować przez ten sam czas, co płytkę przesiewającą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.Zbieranie kryształów
<ol>
	<li>Wyjąć płytkę(-y) inkubacyjną(-e) odpowiednio z inkubatora lub szafki.</li>
	<li>Ułóż miejsce pracy za pomocą jednego mikroskopu i wszystkich potrzebnych narzędzi (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Materiały są wymienione w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Przygotuj piankę Unipuck dewar z 3 pokrywkami Unipuck (tj. obudowami próbki) i napełnij ją ciekłym azotem (LN2). 
	UWAGA: Przestrzegać odpowiednich środków ostrożności podczas pracy z LN2 (tj. nosić okulary ochronne i używać odpowiedniego sprzętu ochronnego). Najlepiej jest zaopatrzyć się w świeży LN2 kilka razy podczas sesji, aby uniknąć kondensacji wody w pojemniku LN2. Wykonując całą poniższą procedurę, upewnij się, że poziom LN2 w piance dewara zawsze sięga górnej krawędzi dewara. Upewnij się również, że LN2 jest wolny od lodu; często wymieniaj LN2 (np. raz na 45 minut) lub najpóźniej, jeśli zacznie gromadzić się lód. Następnie napełnij drugą piankę dewara i przenieś do niej Unipucks. Opróżnij lodowatą piankę dewara i usuń resztki lodu i wilgoci za pomocą suszarki.</li>
	<li>Zdejmij folię z płyty ekranującej i umieść ramkę EasyAccess na górze.</li>
	<li>Dobrze się rozsuń A1.</li>
	<li>Zbierz dwa kryształy z kropli i schładzaj je błyskawicznie w LN2 (jeden po drugim), zanurzając szybkim ruchem pionowym w LN2, a następnie wkładając próbkę w odpowiednią pozycję krążka. Zrób odpowiednie notatki na przykładowym arkuszu śledzenia.</li>
	<li>Etap krioochrony (jeśli to konieczne dla docelowych kryształów). W takim przypadku należy wykonać ten krok zamiast 2.6.
	<ol>
		<li>Umieść 0,4 μl roztworu do namaczania, w tym krio-ochronie, na lewej dolnej soczewce studzienki.</li>
		<li>Przeciągnij pętlę z kryształem zamontowanym od kropli w lewej górnej soczewce powoli przez roztwór w lewej dolnej soczewce, trzymając kryształ w pętli, a następnie ostudź błysk w LN2. Zbierz w ten sposób dwa kryształy. 
		UWAGA: W krokach 2.6 i 2.7 upewnij się, że czas, w którym kryształ znajduje się w pętli i jest wystawiony na działanie powietrza, jest bardzo krótki. Zanurzanie (tj. pionowy spadek próbki w dewarze wypełnionym LN2) powinno być wykonane tak szybko, jak to możliwe. Zapewnia to wysoką jakość próbki i zapobiega powstawaniu pierścieni lodowych w danych. Śledź próbki (tj. zwróć uwagę, czy kryształy mają uszkodzenia itp.), aby nadać priorytet duplikatom dla kolejnych pomiarów rentgenowskich, użyj do tego szablonu. Nawet jeśli kryształy mają pęknięcia, "włoski" lub inne wady spowodowane namaczaniem, nadal można ich używać i zawsze należy je zbierać. W przypadku, gdy kryształy rozpadły się na kilka kawałków, należy zebrać dwa z największych/najlepiej wyglądających kawałków. Rysunek 5 pokazuje kilka przykładów jak takie kryształy mogą wyglądać. Wszystkie pokazane kryształy dostarczyły nadal użytecznych zestawów danych w odpowiedniej kampanii11, podkreślając, że warto zbierać kryształy po namoczeniu, nawet jeśli wystąpiły znaczne zmiany morfologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do następnej studzienki i powtarzaj kroki 2.5 - 2.6./2.7, aż wszystkie trzy krążki zostaną wypełnione.</li>
	<li>Dodaj podstawy Unipuck na wierzch pokrywek po wstępnym schłodzeniu ich w LN2.</li>
	<li>Przechowuj Unipucks na regałach magazynowych w dewarze transportowym lub magazynowym dewar.</li>
	<li>Powtarzaj poprzednie kroki, aż wszystkie studzienki płyty sitowej zostaną przetworzone.</li>
	<li>(opcjonalnie) Jeśli przygotowano sztucznie nasączone kryształy, zbierz je w podobny sposób, jak opisano wcześniej. 
	UWAGA: Jeśli dwa kryształy dla każdego z 96 warunków płytki przesiewającej mogą być chłodzone błyskawicznie, będzie miejsce na 32 makietowane kryształy apo, aby wypełnić 14 Unipucks.</li>
	<li>Przechowuj Unipucks w LN2 do czasu pomiaru.</li>
</ol>
3.Gromadzenie danych 
<ol>
	<li>Przenieś Unipucks na linię BL14.1. Jeśli w kroku 2 użyto krążków SPINE, przenieś je do linii BL14.2.</li>
	<li>Wykonaj standardowe pomiary na linii badawczej, korzystając ze szczegółowych zaleceń podanych poniżej. Szczegóły dotyczące obiektu i programu sterującego eksperymentem MXCuBE2 zostały przedstawione wcześniej15,16. Rysunek 4 pokazuje wnętrze eksperymentalnych budek linii BL14.1 i BL14.2, a także przykładowy zrzut ekranu oprogramowania sterującego MXCuBE2 na linii BL14.1.
	<ol>
		<li>Aby zmaksymalizować oszczędność czasu i przepływność, pomiń zbieranie obrazów testowych. Odległość od próbki do detektora zostanie ustalona na wartość, która jest odpowiednia dla górnej granicy rozdzielczości układu kryształów wyznaczonej we wcześniejszych eksperymentach. Jeśli strategia zbierania danych nie została wcześniej zoptymalizowana, zbierz 1800 obrazów o kącie 0,2 stopnia każde z czasem naświetlania 0,1 s na obraz. </li>
		<li>Najlepiej przetestować strategię zbierania danych we wcześniejszych eksperymentach przy użyciu nasączonych makietą kryształów apo. W przypadku grup przestrzeni o wyższej symetrii 1200 obrazów lub nawet 900 obrazów (tj. odpowiednio 240° lub 180°) da już kompletne zestawy danych z dobrymi statystykami, niezależnie od kąta początkowego zbierania danych. 
		UWAGA: Wyższa redundancja i dokładniejsze cięcie mogą zapewnić lepszą jakość danych17. Jednak zastosowanie tej zaproponowanej tutaj strategii "wystarczająco, ale nie więcej" jest doskonałym kompromisem między jakością, czasem zbierania danych, a także wymaganiami obliczeniowymi do późniejszej analizy. W opisany sposób możliwe jest zebranie 200 danych w ciągu 24 godzin na liniach BL14.1 i BL14.2. Niemniej jednak próbki powinny być traktowane priorytetowo.</li>
		<li>Najpierw zbierz zestawy danych dyfrakcyjnych dla jednej próbki na warunek fragmentu, w oparciu o priorytetyzację w kroku 2.6./2.7 (tj. zbierz dane dla duplikatu o wyższym priorytecie).</li>
		<li>Dla tych doświadczeń, o których mowa w ppkt 3.2.3, w których zbieranie danych nie powiodło się, utracono dyfrakcję lub wystąpiły poważne pierścienie lodowe, należy zebrać dane dla drugiej zduplikowanej próbki odpowiedniego stanu fragmentu.</li>
		<li>Zbierz zestawy danych dyfrakcyjnych kryształów apo (jeśli zostały przygotowane zgodnie z krokami 1.24 i 2.12).</li>
		<li>Zbierz zestawy danych dyfrakcyjnych pozostałych duplikatów każdego warunku fragmentu. </li>
		<li>W programie MXCuBE2 dopasuj identyfikatory zbiorów danych kampanii CFS do następującego wzorca: <biblioteka>-<>-[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (np. MyProtein-F2XEntry-B05a, gdzie "B05" oznacza studnię (tj. stan fragmentu na ekranie), a następujące po nim "a" oznacza pierwszy duplikat).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4.Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Do analizy danych kampanii CFS użyj FragMAXapp, internetowego rozwiązania do sterowania analizą multipleksową w celu przetwarzania automatycznego udoskonalania i oceny trafień PanDDA danych CFS18 (et al. FragMAXapp, dane niepublikowane). W wersji FragMAXapp wdrożonej w HZB dostępne są następujące programy/potoki: XDSAPP19, Xia2-DIALS i Xia2-XDS20, fspipeline7, DIMPLE21, Phenix LigFit22, PanDDA13,23. Użyj dobrze dopracowanego modelu wejściowego białka docelowego jako danych wejściowych do automatycznego udoskonalania; W przeciwnym razie dokonaj skrupulatnego dopracowania jednego makiety kryształu w wysokiej rozdzielczości, który został zebrany podczas kampanii. 
	UWAGA: Kluczowym elementem identyfikacji trafień jest PanDDA. Szczegóły są wyjaśnione w odpowiednich publikacjach13,23. Krótko mówiąc, PanDDA automatycznie oblicza mapy gęstości elektronowej zestawu zestawów danych w kampanii CFS. Są one następnie przyjmowane jako niewiążące warunki fragmentów i uśredniane w celu wygenerowania tak zwanego modelu stanu podstawowego. Model stanu podstawowego jest następnie używany do wyprowadzenia lokalnych rozbieżności między każdą mapą gęstości elektronów a mapą stanu podstawowego, przy użyciu wskaźników Z związanych z wokselami. Następnie, dla obszarów o wysokich wynikach Z, tworzona jest tak zwana mapa PanDDA poprzez precyzyjne odejmowanie gęstości stanu podstawowego od odpowiedniej mapy. To znacznie zwiększa widoczność zdarzeń wiązania fragmentów.</li>
	<li>Aby zmaksymalizować wynik PanDDA, należy zastosować podejście dwuetapowe. Po pierwsze, wykonanie uruchomienia PanDDA (pandda.analyse) ze standardowymi ustawieniami. Nawet jeśli zebrano makiety kryształów, ich tożsamość nie zostanie uwzględniona jako parametr (co jest jednak możliwe), aby umożliwić bezstronne wygenerowanie modelu stanu podstawowego przez PanDDA na podstawie wszystkich dostępnych danych. Następnie dane wyjściowe są oceniane przez użytkownika za pomocą tzw. inspekcji PanDDA w Coot24. W tym miejscu należy odnotować trafienia ze stosunkowo dużą pewnością, kończąc pierwszy krok.</li>
	<li>Po drugie, uruchom ponownie krok pandda.analyse z wyłączeniem wstępnych trafień (określonych w pierwszym kroku) z modelu stanu podstawowego za pomocą opcji wiersza poleceń --exclude_from_characterisation="<list-of-bound-dataset-ids>". Więcej szczegółów można znaleźć na stronach pomocy PanDDA (https://pandda.bitbucket.io/). W ten sposób zestawy danych, które są wyraźnymi trafieniami, a zatem zasłaniałyby model stanu podstawowego, gdyby zostały uwzględnione, są ignorowane. Prowadzi to do ulepszenia modelu stanu podstawowego, a tym samym do poprawy ogólnych wyników. Na koniec przeprowadzana jest dokładna inspekcja PanDDA w celu zakończenia identyfikacji trafień. 
	UWAGA: FragMAXapp zawiera również opcję wyjściową do zapisywania modelowanych stanów powiązanych lub przygotowania danych do przesłania PDB, więcej szczegółów na stronach FragMAX (https://fragmax.github.io/).</li>
</ol>

