Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin
3 marca 2021
Badanie przesiewowe fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin odbywa się za pomocą przepływu pracy z dedykowanymi bibliotekami związków, narzędziami do obsługi kryształów, szybkimi urządzeniami do zbierania danych i w dużej mierze zautomatyzowaną analizą danych. Przedstawiony protokół ma na celu maksymalizację wyników takich eksperymentów, aby zapewnić obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów opartych na dalszej strukturze.
Badania przesiewowe mniejszych związków organicznych zwanych fragmentami za pomocą krystalografii rentgenowskiej są skuteczną metodą identyfikacji cząsteczek, które są punktami wyjścia do odkrywania leków lub opracowywania biochemicznych związków narzędziowych. Krystalograficzne badania przesiewowe fragmentów ujawniły nie tylko tożsamość, ale także miejsce i sposób wiązania fragmentów na powierzchni badanego białka. Technika ta może być stosowana na każdym biochemicznie lub medycznie istotnym celu białkowym, dla którego można wyhodować odpowiednie kryształy białka.
Jakość wyników jest ściśle związana z jakością obsługi próbki. Wierzymy, że poniższa demonstracja wizualna pomoże naukowcom w przeprowadzaniu wysokiej jakości eksperymentów. Procedurę zademonstruje Tatjana Barthel, doktorantka i doktorantka w moim laboratorium.
Na początek rozetnij worek z płytą sitową wstępnie podgrzaną do temperatury pokojowej, a następnie zdejmij pokrywkę i folię z płyty sitowej. Zdekantować pięciomililitrowy roztwór do namaczania w zbiorniku odczynnika. Następnie napełnij każdy z 96 zbiorników płytki 40 mikrolitrami roztworu do namaczania za pomocą 12-kanałowej pipety.
Umieść ramkę łatwego dostępu na górze płyty sitowej i zabezpiecz ją za pomocą dołączonych zacisków, wsuwając je na lewą i prawą stronę urządzenia. Umieść płytkę sitową i ramkę łatwego dostępu pod mikroskopem i otwórz pierwszą studzienkę, przesuwając odpowiednią płytkę ze szkła akrylowego ramy. Dodać 0,4 mikrolitra roztworu do namaczania ze zbiornika do dobrze zawierającego fragmentu za pomocą świeżej końcówki pipety.
Upewnij się, że kropla zakrywa wysuszony fragment. Umieść płytkę krystalizacyjną zawierającą największe kryształy pod drugim mikroskopem i rozetnij folię uszczelniającą w jednym z dołków. Za pomocą pętli o odpowiedniej wielkości przenieś kryształ do dołka płytki przesiewowej pod pierwszym mikroskopem.
Umyj pętlę w przygotowanej szklanej płytce punktowej, a następnie wysusz ją, delikatnie dotykając nią chusteczki. Rób to po każdym transferze, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Użyj mikroskopu, aby upewnić się, że kryształ został prawidłowo umieszczony.
Powtórz procedurę dla drugiego kryształu. Przejdź do następnej studni i powtórz procedurę dla wszystkich pozostałych studzienek. Po przeniesieniu kryształów do wszystkich 96 dołków na płycie sitowej, wyjmij płytkę sitową wraz z ramką łatwego dostępu spod mikroskopu i umieść ją na stole lub stole.
Następnie zdejmij ramkę łatwego dostępu z płyty sitowej, uszczelnij płytkę sitową folią uszczelniającą i umieść ją w inkubatorze do krystalizacji lub szafce w celu inkubacji przez wcześniej zoptymalizowany czas namaczania. Wystarczą dwie godziny inkubacji, ale wygodniejsza może być noc. Przygotuj piankę Unipuck Dewar z trzema pokrywkami Unipuck i napełnij ją do połowy ciekłym azotem, trzymając ją na ziemi.
Przenieś do połowy wypełnionego Dewara na ławkę i wypełnij go całkowicie do samej krawędzi. Utrzymuj go napełnionego do górnej krawędzi podczas całego eksperymentu i często wymieniaj ciekły azot. Wyjąć płytkę sitową z inkubatora i usunąć z niej folię.
Umieść ramkę łatwego dostępu na górze. Otwórz pierwszą studzienkę. Zbierz jeden kryształ z kropli i schłodzić go w ciekłym azocie, zanurzając się szybkim ruchem pionowym.
