Name: Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania i namnażania mysich niezmiennych limfocytów T NK z jednodniową puryfikacją i 30-krotnym zwiększeniem liczby komórek w ciągu dwóch tygodni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Paolo Dellabona i Giulii Casorati za wsparcie naukowe i krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy również NIH Tetramer Core Facility za tetramer CD1d u myszy. Badanie zostało sfinansowane przez Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (dla M.F.) i stypendium Włoskiego Stowarzyszenia Badań nad Rakiem (AIRC) 2019-22604 (dla G.D.).

Opisane tutaj procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) (nr 1048) w Instytucie Naukowym San Raffaele.
UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wykonywane w sterylnych warunkach. Wszystkie użyte odczynniki są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przetwarzanie śledziony
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji myszy iVα14-Jα18 przez wdychanie CO2 zgodnie z polityką instytucjonalną. 
	UWAGA: Myszy iVα14-Jα18 muszą mieć co najmniej 8 tygodni. Aby uniknąć odrzucenia komórek z transferu komórek in vivo, należy wziąć pod uwagę, że komórki wyizolowane od samic myszy mogą być przenoszone adoptywnie zarówno u samców, jak i samic, podczas gdy komórki wyizolowane od samców myszy mogą być przenoszone tylko u męskich biorców. W przypadku eksperymentów in vitro nie należy brać pod uwagę uprzedzeń związanych z płcią. Więcej myszy można połączyć w pulę, aby uzyskać więcej komórek.</li>
	<li>Wypreparuj śledzionę myszy i przebij ją przez sitko komórkowe o długości 70 nm, aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez inwersję i przetworzyć za pomocą buforu do lizy erytrocytów. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml sterylnego buforu lizującego ACK (chlorek amonu-potasu), inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i zablokować 5 ml PBS z 2% FBS. Wirować przy 300 x g przez 5 min. 
	UWAGA: ACK jest dostępny na rynku; składa się z roztworu 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM Na2EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) rozpuszczonego w bidestylowanymH2O, pH 7,2-7,4. Jeśli jest domowej roboty, sterylizuj przez filtrację za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez odwrócenie. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml PBS z 2% FBS i usunąć pozostałości tłuszczu przez pipetowanie. W razie potrzeby połącz komórki pochodzące od różnych myszy.</li>
	<li>Policz komórki i zachowaj 50 μl do analizy FACS.</li>
</ol>
2. Wzbogacanie limfocytów T
UWAGA: Na etapach wzbogacania, pracuj szybko, utrzymuj komórki w niskiej temperaturze i używaj roztworów wstępnie schłodzonych w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie trzymanych na lodzie
<ol>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wszystkie komórki w odpowiedniej ilości PBS z 2% FBS (500 μL na 107 komórek) i blokerem Fc (2,5 μl x 107 komórek); inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przemyć 1-2 ml buforu separacyjnego MACS (MB) na 107 komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 min. 
	UWAGA: Bufor MACS jest dostępny w handlu. Składa się z PBS pH 7,2, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA. Jeśli jest domowej roboty, sterylizuj przez filtrację za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez inwersję i wybarwić komórki CD19-FITC i H2(IAb)-FITC (użyć 5 μL x 107 komórek w 100 μL MB). Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4-8 °C.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając 1-2 ml MB na 10-7 komórek i odwiruj przy 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Całkowicie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 90 μl MB na 107 wszystkich komórek. Dodać 10 μl mikrokulek anty-FITC na 107 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4-8 °C.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając 1−2 ml MB na10-7 komórek i odwiruj przy 300 x g przez 10 min.</li>
	<li>Całkowicie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić do 1,25 x 108 ogniw w 500 μl MB.</li>
	<li>Umieść kolumnę LD w polu magnetycznym separatora MACS, aby przejść do wyczerpania. Aby uniknąć zatkania, nałóż filtr wstępnej separacji na kolumnę LD i spłucz 2 ml MB.</li>
	<li>Gdy zbiornik kolumny jest pusty, nałóż zawiesinę komórek na filtr. Zbierz komórki bez etykiet, które przechodzą przez kolumnę.</li>
	<li>Przemyć 3 razy 1 ml MB, tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty. Zbierz całkowite ścieki, które zostaną wzbogacone w limfocyty T, i policz komórki. Zawsze miej przy sobie 50 μl do analizy FACS.</li>
</ol>
3. Wzbogacanie komórek iNKT
<ol>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant przez inwersję.</li>
	<li>Wybarwić komórki CD1d-tetramerem-PE (mysi PBS57-CD1d-tetramer), zgodnie z miareczkowaniem przeciwciał w 50 μl MB na 106 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w ciemności na lodzie. 
	UWAGA: Zabieg można również wykonać z tetramerami mCD1d znakowanymi APC i kulkami anty-APC; odpowiednio dostosowując fluorochromy użyte w następnym barwieniu. W niniejszym protokole użyliśmy mysich tetramerów PBS-57-CD1d dostarczonych przez NIH. αgalaktozyloceramid (αGal-Cer) jest prototypowym antygenem rozpoznawanym przez komórki iNKT; PBS-57 jest analogiem αGal-Cer o zwiększonej rozpuszczalności9; NIH Tetramer Facility zapewnia ligand PBS-57 skompleksowany z tetramerami CD1d. Jednak inne dimery/tetramery/deksmery CD1d są dostępne na rynku i mogą być obciążone antygenem lipidowym jako αGal-Cer. Przewidujemy możliwość dostosowania protokołu do ich stosowania.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając 1−2 ml MB na10-7 komórek i odwiruj przy 300 x g przez 10 min.</li>