<ol><li>Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+years+on%3A+the+impact+of+fragments+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).</li>
<li>Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+exploration+of+chemical+space+by+fragment-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).</li>
<li>Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+fragment-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Introduction to fragment-based drug discovery.</a> Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).</li>
<li>Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment-based+approaches+in+drug+discovery+and+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology.</a> Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).</li>
<li>Lamoree, B., Hubbard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+in+fragment-based+lead+discovery+%28FBLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD).</a> Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).</li>
<li>Schiebel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+Biophysical+Screening+Methods+Miss+a+Large+Proportion+of+Crystallographically+Discovered+Fragment+Hits%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study.</a> ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).</li>
<li>Schiebel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Crystallography%3A+Reliable+and+Efficient+Identification+of+Fragment+Hits%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits.</a> Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).</li>
<li>Krojer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+XChemExplorer+graphical+workflow+tool+for+routine+or+large-scale+protein-ligand+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).</li>
<li>Radeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Site+Mapping+of+an+Aspartic+Protease+by+Multiple+Fragment+Crystal+Structures%3A+Versatile+Warheads+to+Address+a+Catalytic+Dyad%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).</li>
<li>Cox, O. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP%282%29%2C+an+atypical+bromodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).</li>
<li>Wollenhaupt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F2X-Universal+and+F2X-Entry%3A+Structurally+Diverse+Compound+Libraries+for+Crystallographic+Fragment+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening.</a> Structure. 28 (6), 694-706 (2020).</li>
<li>EU OPENSCREEN fragment library. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html">https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html</a> (2020).</li>
<li>Pearce, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-crystal+method+for+extracting+obscured+crystallographic+states+from+conventionally+uninterpretable+electron+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density.</a> Nature Communications. 8, 15123(2017).</li>
<li>Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitated+crystal+handling+using+a+simple+device+for+evaporation+reduction+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates.</a> Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).</li>
<li>Mueller, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macromolecular+crystallography+beamlines+at+BESSY+II+of+the+Helmholtz-Zentrum+Berlin%3A+Current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+Plus%22%5BJournal%5D)">The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives.</a> The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141(2015).</li>
<li>Oscarsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MXCuBE2%3A+The+dawn+of+MXCuBE+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).</li>
<li>Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+fine+%CF%86-slicing+for+single-photon-counting+pixel+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).</li>
<li>Lima, G. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FragMAX%3A+The+fragment-screening+platform+at+the+MAX+IV+Laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).</li>
<li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDSAPP2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li>
<li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((xia2%3A+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).</li>
<li>Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+ligand+fitting+by+core-fragment+fitting+and+extension+into+density%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).</li>
<li>Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+modelling+of+ligand+binding+requires+an+ensemble+of+bound+and+unbound+states%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).</li>
<li>Collins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+Eleven+-+Achieving+a+Good+Crystal+System+for+Crystallographic+X-Ray+Fragment+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Chapter Eleven - Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening.</a> Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASSIF-1%3A+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li>
<li>Cuttitta, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+transfer+of+protein+crystals+from+agarose+pedestals+to+micromeshes+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).</li>
<li>Moreno-Chicano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+structures+of+protein-ligand+complexes+at+room+temperature+using+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).</li>
</ol>

Zgłoszenie patentowe dotyczące ramki EasyAccess zostało złożone przez Helmholtz-Zentrum Berlin w Niemieckim Urzędzie Patentów i Znaków Towarowych pod numerem rejestracyjnym DE 10 2018 111 478.8. Dodatkowo złożono międzynarodowe zgłoszenie patentowe w ramach procedury PCT, korzystając z pierwszeństwa patentu niemieckiego.