Umieść próbkę w odpowiedniej pozycji krążka i zrób odpowiednie notatki na arkuszu śledzenia próbki. Powtórz procedurę dla drugiego kryształu. Idź do następnej studni i powtarzaj ułożenie innych kryształów, aż wszystkie trzy krążki będą pełne.
Wstępnie schłodź bazy Unipuck w ciekłym azocie i dodaj je na wierzch pokrywek. Przechowuj Unipucks w regale magazynowym w transportowym Dewarze lub magazynie Dewar. Przechowuj je w ciekłym azocie w temperaturach kriogenicznych do czasu pomiaru.
Powtórzyć tę samą procedurę zbierania i przechowywania kryształów w Unipucks dla pozostałych próbek na płytce przesiewającej. Przedstawiono zmienność morfologii kryształów po przeprowadzeniu namaczania fragmentów i zebraniu kryształów. Uwzględniono nawet kryształy, które wyglądają na nieco zniszczone, ponieważ nadal dostarczają użytecznych danych.
Dane zebrano na liniach 14.1 i 14.2 synchrotronu BESSY II. Dla każdej próbki przeprowadzono zbieranie danych dyfrakcyjnych. Dane zostały przeanalizowane za pomocą FragMAXapp, koncentrując się na połączeniu XDSAPP do przetwarzania, fspipeline do udoskonalania struktury i PenDA do znajdowania trafień.
Spowodowało to 15 trafień w kompleks białkowy AR przy użyciu warunków namaczania wolnego od DMSO. W poprzedniej kampanii ekranu wejściowego F2X przeciwko temu samemu celowi, w tym DMSO w stanie przemoczenia, znaleziono 20 trafień. Oznacza to, że 75% trafień można zidentyfikować, jeśli pominie się DMSO.
Dla powodzenia eksperymentu kluczowe jest, aby z kryształami obchodzić się prawidłowo i ostrożnie na każdym etapie procedury. Krystalograficzne badania przesiewowe fragmentów dojrzały do poziomu szeroko stosowanej techniki, która jest często stosowana w środowisku akademickim i przemyśle farmaceutycznym.
Przegląd
W niniejszym artykule omówiono krystalograficzny screening fragmentów jako metodę identyfikacji potencjalnych kandydatów na leki z wykorzystaniem krystalografii rentgenowskiej. Protokół ma na celu zwiększenie wydajności doświadczeń poprzez zastosowanie zautomatyzowanej analizy danych oraz zoptymalizowanej obsługi próbek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Krystalografia
- Odkrywanie leków
- Biochemia
Wstęp
- Przesiewanie fragmentów (fragment screening) to technika stosowana w celu zidentyfikowania małych związków organicznych, które mogą wiązać się z białkami.
- Jakość wyników jest w dużym stopniu zależna od sposobu obchodzenia się z próbkami oraz technik krystalizacji.
- Metodę tę można zastosować do różnych istotnych biochemicznie białek docelowych.
- Właściwa obsługa kryształów jest kluczowa dla pomyślnego zebrania danych.
Cel badania
- Przedstawienie szczegółowego protokołu krystalograficznego przesiewania fragmentów.
- Zapewnienie wglądu w charakterystykę wiązania fragmentów na powierzchniach białek.
- Poprawa wyników eksperymentów służących projektowaniu ligandów w oparciu o strukturę.
Zastosowane metody
- Przygotowanie płytek przesiewowych z roztworami do namaczania.
- Przeniesienie kryształów białka do dołków przesiewowych.
- Inkubacja kryształów w zoptymalizowanych warunkach.
- Zbieranie i analiza danych przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.
Główne wyniki
- Identyfikacja 15 trafień w kompleksie białka AR w warunkach bez DMSO.
- Porównanie z poprzednimi eksperymentami wykazało, że pominięcie DMSO nadal może przynieść istotne trafienia.
- Wykazano zmienność morfologii kryształów oraz ich wpływ na jakość danych.
Wnioski
- Przesiewanie fragmentów metodą krystalograficzną jest cenną techniką w procesie odkrywania leków.
- Staranne obchodzenie się z kryształami jest niezbędne do uzyskania wiarygodnych danych.