	<li>Całkowicie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 80 μl MB na 107 wszystkich komórek. Dodać 20 μl mikrokulek anty-PE na 107 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4-8 °C.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając 1-2 ml MB na 10-7 komórek i odwiruj przy 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Całkowicie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić do 108 komórek w 500 μl MB. W przeciwnym razie, jeśli komórki przekraczają 108, odpowiednio dostosuj głośność.</li>
	<li>W zależności od liczby komórek umieść kolumnę LS (do 108) lub MS (do 107) w polu magnetycznym separatora MACS. Przepłukać kolumnę roztworem MB (3 ml dla LS, 500 μl dla MS).</li>
	<li>Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę.</li>
	<li>Zbierz nieoznakowane komórki, które przechodzą. Przemyć kolumnę 3 razy, dodając odpowiednią ilość MB (3 x 3 ml dla kolumny LS, 3 x 500 μL dla kolumny MS) tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty. Ścieki całkowite to frakcja ujemna.</li>
	<li>Usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na nowej probówce zbiorczej.</li>
	<li>Odpipetować MB na kolumnę (5 ml dla kolumny LS lub 1 ml dla kolumny MS); wepchnąć dostarczony tłok do kolumny i wypłukać frakcję dodatnią (wzbogaconą w komórki iNKT).</li>
	<li>Aby jeszcze bardziej zwiększyć regenerację komórek iNKT, należy odwirować frakcję ujemną przy 300 x g przez 10 minut i powtórzyć kroki 3,6-3,7 z nową kolumną LS lub MS. Połącz frakcje dodatnie i określ liczbę komórek. Zachowaj 50 μl frakcji dodatniej i ujemnej do analizy FACS.</li>
	<li>Sprawdź kroki oczyszczania za pomocą analizy FACS. Próbki obejmują: śledzionę ex-vivo, frakcję wzbogaconą w limfocyty T, frakcję dodatnią iNKT i frakcję ujemną iNKT. Wybarwić ogniwa za pomocą: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC i DAPI. 
	UWAGA: Oczekiwany odzysk z jednej myszy iVα14-Jα18 to 2x106 komórek iNKT.</li>
</ol>
4. Aktywacja i ekspansja komórek iNKT
<ol>
	<li>Aktywuj oczyszczone komórki iNKT za pomocą mysich kulek magnetycznych anty-CD3/CD28 z aktywatorem T w stosunku 1:1.
	<ol>
		<li>Odwirować frakcję dodatnią komórki iNKT przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>W międzyczasie przenieś odpowiednią objętość kulek magnetycznych anty-CD3/CD28 do probówki i dodaj równą objętość PBS, wiruj przez 5 sekund. Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę i wyrzuć supernatant.</li>
		<li>Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś umyte kulki magnetyczne w odpowiedniej objętości kompletnego RPMI (pożywka RPMI 1640, 10% inaktywowany termicznie FCS, 1 mM pirogronian sodu, 1% Aminokwasy endogenne, 10 U/ml penicyliny i streptomycyny, 50 μM β-merkaptoetanolu), aby uzyskać 5 x 105 komórek iNKT w 1 ml. Użyj tej zawiesiny do ponownego zawieszenia odwirowanej frakcji dodatniej iNKT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płytka 1 ml zawiesiny komórek (5 x 10 5 komórek iNKT) i kulki magnetyczne anty-CD3/CD28 na 48-dołkowej płytce z 20 U/ml IL-2 i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 5 dniach dodać 10 ng/ml IL-7.</li>
	<li>Podziel komórki 1:2, gdy osiągną 80-90% zbieżności, zawsze dodawaj 20U/ml IL-2 i 10 ng/ml IL-7. W takich warunkach komórki iNKT mogą być rozprężane przez okres do 15 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+killer+T+%28NKT%29+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1%28-%29CD4%28%2B%29+CD1d-dependent+precursor+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li>
<li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li>
<li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li>
<li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li>
<li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+CD40%2FFas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li>
<li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li>
<li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L%2B+NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li>
<li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li>
<li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-party+CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4%2BCD25%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li>
<li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li>
<li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li>
<li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735(2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li>
<li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma%3A+A+Phase+I+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li>
<li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Poniżej przedstawiamy powtarzalny i wykonalny protokół uzyskiwania milionów gotowych do użycia komórek iNKT. Ze względu na niedostatek tych komórek in vivo, metoda ich namnażania była bardzo potrzebna. Proponowany przez nas protokół nie wymaga ani specjalnego oprzyrządowania, ani dużej liczby myszy. Celowo wykorzystaliśmy transgeniczne myszy iVα14-Jα18, aby zmniejszyć liczbę myszy potrzebnych do zabiegu.
Inny udany protokół ekspansji komórek iNKT z transgenicznych myszy iVα14-Jα18 jest dostępn...