Aby kampania CFS zakończyła się sukcesem, konieczne jest przestrzeganie opisanych warunków wstępnych (patrz Wprowadzenie). Niezawodny system krystalizacji jest potrzebny do powtarzalnego wzrostu wielu dobrze dyfrakcyjnych kryształów, a dobrze wyrafinowana struktura jest potrzebna jako wejściowy model apo do automatycznego udoskonalania. Ważne jest również, aby sprawdzić, czy miejsce docelowe na białku (miejsce aktywne lub obszar interfejsu) jest dostępne dla fragmentów sieci krystalicznej. Bardzo ważne jest, aby wcześniej zoptymalizować warunki namaczania, aby upewnić się, że namaczanie nie pogorszy znacząco jakości kryształów. Zaniedbanie tych aspektów z dużym prawdopodobieństwem doprowadzi do nieoptymalnego eksperymentu, który będzie miał ograniczone zastosowanie i w najgorszym przypadku będzie wymagał powtórzenia całego eksperymentu.
Opisany powyżej protokół przedstawia procedury, które są przestrzegane podczas standardowej kampanii CFS. Jeśli wszystkie warunki wstępne są spełnione, co najmniej 90% wszystkich nasączonych kryształów powinno wykazywać dyfrakcję w wysokiej rozdzielczości w eksperymencie dyfrakcyjnym. Jeśli tak nie jest, czas namaczania może zostać skrócony do kilku godzin, a nawet minut. Ze względu na dobrą rozpuszczalność większości fragmentów, powinno to wystarczyć do uzyskania przyzwoitych wartości zajętości. Ponadto typowa kampania CFS spowoduje wskaźnik trafień na poziomie około 10% lub wyższym. W przypadku kampanii walidacyjnych F2X-Entry Screen11 i trwających kampanii użytkowników z tą samą biblioteką zaobserwowano jeszcze wyższe wskaźniki trafień (20% i więcej, dane nie są pokazane).
Ogólnym zastrzeżeniem dotyczącym przesiewowych fragmentów krystalograficznych jest obecność krystalograficznych miejsc kontaktowych. Mogą one albo zasłaniać a priori znane miejsca aktywne (do sprawdzenia przed badaniem przesiewowym, patrz wyżej), albo te miejsca kontaktowe często zapewniają również kieszenie i gorące punkty, w których mogą wiązać się fragmenty. Takie uderzenia fragmentów będą artefaktami sieci krystalizacyjnej i prawdopodobnie nie będą wiązać się z białkiem w roztworze. Zdarzenia te występują częściej w eksperymentach z namaczaniem niż w eksperymentach z kokrystalizacją (prawdopodobnie ze względu na wyższe stężenia fragmentów stosowane w eksperymentach z namaczaniem). Jednak, jak wynika z wcześniejszych doświadczeń, stanowią one na ogół jedynie niewielką część uzyskiwanych trafień. Na przykład w kampanii walidacyjnej F2X-Entry Screen z użyciem endotiapepsyny (EP) i spliceosomalnego kompleksu białkowo-białkowego Prp8RNaseH i Aar2 (AR), większość trafień wystąpiła w obiecujących miejscach11. W przypadku EP 27 z 37 zaobserwowanych zdarzeń wiązania było zlokalizowanych w miejscu aktywnym (tj. w szczelinie peptydowej tej proteazy). 10 zdalnych zdarzeń wiązania składa się z dwóch zdarzeń wiązania wystawionych na działanie rozpuszczalnika i ośmiu zdarzeń wiązania kontaktowego kryształu (odpowiadających pięciu unikalnym trafieniom). Wykluczenie tych trafień z kryształowym kontaktem nadal odzwierciedlałoby ogólny wskaźnik unikalnych trafień na poziomie 24% w kampanii EP. Ważne jest również, aby zauważyć, że zdarzenia wiązania odległe od znanego miejsca aktywnego (z wyjątkiem krystalicznych spoiw kontaktowych) mogą być również potencjalnie interesujące (np. ujawniając nowe gorące punkty lub miejsca allosteryczne białka). W przypadku kampanii AR (w tej samej publikacji), spośród 23 zaobserwowanych zdarzeń wiązania, siedem było zlokalizowanych w kontaktach kryształów, jedno było zlokalizowane na bezpośrednim granicy dwóch białek, siedem było zlokalizowanych w znanych miejscach interakcji białko-białko z innymi partnerami wiążącymi w szerszym kontekście biologicznym (stąd różne etapy składania spliceosomu), osiem zdarzeń wiązania ujawniło dwa gorące punkty na AR o nieznanej jeszcze funkcji, a jedno było w rozpuszczalniku wystawionym na działanie rozpuszczalnika powierzchniPrp8 RnaseH. W związku z tym, wyłączając zdarzenia na stykach kryształowych i singletoniePrp8 RnaseH , liczba potencjalnie użytecznych zdarzeń wiązania wynosi 15 (co odpowiada 14 unikalnym trafieniom), co daje współczynnik trafień wynoszący 15,6%. Trafienia te mogą być punktem wyjścia do projektowania modulatorów interakcji białko-białko lub dla związków narzędziowych mających na celu zbadanie dwóch odkrytych gorących punktów Aar2. Podsumowując, również w zgodzie z prowadzonymi kampaniami użytkowników, często tylko niewielka część trafień w badaniu fragmentów krystalograficznych musi zostać pominięta jako artefakty. Będzie to jednak również w dużej mierze zależne od celu.
Jeśli wskaźnik trafień jest znacznie niższy, może to wskazywać na jeden z następujących problemów związanych z białkiem docelowym. Na przykład w kampanii CFS przeciwko wirusowej proteazie cysteinowej zaobserwowano wskaźnik trafień wynoszący tylko 3% (dane nie pokazane). Okazało się, że użyte białko było prawdopodobnie chemicznie zmodyfikowane w swoim miejscu aktywnym. W takim przypadku inny preparat białkowy może rozwiązać problem. Jeśli kryształy są bardzo nietolerancyjne DMSO, ekran F2X-Entry może być również używany bez DMSO, chociaż wyniki mogą się w pewnym stopniu różnić. Większość trafień uzyskanych w obecności DMSO pojawi się również pod jego nieobecność. Pojawią się również trafienia, których nie można zaobserwować przy braku DMSO, mimo że można je zaobserwować w jego obecności. I wreszcie, będą takie, które pojawią się tylko pod nieobecność DMSO.
Najpoważniejsza trudność występuje, gdy białko ulega indukowanemu ruchowi drgawkowemu po związaniu substancji. Najprawdopodobniej sieć krystaliczna nie będzie tolerować ruchu białka, a kryształy rozpadną się. W takim przypadku jedynym wyjściem jest ucieczka się do kokrystalizacji białka i fragmentów. Może to jednak prowadzić do powstania nowych form krystalicznych. W związku z tym duża część automatyzacji całego procesu nie będzie już działać wydajnie. Na szczęście w większości dotychczasowych kampanii CFS prowadzonych w HZB nie spotkano się z tego typu problemem. Może się zdarzyć, że słabe wiązanie fragmentu nie zapewnia wystarczającej ilości energii, aby wywołać ruch białka, w szczególności jeśli skrystalizowana konformacja jest stabilizowana przez siły upakowania kryształów.
Innym poważnym ograniczeniem metody, z którym autorzy zetknęli się do tej pory, jest sytuacja, w której koktajl krystalizacyjny (a więc roztwór do namaczania) zawiera związki lotne. Wtedy prawie niemożliwe staje się wykonanie całej obsługi kryształów w sensowny sposób.
Różne białka mogą w mniejszym lub większym stopniu zawierać miejsca podatne na działanie leków. Na przykład w interakcjach białko-białko zwykle pośredniczą rozszerzone płaskie powierzchnie, które są trudniejsze do celu. Szybkość wiązania fragmentów będzie zatem prawdopodobnie zależeć od struktury powierzchni molekularnej białka. W skrajnym przypadku białko może nie zawierać żadnych odpowiednich gorących punktów na powierzchni, które służą jako miejsca docelowe do wiązania fragmentów. Tym samym, mimo skrupulatnie przeprowadzonego eksperymentu, z seansu nie wynikną żadne trafienia fragmentów. Autorzy jednak do tej pory nie spotkali się z taką sytuacją.
Zasadniczo, korzystając z protokołu opisanego powyżej, nasączanie i zbieranie kryształów w ramach kampanii CFS można przeprowadzić w dowolnym laboratorium, które jest wyposażone do obróbki kryształów. To odróżnia metodologię w HZB od innych obiektów CFS i może być zaletą w niektórych przypadkach. Na przykład, jeśli kryształy nie mogą być łatwo ponownie wyprodukowane w innym miejscu lub jeśli podróżowanie eksperymentatorów jest ograniczone (np. w sytuacji pandemii na całym świecie), użytkownicy HZB otrzymują cały sprzęt (krążki, narzędzia, ramkę EasyAccess, uchwyty na próbki itp.) jako zestaw przenośny.
Jednak wymagania dotyczące dużej liczby pojemników na próbki i pojemności przechowywania kriogenicznego są nadal wygodniej spełniane w dedykowanych obiektach CFS. Co więcej, potrzeba gromadzenia wielu zestawów danych dyfrakcyjnych zdecydowanie przemawia za lokalizacją tych obiektów w pobliżu linii badawczych, które są nastawione na wysoką przepustowość próbek. Przykładami są linie badawcze I04-1 w Diamond Light Source i powiązanym obiekcie XChem w Wielkiej Brytanii 8,25, linie badawcze MASSIF w ESRF we Francji26 lub obiekt FragMAX w linii badawczej BioMAX w MAX IV w Szwecji18.
W przyszłości można sobie wyobrazić projektowanie eksperymentów CFS bez konieczności całkowitego obchodzenia się z kryształami. Odnotowano pierwsze postępy w tym kierunku. Na przykład poprzez akustyczny transfer cieczy umożliwiający mieszanie zarówno roztworów zawierających kryształy, jak i roztworów fragmentów bezpośrednio na siatkowych uchwytach na próbki27. Inne podejście zastosowano do badań przesiewowych ligandów opartych na XFEL. W eksperymencie potwierdzającym słuszność zasady przygotowano zawiesinę krystaliczną w partii, a dane dotyczące namaczania i dyfrakcji przeprowadzono na krzemowym układzie docelowym28. Podejścia te są jednak nadal w fazie rozwoju i są dalekie od zastosowania do szerokiego zakresu docelowych białek lub ich rutynowego stosowania w obiektach CFS.
Wraz z protokołem w tej pracy nakreślono szczegółowe instrukcje, jak skutecznie przeprowadzić kampanie CFS w prosty sposób w HZB (i gdzie indziej), a także podano ogólne wskazówki i przydatne praktyczne wskazówki dotyczące przygotowywania i przeprowadzania takich eksperymentów z większymi szansami na sukces. Ostatecznie, lepsze szanse i wskaźniki sukcesu w badaniach przesiewowych CFS w dużej mierze przyczyniają się do skutecznego zapewnienia punktów wyjścia do dalszego rozwoju związków narzędziowych lub kandydatów na leki.