- Protokół ten może służyć jako przewodnik dla badaczy w nauce i przemyśle.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Krystalograficzny screening fragmentów umożliwia wczesną identyfikację sposobów wiązania ligandów z rozdzielczością atomową, co wspiera walidację celu oraz optymalizację związków wiodących w projektowaniu leków opartym na strukturze. Przepływ pracy zaprezentowany w HZB integruje zautomatyzowane przetwarzanie danych i standaryzowaną obsługę kryształów w celu zwiększenia odtwarzalności i przepustowości w poszukiwaniu trafień fragmentów. Podejście to zmniejsza niepewność mechanistyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, dostarczając bezpośrednich informacji strukturalnych na temat oddziaływań fragment-białko, co pozwala na podejmowanie decyzji go/no-go w odniesieniu do dalszych prac z zakresu chemii medycznej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Zapewnia bezpośrednią wizualizację 3D miejsc wiązania fragmentów, co umożliwia mechanistyczną weryfikację hipotez dotyczących celu molekularnego.
- Wartość operacyjna: Wspiera szybki screening 96-elementowych bibliotek fragmentów z wykorzystaniem kryształów białek w celu zbadania plastyczności miejsca wiązania.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na identyfikację fragmentów typu „hit”, które stanowią punkty wyjścia do optymalizacji silnych ligandów w oparciu o strukturę.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych map gęstości elektronowej w celu potwierdzenia stopnia zajęcia miejsc wiązania przez fragmenty oraz ich konformacji wiązania.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje zamontowane na robocie systemy wymiany próbek na liniach wiązek synchrotronowych do zautomatyzowanego gromadzenia danych z setek kryształów.
- Gotowość do analizy: Stosuje standaryzowane protokoły namaczania i szybkiego mrożenia w celu zapewnienia powtarzalnych danych dyfrakcyjnych wysokiej jakości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Fragmenty zidentyfikowane za pomocą CFS mogą zostać przekształcone w związki wiodące o poprawionych właściwościach farmakologicznych do oceny przedklinicznej.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Dane strukturalne dotyczące wiązania fragmentów dostarczają informacji niezbędnych do rozwoju SAR i zmniejszają ryzyko niepowodzenia w procesie optymalizacji związku wiodącego.
- Znaczenie przedkliniczne: Umożliwia ocenę efektywności fragmentów oraz wskaźników efektywności ligandów w celu priorytetyzacji chemotypów o korzystnym potencjale rozwojowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Przepływ pracy CFS wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celu poprzez charakterystykę strukturalną oraz umożliwiając identyfikację związków wiodących za pomocą strategii rozbudowy lub łączenia fragmentów.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez poprzez ujawnienie miejsca i sposobu wiązania małych cząsteczek z docelowymi białkami.
- Przesiewanie: Umożliwia równoległe przesiewanie bibliotek fragmentów dzięki zautomatyzowanej obsłudze kryształów i zbieraniu danych w synchrotronie.
- Analityka: Integruje XDSAPP, fspipeline oraz PenDA w celu zautomatyzowanego przetwarzania, udoskonalania i identyfikacji trafień w zbiorach danych dyfrakcyjnych.
- Badania translacyjne: Wspiera projektowanie ligandów w oparciu o strukturę, dostarczając informacji o trybach wiązania na poziomie atomowym w celu optymalizacji fragmentów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zstandardizowaną, wielokrotnego użytku platformę do przesiewania fragmentów dla wielu białek docelowych w portfolio odkrywczym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do oddziaływań między celem a ligandem dzięki bezpośrednim dowodom eksperymentalnym dotyczącym trybu wiązania.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji procedur namaczania kryształów, ich zbioru oraz krioprzzechowywania.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność procesu hit-to-lead poprzez priorytetyzację fragmentów o korzystnych oddziaływaniach wiążących dla chemii medycznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wyniki screeningu fragmentów i podatność strukturalną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w krystalizacji białek, obchodzeniu się z kryształami oraz gromadzeniu danych przy użyciu synchrotronu.
- Zależne od dostępu do linii wiązki o wysokiej jasności oraz zautomatyzowanych systemów wymiany próbek do wysokoprzepustowego przesiewania.
- Wymaga zstandaryzowanych protokołów przygotowania biblioteki fragmentów, warunków namaczania oraz potoków analizy danych.
- Wiąże się z koordynacją międzyzespołową w zakresie biologii strukturalnej, chemii medycznej i grup analizy danych.
- Ograniczone do celów, dla których można uzyskać i utrzymać powtarzalne, wysokiej jakości kryształy w warunkach przesiewania.