Niezmiennicze limfocyty T NK (komórki iNKT) to wrodzone limfocyty T, które wyrażają pół-niezmienny receptor limfocytów T αβ (TCR), utworzony u myszy przez niezmienny łańcuch Vα14-Jα18 sparowany z ograniczonym zestawem różnorodnych łańcuchów Vβ1, który jest specyficzny dla antygenów lipidowych prezentowanych przez cząsteczkę pokrewną MHC klasy I CD1d2. Komórki iNKT przechodzą program selekcji agonistycznej, w wyniku którego dochodzi do uzyskania aktywowanego/wrodzonego fenotypu efektorowego już w grasicy, co zachodzi w kilku etapach dojrzewania3,4, wytwarzając podzbiór CD4+ i CD4-. Dzięki temu programowi komórki iNKT uzyskują odrębne fenotypy efektorowe T pomocnicze (TH), a mianowicie TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) i TH17 (iNKT17), identyfikowalne przez ekspresję czynników transkrypcyjnych T-bet, GATA3, PLZF i RORγt, odpowiednio5. Komórki iNKT rozpoznają szereg lipidów mikrobiologicznych, ale są również samoreaktywne wobec endogennych lipidów, które są regulowane w górę w kontekście patologicznych sytuacji stresu komórkowego i uszkodzenia tkanek, takich jak rak i autoimmunizacja2. Po aktywacji komórki iNKT modulują funkcje innych wrodzonych i adaptacyjnych komórek efektorowych układu odpornościowego poprzez bezpośredni kontakt i produkcję cytokin2.
Badania komórek iNKT zostały ułatwione przez modele mysie, w tym myszy z niedoborem CD1d lub Jα18, oraz przez produkcję tetramerów CD1d naładowanych antygenem oraz generowanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) specyficznych dla ludzkiego półniezmiennego TCR. Jednak wygenerowanie pierwotnej linii komórek iNKT myszy okazało się trudne. Aby lepiej scharakteryzować funkcje przeciwnowotworowe komórek iNKT i wykorzystać je do adoptywnej terapii komórkowej, opracowaliśmy protokół oczyszczania i ekspansji komórek iNKT śledziony transgenicznych myszy iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, w którym komórki iNKT występują 30 razy częściej niż u myszy typu dzikiego.
Rozszerzone komórki iNKT mogą być wykorzystane do testów in vitro oraz in vivo po przeniesieniu z powrotem do myszy. W tym ustawieniu, na przykład, pokazaliśmy ich silne działanie przeciwnowotworowe7. Co więcej, ekspandowane in vitro komórki iNKT są podatne na modyfikację funkcjonalną poprzez transfer lub edycję genów przed ich wstrzyknięciem in vivo8, co pozwala na wnikliwą analizę funkcjonalną szlaków molekularnych, a także toruje drogę dla zaawansowanych terapii komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Roztwór chlorku amonu i potasu (ACK)</td><td>w domu</td><td></td><td>0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2-7,4</td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD19 -FITC</td><td>Biolegend</td><td>115506</td><td>klon 6D5</td></tr><tr><td>CD1d-tetramer -PE</td><td>NIH tetramer rdzeń mysz</td><td></td><td>PBS57-Cd1d-tetramery</td></tr><tr><td>CD4 -PeCy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td>100528 klon RM4-5</td></tr><tr><td>Fc bloker</td><td>BD Bioscience</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0186L</td><td>inaktywowany termicznie i przefiltrowany .22 przed użyciem</td></tr><tr><td>Bufor barwiący czynnik transkrypcyjny FOXP3</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>H2 (IAb) -FITC</td><td>Biolegend</td><td>114406</td><td>klon AF6-120.1</td></tr><tr><td>hrIL-2</td><td>Chiron Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>LD Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LS</td> Bufor <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS (MB)</td><td>w domu</td><td></td><td>0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA; Sigma-Aldrich) i 2Mm EDTA</td></tr><tr><td>MS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i streptomycyna (Pen-Strep)</td><td>Lonza</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PermWash</td><td>BD Bioscience</td><td>51-2091KZ</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany fosforanem sól fizjologiczna (PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji (30 &mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rekombinowana IL-7</td><td>R& D System</td><td>407-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 z glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; -APC</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td>klon H57-597</td></tr><tr><td>&alpha; CD3CD28 mysz Aktywator T Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów t nk do badań in vitro i in vivo