Pierwszym krokiem w rozwoju leku jest badanie przesiewowe związków pod kątem interesującego celu. Tradycyjnie, duże biblioteki związków rzędu 100 000-1 000 000 wpisów są używane w wysokoprzepustowych testach biochemicznych w przemyśle farmaceutycznym. Strategia ta została uzupełniona o projektowanie leków oparte na fragmentach (FBDD), nowszą metodę, która gwałtownie wzrosła w ciągu ostatnich 20 lat i stała się główną strategią generowania wysokiej jakości potencjalnych kandydatów ze względu na kilka nieodłącznych zalet metody1. Termin "fragment" odnosi się do małej cząsteczki organicznej zawierającej zwykle mniej niż 20 atomów niewodorowych lub ciężkich (HA). W związku z tym fragment jest znacznie mniejszy niż cząsteczki podobne do leku lub ołowiu (zwykle mniej niż 30 HA) badane w konwencjonalnych badaniach przesiewowych o wysokiej przepustowości. Fragmenty są spoiwami o słabym powinowactwie. Jednak w porównaniu z większymi cząsteczkami, fragmenty są bardziej wszechstronne, ponieważ nawet niewielka ich kolekcja może lepiej reprezentować odpowiednią przestrzeń chemiczną cząsteczek o tym samym rozmiarze2. Ponadto, ewolucja przesiewania fragmentów w cząsteczkach ołowiu jest znacznie bardziej efektywna niż optymalizacja już większych cząsteczek2,3,4,5. Oznacza to, że w oczekiwaniu na wystarczającą czułość detekcji, badania przesiewowe fragmentów mogą być skutecznie stosowane i dostarczają wysokiej jakości punktów wyjścia do dalszej ewolucji związków. Do badań przesiewowych fragmentów można zastosować kilka metod biofizycznych, z których najpopularniejsze to magnetyczny rezonans jądrowy, krystalografia rentgenowska, powierzchniowy rezonans plazmonowy i testy przesunięcia termicznego. Metody te są stosowane równolegle lub sekwencyjnie, w celu zwiększenia wiarygodności trafień i zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych. Jednak niedawno przeprowadzone badanie porównawcze 6 zasugerowało, że należy unikać kaskadowych sekwencyjnych badań przesiewowych ze względu na niewielkie nakładanie się różnych metod.
Krystalografia rentgenowska jest dobrze znaną metodą określania struktury w szczegółach atomowych, ale ostatnio została również opracowana jako narzędzie do celów przesiewowych7,8. Ponieważ kryształy białek tolerują wysokie stężenia fragmentów (np. 100 mM), krystalograficzne badanie przesiewowe fragmentów (CFS) może konkurować z innymi metodami biofizycznymi w zakresie badań przesiewowych fragmentów, a nawet przewyższać je jako metoda przesiewowa pierwszego kroku6,9. Jednak niezbędnym warunkiem wstępnym dla CFS jest zwalidowany system krystalizacji białka docelowego, który w powtarzalny sposób dostarcza kryształy o właściwościach dyfrakcyjnych do znacznie wysokiej rozdzielczości, zwykle lepszej niż 2 A.
Wyłączną zaletą CFS w porównaniu do wszystkich innych metodologii badania przesiewowego fragmentów jest dostarczanie szczegółowych informacji 3D na temat sposobu wiązania zidentyfikowanych fragmentów. Ta informacja strukturalna jest absolutnie kluczowa dla racjonalnej optymalizacji uderzeń fragmentów w spoiwa o wyższym powinowactwie. Ugruntowane strategie opracowywania to rozwijanie, scalanie i łączenie trafień fragmentów5. W ten sposób od samego początku zapewniona jest stosunkowo wysoka wydajność ligandów i można uniknąć wprowadzania niepotrzebnych lub przestrzennie nieodpowiednich grup, zmniejszając w ten sposób koszty syntezy chemicznej. Podsumowując, CFS ma niezrównane zalety jako strategia wyjściowa dla projektowania leków.
Biorąc pod uwagę, że konkretny cel biologiczny spełnia wysokie wymagania CFS dotyczące jakości kryształów, istnieją pewne główne czynniki, które maksymalizują szanse na pomyślny wynik takich kampanii przesiewowych. Zależy to od jakości użytej biblioteki fragmentów, od efektywnego przepływu pracy do przeprowadzenia eksperymentów przed eksperymentem dyfrakcyjnym, na synchrotronowych liniach badawczych o wystarczającej szybkości automatyzacji i gromadzenia danych, a także na sposobach i środkach do w dużej mierze zautomatyzowanego przetwarzania i analizy danych. W tym miejscu przedstawiono pełny przebieg procesu od eksperymentów z namaczaniem kryształów do identyfikacji trafienia, w sposób, w jaki został on z powodzeniem ustalony na liniach badawczych krystalografii makromolekularnej w BESSY II (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Obiekt jest otwarty na współpracę dla użytkowników akademickich i przemysłowych. Ponadto użytkownicy akademiccy z krajów UE poza granicami Niemiec mogą bezpośrednio ubiegać się o dofinansowanie w ramach projektu iNEXT Discovery.
Istnieją niezbędne warunki wstępne, aby móc rozpocząć kampanię CFS i przeprowadzić protokół opisany w tej pracy: dostępne są dobrze dyfrakcyjne kryształy docelowego białka, które mogą być odtwarzalnie hodowane w dużych ilościach, które są stabilne w temperaturze otoczenia, i które zostały wyhodowane przy użyciu koktajlu krystalizacyjnego bez wysoce lotnych składników. Kolejnym warunkiem wstępnym jest przydatność sieci krystalicznej do eksperymentu. W odpowiedniej sieci interesujące miejsca białka docelowego muszą być wystawione w kierunku kanałów rozpuszczalnika, a tym samym dostępne. Kolejnym poprzedzającym krokiem, który jest opcjonalny, ale mimo to wysoce zalecany, aby zapewnić sukces w przebiegu kampanii CFS, jest optymalizacja warunków namaczania dla eksperymentu. Istotnymi statystykami porównawczymi są tutaj moc dyfrakcyjna kryształu