Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo

Opisujemy szybki i solidny protokół wzbogacania niezmiennych komórek T natural killer (iNKT) ze śledziony myszy i rozszerzania ich in vitro do odpowiedniej liczby dla badań in vitro i in vivo.

Protokół ten umożliwia oczyszczanie limfocytów T INK, które są bardzo rzadkie, i pozwala na 30-krotne zwiększenie ich liczby. Oczyszczanie można przeprowadzić w ciągu jednego dnia i w ciągu dwóch tygodni wytworzyć dużą liczbę gotowych do użycia limfocytów T INK do badań in vivo i in vitro. Procedurę zademonstruje Gloria Delfanti, post-doc w laboratorium.

Po wycięciu śledziony myszy rozbij ją przez sitko komórkowe o długości 70 nanometrów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki w 10 mililitrach PBS z 2% FBS. Wirować przy 300 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z jednym mililitrem sterylnego buforu lizyny potasowej chlorku amonu.

Inkubować komórki przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie zablokować pięcioma mililitrami PBS z 2% FBS. Wirować przy 300 razy G przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach PBS z 2% FBS i usunąć pozostałości tłuszczu przez pipetowanie.

Do etapów wzbogacania utrzymuj komórki w niskiej temperaturze i używaj roztworów wstępnie schłodzonych w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przechowywanych na lodzie. Wirować przy 300 razy G przez pięć minut. Ponownie zawiesić wszystkie komórki w odpowiedniej ilości PBS z blokerem 2% FPS i Fc i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Przemyć jednym do dwóch mililitrów buforu separacyjnego MACS na 10 milionów komórek i odwirować w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Po usunięciu supernatantu wybarwić komórki CD19-FITC i H2-IAb-FITC i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza. Umyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów buforu MACS na 10 milionów komórek i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut.

Usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 90 mikrolitrach buforu MACS na 10 milionów komórek. Dodaj 10 mikrolitrów mikrogranulek anty-FITC na 10 milionów komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w ciemności w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza.

Umyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów buforu MACS na 10 milionów komórek i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Usuń supernatant i ponownie zawieś do 125 milionów komórek w 500 mikrolitrach buforu MACS. Umieść kolumnę LD w polu magnetycznym separatora MACS.

Aby uniknąć zatkania, nałóż filtr wstępnej separacji na kolumnę LD i przepłucz ją dwoma mililitrami buforu MACS. Nałóż zawiesinę komórek na filtr i zbierz nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę. Umyj pusty zbiornik kolumny trzykrotnie jednym mililitrem buforu MACS.

Zbierz ścieki wzbogacone w limfocyty T i policz komórki, zachowując 50 mikrolitrów do analizy FACS. Po odwirowaniu w temperaturze 300 razy G przez pięć minut, usunąć supernatant i wybarwić komórki tetramerem PE CD1d. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w ciemności na lodzie.

Umyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów buforu MACS na 10 milionów komórek. Po odwirowaniu przy 300 razy G przez 10 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 80 mikrolitrach buforu MACS na 10 milionów komórek. Dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek anty-PE na 10 milionów komórek.

Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w ciemności w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza. Umyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów buforu MACS na 10 milionów komórek i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Usuń supernatant i ponownie zawieś do 100 milionów komórek w 500 mikrolitrach bufora MACS.

W zależności od liczby komórek umieść kolumnę LS lub MS w polu magnetycznym separatora MACS i przepłucz kolumnę buforem MACS. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę, zbierz nieoznakowane komórki, które przez nią przechodzą i umyj kolumnę trzy razy, jak opisano wcześniej. To jest ułamek ujemny.

Usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na nowej probówce zbiorczej. Odpipetować bufor MACS na kolumnę i wcisnąć dostarczony tłok do kolumny, aby wypłukać frakcję dodatnią wzbogaconą w limfocyty T INK. Aby jeszcze bardziej zwiększyć odzysk limfocytów T INK, odwiruj frakcję ujemną przy 300 razy G przez 10 minut i powtórz poprzednie kroki z nową kolumną LS lub MS.

Wyciągnij frakcje dodatnie i określ liczbę komórek. Zachowaj 50 mikrolitrów zarówno frakcji dodatniej, jak i ujemnej do analizy FACS w celu sprawdzenia czystości. Aby aktywować limfocyty T INK w stosunku jeden do jednego, przenieś odpowiednią objętość kulek magnetycznych anty-CD3 i CD28 do probówki i przy równej objętości PBS, a następnie wiruj przez pięć sekund.

Umieścić probówkę na magnesie na jedną minutę i wyrzucić supernatant. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś umyte kulki magnetyczne w odpowiedniej objętości RPMI. Odwiruj oczyszczone limfocyty T INK w temperaturze 300 razy G przez pięć minut i wymieszaj je z mysim aktywatorem T anty-CD3 lub kulkami magnetycznymi CD28.

Umieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej, kulki magnetyczne anty-CD23 i CD28 na 48-dołkowej płytce z 20 jednostkami na mililitr IL-2, a następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu dniach dodaj 10 nanogramów na mililitr IL-7. Podziel komórki na pół, gdy osiągną 80 do 90% zbieżności, zawsze dodając 20 jednostek na mililitr IL-2 i 10 nanogramów na mililitr IL-7.

W tych warunkach limfocyty T INK mogą być rozprężane przez okres do 15 dni. Korzystając z tego protokołu, limfocyty T INK są wzbogacane ze śledziony myszy transgenicznych w procesie separacji immunomagnetycznej. Po wzbogaceniu komórki mogą być namnażane za pomocą kulek anty-CD3 i CD28, co skutkuje 30-krotnym rozszerzeniem średnio do 14 dnia hodowli.

Silna aktywacja kulkami anty-CD3 i anty-CD indukowała regulację w dół ekspresji TCR komórek T IMK na powierzchni komórki i pojawiła się populacja podwójnie ujemna. Większość ekspandowanych limfocytów T INK jest CD4-ujemna. Charakterystyka specyficznych dla linii czynników transkrypcyjnych PLZF i ROR gamma T umożliwiła identyfikację fenotypów NKT1, NKT2 i NKT17 na wzbogaconych limfocytach T INK w dniu zero i 14.

Wzbogacone limfocyty T INK wykazują fenotyp efektorowy podobny do T80, który jest zachowany po 14 dniach ekspansji, co potwierdza wydzielanie zarówno interferonu gamma, jak i IL-4 po stymulacji PMA i jonomycyny. Podczas etapów oczyszczania należy pamiętać o szybkiej pracy z wstępnie schłodzonymi roztworami i pozbyciu się wszelkich pozostałości tłuszczu, które mogą być widoczne podczas pipetowania. Ekspandowane limfocyty T INK mogą być wykorzystywane do testów in vitro i transferów in vivo do myszy, nawet po modyfikacjach funkcjonalnych poprzez transfer lub edycję genów.

Ekspansja in vitro limfocytów T INK pokonuje ograniczenia wynikające z niedoboru, dzięki czemu można je wykorzystać w badaniach przedklinicznych w dziedzinie nadzoru immunologicznego nowotworów, chorób zakaźnych i autoimmunizacji.