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Niezmienne limfocyty T naturalnych zabójców (iNKT) to limfocyty T podobne do wrodzonych, wyrażające konserwatywny pół-niezmienny receptor limfocytów T (TCR) specyficzny dla własnych lub mikrobiologicznych antygenów lipidowych prezentowanych przez niepolimorficzną cząsteczkę CD1d klasy I związaną z MHC. Badania przedkliniczne i kliniczne potwierdzają rolę komórek iNKT w raku, autoimmunizacji i chorobach zakaźnych. Komórki iNKT są bardzo konserwatywne u wszystkich gatunków, a ich badanie zostało ułatwione przez modele mysie. w tym myszy z niedoborem CD1d lub iNKT oraz możliwość ich jednoznacznego wykrycia u myszy i mężczyzn z tetramerami CD1d lub mAb specyficznymi dla półniezmiennego TCR. Jednak komórki iNKT są rzadkie i muszą zostać rozszerzone, aby osiągnąć liczbę możliwą do opanowania w każdym badaniu. Ponieważ generowanie pierwotnej mysiej linii komórkowej iNKT in vitro okazało się trudne, opracowaliśmy solidny protokół oczyszczania i namnażania komórek iNKT śledziony z transgenicznych myszy iVα14-Jα18 (iVα14Tg), u których komórki iNKT występują 30 razy częściej. Pokazujemy tutaj, że pierwotne komórki iNKT iVα14Tg śledziony można wzbogacić w procesie separacji immunomagnetycznej, uzyskując około 95-98% czystych komórek iNKT. Oczyszczone komórki iNKT są stymulowane przez kulki anty-CD3/CD28 oraz IL-2 i IL-7, co powoduje 30-krotną ekspansję hodowli do dnia +14 o czystości 85-99%. Rozszerzone komórki iNKT mogą być łatwo manipulowane genetycznie, co stanowi nieocenione narzędzie do analizy mechanizmów aktywacji i funkcji in vitro oraz, co ważniejsze, również podczas transferu adoptywnego in vivo.

Protokół opisany w niniejszym manuskrypcie umożliwia wzbogacenie populacji komórek iNKT z śledziony myszy transgenicznych iVa14-Ja18 poprzez proces immunomagnetycznej separacji przedstawiony w Rycina 1ACałkowitą populację limfocytów T śledziony poddaje się najpierw selekcji negatywnej poprzez usunięcie limfocytów B i monocytów, a następnie pozytywnej selekcji immunomagnetycznej komórek iNKT z wykorzystaniem tetramerów CD1d obciążonych antygenem lipidowym PBS-57, które umożliwiają specyficzne...