i odpowiednie wskaźniki jakości danych, które są określane podczas procedury skalowania danych. Typowymi czynnikami do optymalizacji są tolerancja DMSO, stężenie buforu i krioprotektor. Chociaż nie jest to ścisły warunek wstępny, jak opisano poniżej, DMSO jako współrozpuszczalnik może pomóc w zwiększeniu rozpuszczalności fragmentów. Typowe testy powinny obejmować namaczanie 0, 3, 6 lub 10% (v/v) DMSO przez noc. Zwiększenie stężenia buforu do 200 lub 300 mM pomaga zapobiec utracie jakości dyfrakcji spowodowanej sporadycznymi efektami zmian pH wynikającymi z wysokich stężeń fragmentów, które mają być stosowane. Na koniec decydujące znaczenie ma ustalenie, czy i jaki dodatkowy krioprotektant jest wymagany i czy można go już włączyć do stanu namaczania. W wielu przypadkach jednak dodatkowa krioprotektorant nie jest potrzebny, ponieważ sam DMSO może działać jako krioprotektorant. Jeśli tak, zaoszczędzi to jeden krok obsługi w końcowym eksperymencie. Większość kryształów potrzebuje mniej krioprotektora, jeśli są chłodzone błyskawicznie na pętlach o odpowiedniej wielkości, minimalizując lub unikając otaczającego ługu macierzystego w jak największym stopniu. Jednak w rzadkich przypadkach warstwa ługu macierzystego jest rzeczywiście konieczna, aby zapobiec uszkodzeniu kryształu po błyskawicznym chłodzeniu.
Liczba trafień uzyskanych w kampanii CFS zależy nie tylko od lekowości docelowego białka i przydatności sieci krystalicznej (patrz wyżej), ale jest również zależna od jakości biblioteki. Jakość biblioteki obejmuje dwa aspekty: wybór związków do biblioteki i konfekcjonowanie związków (tj. w jakiej formie fizycznej są one prezentowane do eksperymentu). Do selekcji związków można zastosować różne strategie. Większość projektów bibliotecznych zakłada maksymalizację różnorodności chemicznej fragmentów. Strategicznym celem może być uwzględnienie właściwości chemicznej fragmentów w celu dalszego projektowania, co zostało zastosowane na przykład w bibliotece Diamond-SGC-iNEXT poised library10. Jeszcze innym strategicznym celem projektowania bibliotek może być maksymalizacja reprezentacji dostępnej na rynku przestrzeni chemicznej fragmentów poprzez grupowanie oparte na kształcie i farmakoforze, czego przykładem są biblioteki F2X opracowane w HZB11. Dokładniej rzecz ujmując, opracowano 1103-członkowską bibliotekę F2X-Universal Library i reprezentujący 96-złożony podzbiór dla początkowych kampanii CFS, który nazywa się F2X-Entry Screen, a F2X-Entry Screen został pomyślnie zweryfikowany11. Ekran wejściowy F2X jest podstawowym wyborem dla kampanii CFS w HZB. Następnie, większe kampanie mogą być realizowane za pomocą F2X-Universal Library lub biblioteki fragmentów EU-OPENSCREEN z 1056 członkami12, która jest również oferowana w HZB. Obecnie biblioteki te są dostępne bezpłatnie dla użytkowników linii badawczych krystalografii makromolekularnej synchrotronu BESSY II w Berlinie na podstawie umowy o współpracy. Dotyczy to również użytkowników korzystających z propozycji iNEXT Discovery. Co więcej, F2X-Entry Screen jest dostępny dla wszystkich zainteresowanych naukowców na podstawie umowy o transferze materiałów.
Jeśli chodzi o fizyczną prezentację biblioteki, powszechnie przyjmuje się dwa podejścia: fragmenty są albo używane jako roztwory podstawowe DMSO, albo fragmenty są suszone i unieruchamiane na gotowych do użycia płytkach. W HZB zarówno F2X-Entry Screen, jak i nielotne związki z biblioteki F2X-Universal są prezentowane jako wysuszone związki w 3-soczewkowej 96-dołkowej niskoprofilowej płytce krystalizacyjnej MRC. Prezentacja fragmentów unieruchomionych na płytkach krystalizacyjnych ma dwie zasadnicze zalety: Po pierwsze, umożliwia transport płytek sitowych do domowego laboratorium użytkownika. W związku z tym przedstawione tutaj etapy namaczania i obróbki kryształów w ramach przepływu pracy (kroki 1-3) można przeprowadzić w dowolnym miejscu. Po drugie, można zastosować rozwiązanie wolne od DMSO. Dzięki temu cele wrażliwe na DMSO mogą być łatwo przesiewane, w dużej mierze zachowując oczekiwane współczynniki trafień11. Jednak DMSO zwiększa rozpuszczalność fragmentów, dlatego warto wcześniej sprawdzić tolerancję DMSO wybranego układu kryształów, jak opisano powyżej.
Protokół opisany poniżej opisuje typowy eksperyment z 96-złożonym ekranem, takim jak F2X-Entry Screen. W tym celu należy przygotować na czas około 250 kryształów, które będą mogły być użyte na świeżo. Zdecydowanie zaleca się przygotowanie namoczeń dla wszystkich 96 związków w dwóch egzemplarzach. Zalecane, ale opcjonalne, jest przygotowanie dodatkowych próbnych próbek, które później pomogą w analizie danych przy użyciu podejścia PanDDA (PanDDA) do identyfikacji trafień13. Próbne moczenie definiuje się jako eksperymenty z moczeniem na kryształach białka przy użyciu tego samego roztworu do namaczania, co namoczenie fragmentów przez ten sam czas inkubacji, ale nie ma żadnych fragmentów. Jeżeli roztwór do namaczania jest równy warunkom krystalizacji, kryształy mogą być bezpośrednio zebrane z płytki krystalizacyjnej.
W zależności od możliwości zrobotyzowanego zmieniacza próbek, może być konieczne użycie różnych formatów krążków. W chwili obecnej próbki dla linii BL14.1 sterowanej przez HZB muszą być przygotowane w formacie Unipuck, próbki dla linii BL14.2 sterowanej przez HZB muszą być przygotowane w formacie krążka SPINE. W niniejszym protokole zakłada się przygotowanie w formacie Unipuck.