Opisujemy szybki i solidny protokół wzbogacania niezmiennych komórek T natural killer (iNKT) ze śledziony myszy i rozszerzania ich in vitro do odpowiedniej liczby dla badań in vitro i in vivo.

Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Protokół ten umożliwia oczyszczanie limfocytów T INK, które są bardzo rzadkie, i pozwala na 30-krotne zwiększenie ich liczby. Oczyszczanie można przeprowadzić w ciągu jednego dnia i w ciągu dwóch tygodni wytworzyć dużą liczbę gotowych do użycia limfocytów T INK do badań in vivo i in vitro. Procedurę zademonstruje Gloria Delfanti, post-doc w laboratorium.Po wycięciu śledziony myszy rozbij ją przez sitko komórkowe o długości 70 nanometrów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki w 10 mililitrach PBS z 2% FBS. Wirować przy 300 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z jednym mililitrem sterylnego buforu lizyny potasowej chlorku amonu.Inkubować komórki przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie zablokować pięcioma mililitrami PBS z 2% FBS. Wirować przy 300 razy G przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach PBS z 2% FBS i usunąć pozostałości tłuszczu przez pipetowanie.Do etapów wzbogacania utrzymuj komórki w niskiej temperaturze i używaj roztworów wstępnie schłodzonych w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przechowywanych na lodzie. Wirować przy 300 razy G przez pięć minut. Ponownie zawiesić wszystkie komórki w odpowiedniej ilości PBS z blokerem 2% FPS i Fc i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Przemyć jednym do dwóch mililitrów buforu separacyjnego MACS na 10 milionów komórek i odwirować w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Po usunięciu supernatantu wybarwić komórki CD19-FITC i H2-IAb-FITC i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza. Umyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów buforu MACS na 10 milionów komórek i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut.Usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 90 mikrolitrach buforu MACS na 10 milionów komórek. Dodaj 10 mikrolitrów mikrogranulek anty-FITC na 10 milionów komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w ciemności w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza.Umyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów buforu MACS na 10 milionów komórek i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Usuń supernatant i ponownie zawieś do 125 milionów komórek w 500 mikrolitrach buforu MACS. Umieść kolumnę LD w polu magnetycznym separatora MACS.Aby uniknąć zatkania, nałóż filtr wstępnej separacji na kolumnę LD i przepłucz ją dwoma mililitrami buforu MACS. Nałóż zawiesinę komórek na filtr i zbierz nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę. Umyj pusty zbiornik kolumny trzykrotnie jednym mililitrem buforu MACS.Zbierz ścieki wzbogacone w limfocyty T i policz komórki, zachowując 50 mikrolitrów do analizy FACS. Po odwirowaniu w temperaturze 300 razy G przez pięć minut, usunąć supernatant i wybarwić komórki tetramerem PE CD1d. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w ciemności na lodzie.Umyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów buforu MACS na 10 milionów komórek. Po odwirowaniu przy 300 razy G przez 10 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 80 mikrolitrach buforu MACS na 10 milionów komórek. Dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek anty-PE na 10 milionów komórek.Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w ciemności w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza. Umyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów buforu MACS na 10 milionów komórek i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Usuń supernatant i ponownie zawieś do 100 milionów komórek w 500 mikrolitrach bufora MACS.W zależności od liczby komórek umieść kolumnę LS lub MS w polu magnetycznym separatora MACS i przepłucz kolumnę buforem MACS. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę, zbierz nieoznakowane komórki, które przez nią przechodzą i umyj kolumnę trzy razy, jak opisano wcześniej. To jest ułamek ujemny.Usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na nowej probówce zbiorczej. Odpipetować bufor MACS na kolumnę i wcisnąć dostarczony tłok do kolumny, aby wypłukać frakcję dodatnią wzbogaconą w limfocyty T INK. Aby jeszcze bardziej zwiększyć odzysk limfocytów T INK, odwiruj frakcję ujemną przy 300 razy G przez 10 minut i powtórz poprzednie kroki z nową kolumną LS lub MS.Wyciągnij frakcje dodatnie i określ liczbę komórek. Zachowaj 50 mikrolitrów zarówno frakcji dodatniej, jak i ujemnej do analizy FACS w celu sprawdzenia czystości. Aby aktywować limfocyty T INK w stosunku jeden do jednego, przenieś odpowiednią objętość kulek magnetycznych anty-CD3 i CD28 do probówki i przy równej objętości PBS, a następnie wiruj przez pięć sekund.Umieścić probówkę na magnesie na jedną minutę i wyrzucić supernatant. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś umyte kulki magnetyczne w odpowiedniej objętości RPMI. Odwiruj oczyszczone limfocyty T INK w temperaturze 300 razy G przez pięć minut i wymieszaj je z mysim aktywatorem T anty-CD3 lub kulkami magnetycznymi CD28.Umieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej, kulki magnetyczne anty-CD23 i CD28 na 48-dołkowej płytce z 20 jednostkami na mililitr IL-2, a następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu dniach dodaj 10 nanogramów na mililitr IL-7. Podziel komórki na pół, gdy osiągną 80 do 90% zbieżności, zawsze dodając 20 jednostek na mililitr IL-2 i 10 nanogramów na mililitr IL-7.W tych warunkach limfocyty T INK mogą być rozprężane przez okres do 15 dni. Korzystając z tego protokołu, limfocyty T INK są wzbogacane ze śledziony myszy transgenicznych w procesie separacji immunomagnetycznej. Po wzbogaceniu komórki mogą być namnażane za pomocą kulek anty-CD3 i CD28, co skutkuje 30-krotnym rozszerzeniem średnio do 14 dnia hodowli.Silna aktywacja kulkami anty-CD3 i anty-CD indukowała regulację w dół ekspresji TCR komórek T IMK na powierzchni komórki i pojawiła się populacja podwójnie ujemna. Większość ekspandowanych limfocytów T INK jest CD4-ujemna. Charakterystyka specyficznych dla linii czynników transkrypcyjnych PLZF i ROR gamma T umożliwiła identyfikację fenotypów NKT1, NKT2 i NKT17 na wzbogaconych limfocytach T INK w dniu zero i 14.Wzbogacone limfocyty T INK wykazują fenotyp efektorowy podobny do T80, który jest zachowany po 14 dniach ekspansji, co potwierdza wydzielanie zarówno interferonu gamma, jak i IL-4 po stymulacji PMA i jonomycyny. Podczas etapów oczyszczania należy pamiętać o szybkiej pracy z wstępnie schłodzonymi roztworami i pozbyciu się wszelkich pozostałości tłuszczu, które mogą być widoczne podczas pipetowania. Ekspandowane limfocyty T INK mogą być wykorzystywane do testów in vitro i transferów in vivo do myszy, nawet po modyfikacjach funkcjonalnych poprzez transfer lub edycję genów.Ekspansja in vitro limfocytów T INK pokonuje ograniczenia wynikające z niedoboru, dzięki czemu można je wykorzystać w badaniach przedklinicznych w dziedzinie nadzoru immunologicznego nowotworów, chorób zakaźnych i autoimmunizacji.