<table><tbody><tr><td>1 &mikro; Pipet L</td><td>Eppendorf</td><td>EP3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Piper 12-kanałowy, 100 &mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>EP4861000791</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka nadmuchowa</td><td>TH-Geyer</td><td>9.106 788</td><td></td></tr><tr><td>Kryształ zawierający płytki</td><td></td><td></td> krystalizacyjne <td>Zawiera kryształy do namoczenia</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td> krystalizacji <td>Zapewniający stałą temperaturę do eksperymentu krystalizacji, przy HZB: 20&deg; C</td></tr><tr><td>Pętle MicroLoop o podwójnej grubości (LD) o różnych rozmiarach apertury</td><td>MiTeGen</td><td>różne, np. M5-L18SP-75LD</td><td>250 pętli w odpowiednim rozmiarze potrzebnym dla protokołu, mogą być dostarczone przez HZB&nbsp;</td></tr><tr><td>Ramka EasyAccess</td><td>HZB</td><td></td><td>Ramka EasyAccess to specjalne urządzenie do obsługi wielu kryształów, które zostało opracowane w HZB (Barthel i in., 2021).</td></tr><tr><td>Płyta F2X-Entry Screen</td> opracowana <td>przez HZB</td><td></td><td>Siatka wejściowa F2X (Wollenhaupt i in., 2020)</td></tr><tr><td>Szklana płyta punktowa</td><td>VWR</td><td>MARI1406506</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td>Co najmniej napełniona puszka o pojemności 5 litrów Puszka</td></tr><tr><td>do przechowywania ciekłego azotu</td> n.a.n.a.Magentic <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kryształowa różdżka</td><td>MiTeGen</td><td>M-R-1013198</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy</td><td>Leica</td><td>n.a.MRC</td><td></td></tr> <tr><td>3-soczewkowa 96-dołkowa niskoprofilowa płytka krystalizacyjna</td><td>SwissCI</td><td>3W96TLP-UVP</td><td>Do sztucznie nasączonych kryształów (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika</td><td>Carl Roth</td><td>EKT6.1</td><td>o pojemności 25 ml</td></tr><tr><td>Szablon</td><td></td><td></td> śledzenia próbki <td>https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>B. Braun</td><td>BA825SU</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca do płytek do mikromiareczkowania</td><td>GreinerBioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>Półkowe laski do wysyłki krążków (do Unipucks)</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-065</td><td>2 laski wykonane z aluminium; mogą być dostarczone przez rozwiązanie do</td></tr><tr><td>namaczania HZB&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Potrzebne jest co najmniej 5 ml</td></tr><tr><td>Roztwór do namaczania, w tym krio-protectant, 150&micro; L</td><td></td><td></td><td>Potrzebne tylko wtedy, gdy roztwór do namaczania nie jest już krio-protektantem</td></tr><tr><td>Tkanki&nbsp;</td><td>Roth (Kimberly Clark Professional)</td><td>AA64.1</td><td></td></tr><tr><td>Transport dewar (Whartington dry shipper)</td><td>MiTeGen</td><td>TW-CX100</td><td>2 Dewary podróżne do przechowywania 2 lasek unuck, alternatywnie można użyć dewara do przechowywania typu VHC35 lub podobnego.</td></tr><tr><td>Dewary piankowe Unipuck z pokrywą</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-022</td><td>dwa dewary piankowe specjalnie nadające się do obsługi Unipuck opisane w protokole jeśli używane są krążki SPINE, może być konieczne zastosowanie różnych piankowych dewarów.</td></tr><tr><td>Zestaw startowy Unipuck</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-UPSK001</td><td>Może być dostarczony przez HZB</td></tr><tr><td>Unipucks</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td>14 unipucks; może być dostarczony przez HZB</td></tr></tbody></table>

przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w helmholtz-zentrum berlin

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Badanie przesiewowe fragmentów to technika, która pomaga zidentyfikować obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów. Biorąc pod uwagę, że kryształy białka docelowego są dostępne i wykazują powtarzalne właściwości dyfrakcji rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości, krystalografia jest jedną z najbardziej preferowanych metod badania przesiewowego fragmentów ze względu na swoją czułość. Dodatkowo jest to jedyna metoda dostarczająca szczegółowych informacji 3D o trybie wiązania fragmentu, co jest niezbędne dla późniejszej racjonalnej ewolucji związku. Rutynowe stosowanie metody zależy od dostępności odpowiednich bibliotek fragmentów, dedykowanych środków do obsługi dużej liczby próbek, najnowocześniejszych synchrotronowych linii badawczych do szybkich pomiarów dyfrakcyjnych oraz w dużej mierze zautomatyzowanych rozwiązań do analizy wyników.
Tutaj prezentowany jest kompletny praktyczny przebieg pracy oraz dołączone narzędzia do przeprowadzania badań przesiewowych fragmentów krystalograficznych (CFS) w Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Przed tym przepływem pracy warunki namaczania kryształów, a także strategie gromadzenia danych są optymalizowane pod kątem powtarzalnych eksperymentów krystalograficznych. Następnie, zazwyczaj w procedurze jedno- lub dwudniowej, 96-elementowa biblioteka skoncentrowana na CFS, dostarczana w postaci wysuszonych, gotowych do użycia płytek, jest wykorzystywana do namaczania 192 kryształów, które są następnie indywidualnie chłodzone błyskawicznie. Końcowe eksperymenty dyfrakcyjne można przeprowadzić w ciągu jednego dnia na liniach BL14.1 i BL14.2 na pierścieniu magazynowania elektronów BESSY II obsługiwanym przez HZB w Berlinie-Adlershof (Niemcy). Przetwarzanie danych krystalograficznych, udoskonalanie struktur białkowych i identyfikacja trafień jest szybkie i w dużej mierze zautomatyzowane przy użyciu specjalistycznych potoków oprogramowania na dedykowanych serwerach, co wymaga niewielkiego wkładu użytkownika.
Korzystanie z przepływu pracy CFS w HZB umożliwia przeprowadzanie rutynowych eksperymentów przesiewowych. Zwiększa to szanse na pomyślną identyfikację uderzeń fragmentów jako punktów wyjścia do opracowania silniejszych spoiw, przydatnych do zastosowań farmakologicznych lub biochemicznych.

W ramach wcześniej raportowanych kampanii walidacyjnych F2X-Entry Screen11, trzy kampanie przeprowadzono na linii wiązki BioMAX w MAX IV, a jedną kampanię na linii wiązki BL14.1 w HZB. W tej ostatniej kampanii określony zestaw warunków F2X-Entry Screen, z wykorzystaniem warunku namaczania bez DMSO, został przebadany przeciwko kompleksowi białko-białko drożdżowego białka Aar2 i domenie RNaseH-podobnej drożdżowego białka Prp8 (AR). Wybrany zestaw warunków obejmuje trafienia znalezione w poprzedniej kampanii F2X-Entry Screen przeciwko AR w warunku namaczania z zawartością DMSO11 (tzn. w kampanii przeprowadzonej w HZB trafienia te zostały przebadane ponownie w obecności DMSO). Rysunek 7 przedstawia przegląd trafień uzyskanych po analizie danych za pomocą kombinacji FragMAXapp, obejmującej XDSAPP do przetwarzania, fspipeline do automatycznej rafinacji oraz PanDDA do późniejszego wyszukiwania trafień.
<img alt="Schemat procesu przesiewania fragmentów; kryształy białek, wybór biblioteki, zbieranie danych, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przebieg eksperymentu krystalograficznego przesiewania fragmentów (CFS) ze szczególnym uwzględnieniem specyfiki środowiska w Helmholtz-Zentrum Berlin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Płytki do krystalizacji białek, metoda przedstawiona na obrazach mikroskopowych, schemat ustawienia analizy próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Formułowanie i pakowanie zestawu F2X-Entry Screen. Ekran obejmujący 96 związków jest dostępny na płytce MRC o niskim profilu z 96 dołkami i 3 soczewkami, zamkniętej folią i zapakowanej próżniowo. 96 związków wchodzących w skład zestawu zostało wysuszono z roztworów DMSO w dwóch z trzech soczewek każdego dołka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układy mikroskopowe do analizy komórkowej, obejmujące mikroskopy stereoskopowe, szalki Petriego i pipety." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Fotografia stanowiska CFS w laboratorium preparacji HZB. Przedstawiono zestawy niezbędnych narzędzi do A) namaczania oraz B) zbioru kryształów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ dyfrakcji rentgenowskiej z ramieniem robotycznym, system IRELEC; analiza obrazu mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Stacje końcowe do zbierania danych i oprogramowanie sterujące.  A>) Fotografia komory eksperymentalnej linii wiązek HZB-MX BL14.1 (lewo) i BL14.2 (prawo)15. B>) Zrzut ekranu interfejsu sterowania eksperymentem MXCuBE216 używanego przy BL14.1 do zbierania danych dyfrakcyjnych. Przy BL14.2 używany jest bardzo podobny interfejs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Widok mikroskopowy chipa mikroprzepływowego, analiza wzrostu kryształów, ustawienie eksperymentu, skala 10 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Zdjęcia niektórych próbek krystalicznych w środowisku kriogenicznym przed gromadzeniem danych. Ilustruje to zmienność morfologii kryształów po przeprowadzeniu namaczania fragmentów i zbioru kryształów. Zdjęcia zostały wykonane na linii wiązki BioMAX (synchrotron MAX IV, Lund, Szwecja) dla próbek AR zebranych tam w ramach walidacji F2X-Entry Screen11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Interfejs analizy danych dla krystalografii; zawiera opcje udoskonalania struktury i dopasowywania ligandów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Zrzut ekranu aplikacji FragMaxApp18 zainstalowanej w HZB w celu wygodnej analizy danych. Więcej szczegółów w Lima et al., FragMAXapp, niepublikowane dane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagram interakcji białek, Aar2 i RNaseH z hitami fragmentów, badanie biologii strukturalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Przegląd wyników kampanii CFS F2X-Entry vs. AR (bez DMSO). Kompleks białkowy AR przedstawiono w widoku schematycznym (cartoon), przy czym Aar2 zaznaczono kolorem szarym, a domenę RNaseH-like białka Prp8 kolorem niebieskim. Hity fragmentów z kampanii są zaznaczone kolorami pierwiastków (C – żółty, O – czerwony, N – niebieski, S – pomarańczowy, Cl – jasnoniebieski). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
 
Szablon arkusza śledzenia próbek.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking.xlsx" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Badanie przesiewowe fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin odbywa się za pomocą przepływu pracy z dedykowanymi bibliotekami związków, narzędziami do obsługi kryształów, szybkimi urządzeniami do zbierania danych i w dużej mierze zautomatyzowaną analizą danych. Przedstawiony protokół ma na celu maksymalizację wyników takich eksperymentów, aby zapewnić obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów opartych na dalszej strukturze.

Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

Badania przesiewowe mniejszych związków organicznych zwanych fragmentami za pomocą krystalografii rentgenowskiej są skuteczną metodą identyfikacji cząsteczek, które są punktami wyjścia do odkrywania leków lub opracowywania biochemicznych związków narzędziowych. Krystalograficzne badania przesiewowe fragmentów ujawniły nie tylko tożsamość, ale także miejsce i sposób wiązania fragmentów na powierzchni badanego białka. Technika ta może być stosowana na każdym biochemicznie lub medycznie istotnym celu białkowym, dla którego można wyhodować odpowiednie kryształy białka.Jakość wyników jest ściśle związana z jakością obsługi próbki. Wierzymy, że poniższa demonstracja wizualna pomoże naukowcom w przeprowadzaniu wysokiej jakości eksperymentów. Procedurę zademonstruje Tatjana Barthel, doktorantka i doktorantka w moim laboratorium.Na początek rozetnij worek z płytą sitową wstępnie podgrzaną do temperatury pokojowej, a następnie zdejmij pokrywkę i folię z płyty sitowej. Zdekantować pięciomililitrowy roztwór do namaczania w zbiorniku odczynnika. Następnie napełnij każdy z 96 zbiorników płytki 40 mikrolitrami roztworu do namaczania za pomocą 12-kanałowej pipety.Umieść ramkę łatwego dostępu na górze płyty sitowej i zabezpiecz ją za pomocą dołączonych zacisków, wsuwając je na lewą i prawą stronę urządzenia. Umieść płytkę sitową i ramkę łatwego dostępu pod mikroskopem i otwórz pierwszą studzienkę, przesuwając odpowiednią płytkę ze szkła akrylowego ramy. Dodać 0,4 mikrolitra roztworu do namaczania ze zbiornika do dobrze zawierającego fragmentu za pomocą świeżej końcówki pipety.Upewnij się, że kropla zakrywa wysuszony fragment. Umieść płytkę krystalizacyjną zawierającą największe kryształy pod drugim mikroskopem i rozetnij folię uszczelniającą w jednym z dołków. Za pomocą pętli o odpowiedniej wielkości przenieś kryształ do dołka płytki przesiewowej pod pierwszym mikroskopem.Umyj pętlę w przygotowanej szklanej płytce punktowej, a następnie wysusz ją, delikatnie dotykając nią chusteczki. Rób to po każdym transferze, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Użyj mikroskopu, aby upewnić się, że kryształ został prawidłowo umieszczony.Powtórz procedurę dla drugiego kryształu. Przejdź do następnej studni i powtórz procedurę dla wszystkich pozostałych studzienek. Po przeniesieniu kryształów do wszystkich 96 dołków na płycie sitowej, wyjmij płytkę sitową wraz z ramką łatwego dostępu spod mikroskopu i umieść ją na stole lub stole.Następnie zdejmij ramkę łatwego dostępu z płyty sitowej, uszczelnij płytkę sitową folią uszczelniającą i umieść ją w inkubatorze do krystalizacji lub szafce w celu inkubacji przez wcześniej zoptymalizowany czas namaczania. Wystarczą dwie godziny inkubacji, ale wygodniejsza może być noc. Przygotuj piankę Unipuck Dewar z trzema pokrywkami Unipuck i napełnij ją do połowy ciekłym azotem, trzymając ją na ziemi.Przenieś do połowy wypełnionego Dewara na ławkę i wypełnij go całkowicie do samej krawędzi. Utrzymuj go napełnionego do górnej krawędzi podczas całego eksperymentu i często wymieniaj ciekły azot. Wyjąć płytkę sitową z inkubatora i usunąć z niej folię.Umieść ramkę łatwego dostępu na górze. Otwórz pierwszą studzienkę. Zbierz jeden kryształ z kropli i schłodzić go w ciekłym azocie, zanurzając się szybkim ruchem pionowym.Umieść próbkę w odpowiedniej pozycji krążka i zrób odpowiednie notatki na arkuszu śledzenia próbki. Powtórz procedurę dla drugiego kryształu. Idź do następnej studni i powtarzaj ułożenie innych kryształów, aż wszystkie trzy krążki będą pełne.Wstępnie schłodź bazy Unipuck w ciekłym azocie i dodaj je na wierzch pokrywek. Przechowuj Unipucks w regale magazynowym w transportowym Dewarze lub magazynie Dewar. Przechowuj je w ciekłym azocie w temperaturach kriogenicznych do czasu pomiaru.Powtórzyć tę samą procedurę zbierania i przechowywania kryształów w Unipucks dla pozostałych próbek na płytce przesiewającej. Przedstawiono zmienność morfologii kryształów po przeprowadzeniu namaczania fragmentów i zebraniu kryształów. Uwzględniono nawet kryształy, które wyglądają na nieco zniszczone, ponieważ nadal dostarczają użytecznych danych.Dane zebrano na liniach 14.1 i 14.2 synchrotronu BESSY II. Dla każdej próbki przeprowadzono zbieranie danych dyfrakcyjnych. Dane zostały przeanalizowane za pomocą FragMAXapp, koncentrując się na połączeniu XDSAPP do przetwarzania, fspipeline do udoskonalania struktury i PenDA do znajdowania trafień.Spowodowało to 15 trafień w kompleks białkowy AR przy użyciu warunków namaczania wolnego od DMSO. W poprzedniej kampanii ekranu wejściowego F2X przeciwko temu samemu celowi, w tym DMSO w stanie przemoczenia, znaleziono 20 trafień. Oznacza to, że 75% trafień można zidentyfikować, jeśli pominie się DMSO.Dla powodzenia eksperymentu kluczowe jest, aby z kryształami obchodzić się prawidłowo i ostrożnie na każdym etapie procedury. Krystalograficzne badania przesiewowe fragmentów dojrzały do poziomu szeroko stosowanej techniki, która jest często stosowana w środowisku akademickim i przemyśle farmaceutycznym.

workflow-tools-for-crystallographic-fragment-screening-at-helmholtz

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Prezentujemy użycie protokołu MeshAndCollect do uzyskania kompletnego zestawu danych dyfrakcyjnych, do wykorzystania w późniejszym określaniu struktury, składającego się z częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych zebranych z wielu małych kryształów fluorescencyjnego białka Cerulean.

Roztwór strukturalny białka fluorescencyjnego Cerulean za pomocą MeshAndCollect

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

W artykule przedstawiono metodę generowania kryształów białek pochodzonych z I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy) za pomocą mikrozasiewania do generowania nowych warunków krystalizacji w rzadkich przesiewach matrycowych. Tacy można ustawić za pomocą robotów do dyspensowania płynów lub ręcznie.

Deriwatyzacja kryształów białek za pomocą I3C za pomocą losowego przesiewania macierzy mikronasion

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Ten artykuł opisuje cały proces XChem do badania fragmentów na bazie kryształów, począwszy od złożenia wniosku o dostęp i wszystkich kolejnych kroków do rozpowszechniania danych.

Osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie XChem w Diamond Light Source

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

Ten protokół szczegółowo opisuje wysokoprzepustowe badanie przesiewowe krystalizacji, począwszy od przygotowania 1 536 mikropróbek do końca 6-tygodniowego okna eksperymentalnego. Znajdują się tam szczegółowe informacje na temat konfiguracji próbki, uzyskanego obrazowania oraz sposobu, w jaki użytkownicy mogą wykonywać analizy za pomocą graficznego interfejsu użytkownika opartego na sztucznej inteligencji, aby szybko i skutecznie zidentyfikować warunki krystalizacji makromolekularnej.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu uzyskania trafień kryształów do krystalografii białek

Badanie przesiewowe z użyciem wielu siatek w mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) jest często żmudnym procesem, który wymaga wielu godzin uwagi. Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować standardową kolekcję Leginon i Smart Leginon Autoscreen, aby zautomatyzować ten proces. Protokół ten można zastosować do większości dziurawych siatek foliowych cryoEM.

Automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu Smart Leginon

Poznaj przesiewowe badanie fragmentów krystalograficznych w celu odkrywania leków przy użyciu krystalografii rentgenowskiej. Ta metoda pozwala identyfikować małe cząsteczki wiążące się z białkami.

Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin

Przeglądaj więcej filmów