purification-expansion-mouse-invariant-natural-killer-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Ten film pokazuje izolację limfocytów, w tym komórek NK lub komórek NK, z ludzkiej tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji. Trawienie enzymatyczne i mechaniczne, po którym następuje separacja w gradieniu gęstości, sprzyja izolacji limfocytów, w tym komórek NK. Pobrane limfocyty mogą być dalej wykorzystywane do selektywnej ekspansji komórek NK.

Izolacja komórek NK z tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji

Ten film ilustruje metodę izolowania niezmiennych limfocytów T NK, znanych również jako komórki iNKT. Zabieg rozpoczyna się od wstrzyknięcia syntetycznego glikolipidu myszowi w celu stymulacji aktywacji i proliferacji komórek iNKT w śledzionie. Następnie przygotowuje się zawiesiny jednokomórkowe ze śledziony i inkubuje z kompleksami rozpoznającymi komórki iNKT znakowanymi fluoroforami, a następnie rozdziela się za pomocą kulek magnetycznych w celu wyizolowania komórek iNKT.

Izolowanie niezmiennych limfocytów T NK z modelu mysiego

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Tutaj prezentujemy dostosowany protokół, który może być użyty do wygenerowania dużej liczby mysich niezmiennych limfocytów T NK z mysiej śledziony. W protokole przedstawiono podejście, dzięki któremu komórki iNKT śledziony mogą być wzbogacane, izolowane i namnażane in vitro przy użyciu ograniczonej liczby zwierząt i odczynników.

Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę oczyszczania i namnażania mysich niezmiennych limfocytów T NK z jednodniową puryfikacją i 30-krotnym zwiększeniem liczby komórek w ciągu dwóch tygodni.

Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów