Name: Test fizjologii termicznej w terenie: odzyskiwanie po szoku zimna w warunkach otoczenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj niskokosztową metodę badania odzyskiwania po szoku zimna u motyli w warunkach terenowych. Protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały i pozwala analizować odpowiedzi fizjologiczne w różnych warunkach środowiskowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Jareta Danielsa, Isabelli Plummer, Bretta Scheffersa i Dana Hahna za informacje na temat protokołu, który został po raz pierwszy opracowany. Dodatkowe podziękowania dla Jaime Haggarda, Sebastiána Durána i Indiany Cristóbala Róisa-Málavera za wdrożenie kilku iteracji tego protokołu i za wkład w kluczowe komponenty. Podziękowania należą się również anonimowemu recenzentowi za opinie na temat manuskryptu jako całości. Wsparcie zostało zapewnione przez McGuire Center for Lepidoptera i fundusz wydawniczy Biodiversity, College of Agricultural and Life Sciences, School of Natural Resources and Environment oraz wydział Ekologii i Ochrony Dzikiej Przyrody na UF.

1. Identyfikacja interesujących gatunków
<ol>
	<li>Zidentyfikuj interesujące Cię gatunki, aby określić czas regeneracji po szoku zimnym. Należy pamiętać, że każda grupa będzie się różnić pod względem czasu potrzebnego do wywołania śpiączki chłodnej (tj. punktu, w którym owad jest nadal żywy, ale nie porusza się i nie reaguje). Podobnie, w oparciu o organizm i wykorzystanie danych, należy wybrać różne punkty odcięcia, w których należy przerwać eksperyment, jeśli osobnik (osobniki) główny (główne) nie latają (patrz sekcja 4). 
	UWAGA: Ten protokół został zaprojektowany i opracowany do stosowania na Lepidoptera. Ma jednak zastosowanie do dużych, wolantowych, lądowych owadów, w szczególności tych, które mogą być przechowywane płasko w szklanych otoczkach ograniczających ruch i uszkadzających (np. motyle i ważki/ważki).</li>
</ol>
2. Przeprowadzenie postępowania przygotowawczego
<ol>
	<li>Przeprowadź postępowanie przygotowawcze na małej próbie osób w celu określenia kluczowych parametrów. Postępuj zgodnie z sekcjami od 3 do 5 poniższego protokołu z 5-10 osobami w celu przeprowadzenia postępowania przygotowawczego.
	<ol>
		<li>Przetestuj czas potrzebny na lodzie do wywołania śpiączki chłodnej (nie poruszania się), ale nie zabicia gatunków ogniskowych, wykonując krok 5.1, stosując zabiegi trwające 30 minut, 60 minut i 90 minut 
		UWAGA: Czas potrzebny do wywołania śpiączki chłodnej będzie zależał od wielkości, lokalizacji i historii naturalnej/zachowania osobników.</li>
		<li>Opierając się na wynikach kroków 4.1-4.4 i wykorzystując wiedzę na temat ekologii owadów ogniskowych, wybierz czas, w którym zakończy się badanie, jeśli dana osoba nie osiągnie pełnego wyzdrowienia. Oprzyj tę granicę czasową również na ekologii gatunku, pamiętając, że po wielu minutach niezdolności do lotu wiele owadów jest przestarzałych. 
		UWAGA: Na przykład, jeśli większość prób wstępnych kończy się lotem po 15 minutach, można zdecydować się na zakończenie prób po 25 minutach, aby upewnić się, że nawet wartości odstające mają szansę na pełne wyzdrowienie (tj. lot). Protokół ten opiera się na 30-minutowym czasie granicznym (krok 5.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykorzystaj parametry z danych przedprocesowych, aby poinformować o gromadzeniu danych na potrzeby eksperymentów. Zmodyfikuj protokół opisany poniżej w oparciu o potrzeby organizmów ogniskowych, w tym czas przebywania w zawiesinie lodowej, czas, w którym należy zakończyć próby, oraz zachowania udokumentowane w arkuszu danych (np. dreszcze mogą być nieodpowiednim zachowaniem dla wybranego owada).
	<ol>
		<li>Zdefiniuj konkretne pytania badawcze, na które należy odpowiedzieć za pomocą tych danych, jednocześnie doprecyzowując parametry. 
		UWAGA: Na przykład, jeśli badacz jest zainteresowany wpływem długotrwałej ekspozycji na regenerację, czas przebywania w lodzie jest kluczową zmienną do modyfikacji. Jeśli naukowcy są zainteresowani różnicami w fizjologii między gatunkami o jasnym i ciemnym umaszczeniu, mogą wybrać dwa gatunki o wyraźnym kolorze lub zmodyfikować kolor skrzydeł owada, aby zmierzyć wpływ koloru skrzydeł na czas regeneracji. Co ważne, metoda ta jest w dużym stopniu dostosowywana do potrzeb i stawianych pytań badawczych (patrz sekcja dyskusji).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kolekcja owadów
<ol>
	<li>Zbieraj owady przy użyciu odpowiednich metod, takich jak pułapki z przynętą i sieci entomologiczne (rysunek uzupełniający 1). Po pobraniu umieść każdą osobę w osobnej kopercie szklanej z unikalnym identyfikatorem.</li>
	<li>Przechowuj zwierzęta w zacienionym, chłodnym miejscu po schwytaniu i przed wystawieniem na eksperyment z szokiem zimnym. Zawsze wystawiaj zwierzę na eksperymentalne leczenie w ciągu 24 godzin od schwytania i ustandaryzuj ten czas w jak największym stopniu między próbami.
	<ol>
		<li>Chociaż warunki przechowywania mogą się różnić, trzymaj owady z dala od bezpośredniego światła słonecznego. Jeśli to możliwe, umieść je w pomieszczeniu w chłodnym, ciemnym pomieszczeniu.</li>
		<li>Na polu upewnij się, że podczas przechowywania będą zacienione i chronione przed wiatrem (zdmuchiwaniem) i innymi drapieżnikami owadzimi, które mogą dostać się do kopert.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotuj eksperyment z zimnym szokiem
<ol>
	<li>Napełnij lodówkę lodem i wodą. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość lodu, aby przetrwać przez co najmniej jedną godzinę i w razie potrzeby dodawaj lód okresowo, aby utrzymać środowisko w wodzie w temperaturze 0 °C.</li>
	<li>Wybierz od 1 do 4 osób centralnych do rundy eksperymentów, upewniając się, że każda osoba jest możliwa do zidentyfikowania.
	<ol>
		<li>W przypadku korzystania z wielu gatunków należy użyć tylko jednego z nich, aby uniknąć mylenia osobników w arkuszu danych. Jeśli eksperymentujesz tylko z jednym gatunkiem, używaj tylko osobników, które można łatwo odróżnić, na przykład po złamanym skrzydle lub wyraźnym oznaczeniu.</li>
		<li>Jeśli cel eksperymentu nie jest związany z ubarwieniem skrzydeł, oznacz skrzydła unikalnymi identyfikatorami (np. numerami) cienkim markerem z filcową końcówką, aby odróżnić osobniki.</li>
		<li>Jeśli eksperymenty nie spełniają żadnego z powyższych kryteriów, przeprowadź eksperyment na jednej osobie na raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypełnić wiersze arkusza danych informacjami odnoszącymi się do każdego badanego owada, w tym jego niepowtarzalnym identyfikatorem i użytecznym identyfikatorem w uwagach, takimi jak nazwa gatunku lub cecha wyróżniająca (tabela uzupełniająca 1).</li>
	<li>Umieść wszystkie osoby ogniskowe (nadal w indywidualnie oznaczonych kopertach) w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie z ciężarkiem (Tabela Materiałów) i umieść torbę w lodowatej wodzie na 60 minut (lub do momentu wywołania śpiączki chłodniczej; patrz dyskusja) (Rysunek Uzupełniający 2).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że waga jest ciężka (np. duże monety, duże podkładki lub gładkie kamienie) i wystarczająco duża, aby torba z owadami była zanurzona w lodowatej wodzie i prostopadła do powierzchni wody. Użyj obciążnika, który nie powoduje przecieków w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie. 
		UWAGA: Podczas gdy owady są nadal w stanie się zregenerować, jeśli są wystawione bezpośrednio na działanie wody w zanurzeniu, mokre koperty komplikują usunięcie każdego osobnika. Najlepiej jest, aby owady były suche w torbie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestruj dane dotyczące temperatury i światła.
	<ol>
		<li>Użyj rejestratora danych (patrz Tabela materiałów), aby zarejestrować dane dotyczące temperatury otoczenia i światła, wykonując krok 5.1 lub 5.2.
		<ol>
			<li>Zaprogramuj rejestrator danych tak, aby zbierał dane o temperaturze i świetle w odstępach 10 sekund, zaczynając od czasu, gdy owady zostaną uwolnione.</li>
			<li>Oprzyj czas uruchomienia rejestratora danych na momencie, w którym owady zostały umieszczone w lodowatej wodzie. Upewnij się, że informacje z rejestratora danych (data, godzina) są zsynchronizowane, aby dane dotyczące warunków otoczenia mogły być później dopasowane do każdego indywidualnego owada ogniskowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj prostego termometru, aby ręcznie rejestrować dane dotyczące temperatury i światła w krótkich odstępach czasu (przez drugiego badacza).
		<ol>
			<li>Zdecyduj o parametrach eksperymentalnych, które chcesz powiązać z czasem odzyskiwania, które można zmierzyć bez rejestratora danych. Stosuj różne zabiegi: cień/słońce; zmierzch/południe.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść siatkową klatkę dla owadów w odpowiednim miejscu, tak aby temperatura i światło były jak najbardziej jednorodne w klatce oraz aby podstawa klatki była podniesiona i mogła być stukana przez obserwatora.</li>
	<li>Umieść rejestrator danych na zewnątrz klatki lub wewnątrz klatki, aby nie został przewrócony lub w inny sposób dotknięty niewielkimi ruchami wewnątrz klatki. Jeśli nie korzystasz z rejestratora danych, ustaw odpowiednio termometr i/lub ustaw klatki w odpowiedniej konfiguracji. 
	UWAGA: Rejestrator danych musi być umieszczony w taki sposób, aby rejestrowane warunki otoczenia były jak najbardziej zbliżone do tych, których doświadcza owad.</li>
</ol>
5. Rozpocznij eksperyment z zimnym szokiem
<ol>
	<li>Wyjąć zwierzęta z lodowatej kąpieli wodnej po 60 minutach (lub czasie uznanym za właściwy; patrz wyżej). Natychmiast wyjmij owady z plastikowej torby i wyjmij każdą osobę z koperty tak szybko, jak to możliwe, minimalizując przy tym obsługę (rysunek uzupełniający 3).</li>
	<li>Uruchom stoper, gdy tylko zwierzęta znajdą się w klatkach siatkowych (patrz przykładowe dane, tabela uzupełniająca 1).</li>
	<li>Postukaj ołówkiem w podstawę klatki, aby poruszyć regenerujące się owady. 
	UWAGA: Dostarczanie bodźców podczas rekonwalescencji zapewnia, że owady ogniskowe wykazują stan regeneracji i zachowania, gdy tylko są do tego fizjologicznie zdolne (Dodatkowe wideo).
	<ol>
		<li>Stukaj często i wystarczająco mocno, aby upewnić się, że zwierzę zareaguje, jeśli to możliwe, ale nie spowoduje reakcji. 
		UWAGA: Na przykład, podczas stukania w klatkę, jeśli zwierzę zostanie katapultowane w powietrze i wyląduje w pozycji pionowej, ale nie porusza się, aby samodzielnie stać, nie jest to uważane za zachowanie "stojące", ponieważ organizm w rzeczywistości nie stał samodzielnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz próbę jako zakończoną, gdy dana osoba odbyła lot (tj. wykazała, że w pełni wyzdrowiała). Zakończ próbę i uznaj, że owad osiągnął pełne wyzdrowienie, jeśli nie porusza się po 30 minutach.</li>
	<li>Usuń owady z klatki siatkowej i umieść osobniki z powrotem w oznaczonych kopertach pergaminowych. Uwolnić zwierzęta lub zatrzymać je w celu dalszego gromadzenia danych (np. indywidualnych cech wielkości, wagi).</li>
	<li>Jeśli korzystasz z rejestratora danych, przerwij zbieranie danych z rejestratora danych i zapisz plik danych o temperaturze i świetle podczas eksperymentu z odpowiednimi informacjami o dacie/godzinie.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Wprowadź dane przedstawione z arkusza danych do arkusza kalkulacyjnego (np. MS Excel).</li>
	<li>Jeśli korzystasz z rejestratora danych, dodaj dane dotyczące temperatury i światła dla każdej odpowiedzi każdej badanej osoby.
	<ol>
		<li>Oblicz średnią i odchylenie standardowe temperatury i światła dla każdego zachowania każdej osoby. 
		UWAGA: Ponieważ rejestrator danych rejestruje dane co 10 sekund, jeśli zachowanie w pozycji stojącej dla jednego zwierzęcia trwało 48 sekund, użyj pierwszych 5 wpisów z rejestratora danych dla tej próby.</li>
		<li>Powiąż każde zachowanie regeneracyjne każdej osoby z danymi abiotycznymi zarejestrowanymi przez rejestrator danych, zaokrąglając w górę lub w dół do 10 sekund w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kreślenie i analizowanie danych. Rysunek 1, na przykład, przedstawia wpływ temperatury i światła na czas regeneracji po szoku zimnym. Zbierz inne istotne dane (cechy gatunków, regionalne cechy siedlisk), aby zbadać ekologiczne i ewolucyjne wzorce cech fizjologicznych badanych grup. 
	UWAGA: Rysunek 1 został narysowany przy użyciu pakietu ggplot2 w R. Poziom szczegółowości danych dotyczących warunków otoczenia będzie się różnił w zależności od przyrządów używanych do pomiaru warunków otoczenia. Jeśli używany jest rejestrator danych, można wygenerować rysunki o szczegółowości porównywalnej do Rysunek 2. Jeśli używany jest termometr, badacz nie będzie w stanie stworzyć wykresu opartego na świetle otoczenia. Podobnie, jeśli badacze używają kategorii światła lub temperatury, te wykresy rozrzutu można przekształcić w wykresy skrzynkowe lub inny odpowiedni szablon do zilustrowania tych zjawisk.</li>
</ol>

<ol><li>Huey, B., Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+thermal+physiology+and+ecology+of+ectotherms+a+discussion+of+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22American+Zoologist%22%5BJournal%5D)">Integrating thermal physiology and ecology of ectotherms a discussion of approaches.</a> American Zoologist. 19 (1), 357-366 (1979).</li>
<li>Huey, R. B., Slatkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+and+benefits+of+lizard+thermoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Quarterly+Review+of+Biology%22%5BJournal%5D)">Cost and benefits of lizard thermoregulation.</a> The Quarterly Review of Biology. 51 (3), 363-384 (1976).</li>
<li>Kingsolver, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butterfly+thermoregulario%3A+Organismic+mechanisms+and+population+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Research+on+the+Lepidoptera%22%5BJournal%5D)">Butterfly thermoregulario: Organismic mechanisms and population consequences.</a> Journal of Research on the Lepidoptera. 24, 1-20 (1985).</li>
<li>Kingsolver, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+coadaptation+of+thermoregulatory+behavior+and+wing+pigmentation+pattern+in+pierid+butterflies%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution and coadaptation of thermoregulatory behavior and wing pigmentation pattern in pierid butterflies.</a> Evolution. 41 (3), 472-490 (1987).</li>
<li>Kingsolver, J. G., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+analyses+of+morphological+and+physiological+plasticity+in+thermally+variable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22American+Zoologist%22%5BJournal%5D)">Evolutionary analyses of morphological and physiological plasticity in thermally variable environments.</a> American Zoologist. 38, 545-560 (1998).</li>
<li>Malhi, Y., Wright, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+patterns+and+recent+trends+in+the+climate+of+tropical+rainforest+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Spatial patterns and recent trends in the climate of tropical rainforest regions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359 (1443), 311-329 (2004).</li>
<li>Sears, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Configuration+of+the+thermal+landscape+determines+thermoregulatory+performance+of+ectotherms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Configuration of the thermal landscape determines thermoregulatory performance of ectotherms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10595-10600 (2016).</li>
<li>Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+invitation+to+measure+insect+cold+tolerance%3A+Methods%2C+approaches%2C+and+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow.</a> Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).</li>
<li>Angilletta, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAngilletta%2C+M+%22Thermal+adaptation%3A+a+theoretical+and+empirical+synthesis%22">Thermal adaptation: a theoretical and empirical synthesis</a>. , Oxford University Press. (2009).</li>
<li>Perkins-Kirkpatrick, S. E., Gibson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+regional+heatwave+characteristics+as+a+function+of+increasing+global+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Changes in regional heatwave characteristics as a function of increasing global temperature.</a> Scientific Reports. 7, 12256(2017).</li>
<li>Frishkoff, L. O., Hadly, E. A., Daily, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+niche+predicts+tolerance+to+habitat+conversion+in+tropical+amphibians+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Change+Biology%22%5BJournal%5D)">Thermal niche predicts tolerance to habitat conversion in tropical amphibians and reptiles.</a> Global Change Biology. 21 (11), 3901-3916 (2015).</li>
<li>Nowakowski, A. J., Otero Jiménez, B., Allen, M., Diaz-Escobar, M., Donnelly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+resistance+to+movement+of+the+poison+frog%2C+Oophaga+pumilio%2C+in+the+lowlands+of+northeastern+Costa+Rica%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Conservation%22%5BJournal%5D)">Landscape resistance to movement of the poison frog, Oophaga pumilio, in the lowlands of northeastern Costa Rica.</a> Animal Conservation. 16 (2), 188-197 (2013).</li>
<li>Kingsolver, J. G., Buckley, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+thermal+extremes+and+biological+variation+to+predict+evolutionary+responses+to+changing+climate%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantifying thermal extremes and biological variation to predict evolutionary responses to changing climate.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 372 (1723), 20160147(2017).</li>
<li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+variation%2C+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218, 1956-1967 (2015).</li>
<li>Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+thermal+performance+among+insect+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">Variation in thermal performance among insect populations.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).</li>
<li>Gotcha, N., Terblanche, J. S., Nyamukondiwa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+cross-tolerance+to+heterogeneous+environments%3A+divergent+stress+responses+co-evolved+in+an+African+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity and cross-tolerance to heterogeneous environments: divergent stress responses co-evolved in an African fruit fly.</a> Journal of Evolutionary Biology. 31 (1), 98-110 (2018).</li>
<li>Mutamiswa, R., Chidawanyika, F., Nyamukondiwa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+basal+and+plastic+thermal+responses+to+environmental+heterogeneity+in+invasive+exotic+stemborer+Chilo+partellus+Swinhoe+over+indigenous+Busseola+fusca+%28Fuller%29+and+Sesamia+calamistis+Hampson%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Superior basal and plastic thermal responses to environmental heterogeneity in invasive exotic stemborer Chilo partellus Swinhoe over indigenous Busseola fusca (Fuller) and Sesamia calamistis Hampson.</a> Physiological Entomology. 43 (2), 108-119 (2018).</li>
<li>de Jong, M. A., Saastamoinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+genetic+control+of+cold+tolerance+in+the+Glanville+fritillary+butterfly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Environmental and genetic control of cold tolerance in the Glanville fritillary butterfly.</a> Journal of Evolutionary Biology. 31 (5), 636-645 (2018).</li>
<li>DeVries, Z. C., Kells, S. A., Appel, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+critical+thermal+maximum+%28CTmax%29+of+bed+bugs%2C+Cimex+lectularius%3A+Comparing+thermolimit+respirometry+with+traditional+visual+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+A%2C+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Estimating the critical thermal maximum (CTmax) of bed bugs, Cimex lectularius: Comparing thermolimit respirometry with traditional visual methods.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 197, 52-57 (2016).</li>
<li>De Keyser, R., Breuker, C. J., Hails, R. S., Dennis, R. L. H., Shreeve, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+small+is+beautiful%3A+Wing+colour+is+free+from+thermoregulatory+constraint+in+the+small+lycaenid+butterfly%2C+Polyommatus+icarus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Why small is beautiful: Wing colour is free from thermoregulatory constraint in the small lycaenid butterfly, Polyommatus icarus.</a> PLoS One. 10 (4), 0122623(2015).</li>
<li>Nowakowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropical+amphibians+in+shifting+thermal+landscapes+under+land-use+and+climate+change%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Biology%22%5BJournal%5D)">Tropical amphibians in shifting thermal landscapes under land-use and climate change.</a> Conservation Biology. 31 (1), 96-105 (2017).</li>
<li>Niehaus, A. C., Angilletta, M. J., Sears, M. W., Franklin, C. E., Wilson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+physiological+performance+of+ectotherms+in+fluctuating+thermal+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Predicting the physiological performance of ectotherms in fluctuating thermal environments.</a> Journal of Experimental Biology. 215, 694-701 (2012).</li>
</ol>

Autor nie ma sprzecznych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Badanie fizjologii termicznej obejmuje pomiary gatunków i cech środowiskowych, aby lepiej zrozumieć interakcje między organizmami a ich otoczeniem, które są kluczem do przetrwania i sprawności. Chociaż cechy termiczne zawsze stanowią integralną część zrozumienia historii naturalnej i ekologii roślin i zwierząt, mają one coraz większe znaczenie w obliczu zmian krajobrazu i klimatu11,21. Kilka grup ektotermicznych owadów lądowych, w szczególności Lepidoptera i Odonatan, jest stosunkowo dużych i licznych, wykazuje odrębne zachowania i jest podatnych na manipulacje. Przedstawiono tutaj skuteczny i tani test do skutecznego pomiaru reakcji fizjologicznych takich owadów. Protokół ten wymaga do przeprowadzenia testu ze źródła zdrowych organizmów, których czas pracy przed eksperymentem jest ograniczony. Chociaż liczba organizmów badanych w tym samym czasie jest elastyczna, liczba osobników ogniskowych w jednym eksperymencie będzie się różnić w zależności od celu gromadzenia danych i/lub liczby obserwatorów.
Na przykład protokół ten został opracowany w celu gromadzenia szczegółowych indywidualnych danych na temat motyli w całych społecznościach. W związku z tym reprezentatywne wyniki ilustrują wysiłki zmierzające do maksymalizacji gromadzenia danych dla osobników jak największej liczby gatunków i w różnych warunkach istotnych dla lokalnego środowiska. Niezależnie od liczby gatunków centralnych, ważne jest, aby obserwator był w stanie zidentyfikować każdego osobnika w klatce, który doświadcza powrotu do zdrowia. Jeżeli celem jest zebranie danych tylko od jednego gatunku, wówczas należy jednocześnie przebadać tylko jednego lub dwa osobniki (jeśli można je zidentyfikować na podstawie zużycia różnych skrzydeł lub jeśli są indywidualnie oznakowane). Uczestnicy badania muszą być wybrani zgodnie z konkretnym pytaniem badawczym lub planem studiów. W zależności od postawionego pytania i celu zbierania danych (na przykład badania lub klasa), wielkość próby i zbiór innych cech będą się różnić.
Aby zilustrować podstawowe składniki fizjologii wyjaśnione przez ten protokół (indukcja śpiączki chłodnej, etapy rekonwalescencji, rola warunków otoczenia), instruktor może wybrać dwa odrębne gatunki lub morfy jednego gatunku. Jeśli osoby ogniskowe różnią się tylko jedną kluczową cechą (np. kolorem), konieczna będzie mniejsza próba, a uczniowie mogą dokładnie badać związek między tą cechą a fizjologią organizmu. Naukowcy zainteresowani fizjologią ekologiczną mogą wykorzystać swoje dane eksperymentalne do zbadania złożonych pytań ekologicznych i ewolucyjnych. Badacze muszą upewnić się, że starannie wybierają owady ogniskowe, które bezpośrednio odpowiadają na ich pytania (np. na podstawie etapu życia, wieku, płci, lokalizacji) i, na podstawie liczby zaangażowanych zmiennych, określają odpowiednią wielkość próby. Rozmiary prób dla złożonych modeli będą większe niż te opisane powyżej. 
Podczas zbierania danych dotyczących odzyskiwania behawioralnego ważne jest, aby klatka spoczywała nad ziemią, ponieważ obserwator musi być w stanie dotknąć dna klatki, aby wywołać zachowania regeneracyjne. Gwarantuje to, że organizm reaguje (stoi, lata), gdy tylko jest do tego fizjologicznie zdolny, a końcowe zachowanie regeneracyjne (lot) jest udokumentowane. Rejestrowanie warunków otoczenia podczas rekonwalescencji po szoku zimnym jest integralną częścią badania fizjologii termicznej, ponieważ protokół ten ma na celu badanie i wyjaśnienie roli środowiska w fizjologii organizmu. Rejestratory danych (patrz tabela materiałów) są przydatne do rejestrowania ustandaryzowanych pomiarów odpowiednich warunków (np. temperatury, światła, a nawet wilgotności). Jeśli jednak narzędzia te są niedostępne, odpowiednie warunki można zmierzyć w inny sposób, np. za pomocą termometru cyfrowego lub upraszczając zmienną warunki środowiskowe i stosując różne środowiska, takie jak cień i słońce. Protokół ten daje badaczowi możliwość pomiaru warunków podczas powrotu do zdrowia po szoku zimnym w oparciu o cel i zakres badania.
Chociaż metoda ta może być modyfikowana, aby lepiej odpowiadała określonym grupom taksonomicznym, zaleca się stosowanie dużych, lotnych owadów. Można uznać, że owady latające, które odzyskują zdolność samodzielnego latania, osiągnęły pełną regenerację. Opisana metoda została z powodzeniem zastosowana na motylach w tropikach i subtropikach. Opierając się na trendach termicznych danego obszaru (tj. zakresie temperatur doświadczanych w miejscu, które będą się zmieniać, wpływając w ten sposób na oczekiwania oparte na wysokości, szerokości geograficznej, pokryciu koron drzew), organizm może potrzebować więcej lub mniej niż jednej godziny w kąpieli lodowatej wody, aby wejść w śpiączkę chłodną. Wielkość organizmu może również wpływać na czas potrzebny do wejścia w śpiączkę chłodną. Kluczowe jest znalezienie czasu ekspozycji na zimno niezbędnego do wywołania śpiączki chłodnej (nie poruszania się), ale nie zabicia gatunków ogniskowych. Czas potrzebny do wywołania śpiączki chłodnej będzie zależał od wielkości, lokalizacji i historii naturalnej/zachowania osobników. Opierając się na wynikach opisanego w niniejszym artykule eksperymentu z szokiem zimnym i wykorzystując wiedzę na temat ekologii owadów ogniskowych, wybierz czas zakończenia badania, jeśli dana osoba nie osiągnie pełnego wyzdrowienia. 
Opierając się na konkretnych pytaniach badacza, metoda ta może być stosowana zarówno w terenie, jak i w laboratorium, aby umożliwić zarówno naturalną zmienność środowiska, jak i kontrolę ważnych zmiennych. Test ten jest prosty i niedrogi i pomaga wypełnić istniejące luki w dziedzinie fizjologii termicznej. Łatwość tego protokołu sprawia, że można go stosować do różnych taksonów, otwierając pole do więcej niż organizmów przyjaznych w laboratorium. Nowość polegająca na wykonaniu znormalizowanego, ale termicznego testu w temperaturze otoczenia wypełnia lukę między wynikami laboratoryjnymi a terenowymi22. Wykorzystanie warunków otoczenia do regeneracji organizmów pomoże naukowcom w ustaleniu roli czynników środowiskowych i gatunkowych w fizjologii14,22. Wreszcie, ze względu na niski koszt i brak wymaganych materiałów, protokół ten może być stosowany w odległych lokalizacjach w terenie przy niewielkiej ilości sprzętu - idealny dla wielu biologów terenowych - a także w salach lekcyjnych, aby umożliwić młodym uczniom praktyczną naukę.

Integracja fizjologii termicznej i ekologii pod koniec lat siedemdziesiątych i na początku lat osiemdziesiątych1,2 zapoczątkowała dziedzinę fizjologii ekologicznej. Szeroko zakrojone badania termiczne przeprowadzone na ektotermach podkreślają synergie ekologiczno-fizjologiczne w różnych kontekstach ekoewolucyjnych3,4,5. Badania nad fizjologią termiczną organizmów ektotermicznych zyskały ostatnio na popularności w obliczu zmian klimatycznych i zmienionych krajobrazów termicznych na całym świecie6,7. Oprócz dostarczania informacji do badań w akademickiej dziedzinie fizjologii ekologicznej, testy fizjologii termicznej mogą być szeroko dostępne dla badaczy i mogą służyć jako praktyczne podejście do nauczania na wszystkich poziomach. Składniki wydajności cieplnej, w tym limity termiczne i skutki szoków temperaturowych, mają fundamentalne znaczenie dla ekologii, zachowania i historii życia zwierząt8,9.
Konkretnie, ekonotermy są używane do rozwiązywania problemów fizjologii, ponieważ endotermia dyktuje nierozerwalny związek między temperaturą otoczenia a temperaturą organizmu. Zakres temperatur, które organizmy mogą wytrzymać (ich krytyczny zakres termiczny od minimum do maksimum) oraz temperatury, w których ich zachowania i dopasowanie są maksymalizowane (optimum termiczne), są często zakorzenione w procesach ekologicznych i ewolucyjnych. Te cechy fizjologiczne mają coraz większe znaczenie, ponieważ wzrastają temperatury, zarówno średnie, jak i ekstremalne10. Na przykład zmiany abiotyczne, w tym wzrost temperatury, które towarzyszą niszczeniu i fragmentacji siedlisk, wpłynęły na społeczności ektotermów, w tym anuranów, ograniczając fizjologicznie wrażliwe gatunki (o wąskiej tolerancji termicznej) do małych pozostałości plam siedlisk11,12.
Ocena kluczowych elementów wydajności cieplnej może być kosztowna zarówno pod względem czasu, jak i zasobów, a tradycyjnie wymaga sprzętu laboratoryjnego i standardowych warunków. Co więcej, konwencjonalne testy często nie odzwierciedlają zakresu warunków otoczenia doświadczanych w naturze przez dane zwierzę13, ponieważ temperatura w podobnych eksperymentach fizjologicznych jest dokładnie kontrolowana i często nie ma związku z warunkami otoczenia doświadczanymi przez zwierzę. Ta kontrola temperatury może zmniejszyć zrozumienie różnic w poszczególnych odpowiedziach2,14. Fizjolodzy oparli się na laboratoryjnych eksperymentach z ogrzewaniem i chłodzeniem, wykorzystując programowalne kąpiele wodne do stałego ogrzewania lub chłodzenia otoczenia zwierzęcia w celu uzyskania informacji na temat krzywych wydajności termicznej15.
Zazwyczaj, zwierzęta są umieszczane w fiolkach z termoparą, a ich temperatura otoczenia jest stale zmieniana poprzez kontrolowanie temperatury otaczającej łaźni wodnej. Badacze mierzą czas potrzebny do osiągnięcia zmienionego stanu fizjologicznego (np. śpiączka chłodząca, powalenie) oraz temperaturę, w której nastąpiła zmiana statusu16,17. Już od minimum 500 USD narzędzia te są duże, ciężkie i wymagają dodatkowego sprzętu technicznego (np. komputera, termopar). W związku z tym podstawowe narzędzia do przeprowadzania klasycznych metod oceny wydajności cieplnej są: 1) niedostępne ekonomicznie dla wszystkich, 2) nieodpowiednie do oznaczania zwierząt zbyt dużych, aby można je było umieścić w zwyczajowych fiolkach używanych dla małych muchówek, oraz 3) nieprzenośne do użytku w odległych warunkach polowych. Przestrzeganie powszechnej praktyki skutkowało ograniczoną reprezentacją w taksonomii i warunkach eksperymentalnych18,19,20.
Podczas gdy pełne krzywe wydajności termicznej mogą informować o rozmieszczeniu gatunków, historii życia, cechach i zachowaniu, między innymi, kwantyfikacja mniejszej liczby i prostszych wskaźników termicznych może być bardziej efektywna i nadal niezwykle pouczająca. Testy fizjologiczne, mierzące początek śpiączki chłodowej i późniejszą regenerację po szoku zimnym, hartowanie na zimno i korygowanie zachowań, są skutecznymi i wykonywalnymi wskaźnikami zastępczymi dla krytycznego minimum termicznego organizmu8. Opisany tutaj jest test szoku zimnego przydatny do uzyskiwania danych fizjologicznych od dużych lądowych owadów ektotermicznych. Test jest niedrogi, dostępny i łatwy do wykonania w warunkach terenowych lub w klasie. Dane dotyczące regeneracji po szoku zimna generowane przez ten protokół mogą być łączone z danymi dotyczącymi cech na poziomie gatunku lub poszczególnych osób w celu uzyskania odpowiedzi na pytania dotyczące fizjologii ekologicznej i/lub wykorzystania do nauczania uczniów o zasadach fizjologicznych.

<table><tbody><tr><td>24 x 24 x 36 "Popup Hodowla i Klatka obserwacyjna</td><td>Bioquip</td><td>1466PB</td><td>Upewnij się, że klatka jest lekko uniesiona nad ziemią, aby móc stukać o podłogę klatki podczas eksperymentów.</td></tr><tr><td>Chłodnica</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Koperty pergaminowe</td><td>Bioquip</td><td>1130B</td><td></td></tr><tr><td>HOBO Wisiorek Temperatura/Światło 8K Rejestrator danych</td><td>Początek</td><td>UA-002-08</td><td>Jeśli rejestrator danych nie jest dostępny, badacze mogą zdecydować się na użycie termometru cyfrowego do rejestrowania temperatury otoczenia w regularnych odstępach czasu. Aby uzyskać dodatkowe informacje, zobacz krok 4.5 protokołu.</td></tr><tr><td>Stacja bazowa HOBO Optic USB</td><td>Onset</td><td>Base-U-1</td><td></td></tr><tr><td>Lodowata woda</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Owady (taksony ogniskowe)</td><td>NA</td><td>Dowolna</td><td>Zbierz wystarczającą ilość próbek do testów, zapewniając replikację grup eksperymentalnych (np. Gatunki, miejsce pobierania próbek)</td></tr><tr><td>Złącze T z PVC</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna</td><td></td></tr><tr><td>zamykana plastikowa torba</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stoper/minutnik</td><td>Dowolna</td> waga <td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td>Duże monety lub małe kamienie do obciążania plastikowych toreb zapewnią, że próbki zostaną zanurzone w lodowatej wodzie. Idealna jest znormalizowana waga.</td></tr></tbody></table>

test fizjologii termicznej w terenie: odzyskiwanie po szoku zimna w warunkach otoczenia

Field-Based Thermal Physiology Assay: Cold Shock Recovery under Ambient Conditions

Fizjologia ekologiczna, szczególnie ektotermów, jest coraz ważniejsza w tym zmieniającym się świecie, ponieważ wykorzystuje pomiary cech gatunków i środowiska do badania interakcji między organizmami a ich otoczeniem, aby lepiej zrozumieć ich przetrwanie i przystosowanie. Tradycyjne testy termiczne są kosztowne pod względem czasu, pieniędzy i sprzętu, dlatego często ograniczają się do małych rozmiarów próbek i niewielu gatunków. Przedstawiono nowatorski protokół, który generuje szczegółowe dane na temat indywidualnego zachowania i fizjologii dużych, wolantowych, lądowych owadów, na przykładzie motyli. W artykule opisano metody testu odzyskiwania po szoku zimnym, który można przeprowadzić w terenie w warunkach otoczenia i nie wymaga kosztownego sprzętu laboratoryjnego. Metoda ta została wykorzystana do zrozumienia strategii reakcji i regeneracji na szok termiczny motyli tropikalnych, generując dane na poziomie indywidualnym dla całych społeczności motyli. Metody te mogą być stosowane zarówno w odległych warunkach terenowych, jak i w salach lekcyjnych, a także mogą być wykorzystywane do generowania istotnych ekologicznie danych fizjologicznych oraz jako narzędzie dydaktyczne.

Dane zgromadzone w tym protokole pozwalają na badanie i partycjonowanie zmiennych istotnych dla fizjologii organizmów. Na przykład zarówno temperatura, jak i warunki oświetlenia wpływają na regenerację motyli po szoku termicznym (Rycina 1). Wykres ma na celu zbadanie interakcji między warunkami otoczenia a regeneracją po szoku termicznym. Przy użyciu motyli schwytanych w naturze za pomocą pułapek i siatek, 181 gatunków motyli wykazało wyraźną regenerację z letargu wywołanego szokiem termicznym (Rycina 2). Dane przedstawione na Rycynie 2 zostały zebrane przez trzech obserwatorów w ciągu około pięciu miesięcy (styczeń, luty, maj-lipiec 2020 r.) w Andach kolumbijskich. Eksperymenty zawsze przeprowadzano rano, dzień po odłowieniu motyli. Przy maksymalnej wydajności dwóch obserwatorów mogło jednocześnie monitorować po cztery motyle, powtarzając proces siedmiokrotnie (minimum 7,37 godziny), co pozwalało na przetestowanie 56 osobników w ciągu jednego poranka. Umożliwiło to zgromadzenie znacznej ilości danych z całych społeczności motyli, przy jednoczesnym uwzględnieniu i analizie danych dotyczących zmienności osobniczej. Ponieważ testy mogą być przeprowadzane w naturalnych warunkach środowiskowych, warunki regeneracji są reprezentatywne dla ich siedlisk i odzwierciedlają naturalną zmienność, jakiej organizmy doświadczają w naturze. Rycina 3 ilustruje nakładanie się temperatury i warunków oświetlenia w eksperymencie regeneracji po szoku termicznym z warunkami panującymi na pastwisku, z którego pobrano niektóre badane motyle.
<img alt="Wykres punktowy, opóźnienie lotu motyli w zależności od temperatury (°C) i natężenia światła (LUX), porównanie gatunków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62218/62218fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wykresy punktowe czasu regeneracji (w sekundach) motyli po szoku termicznym (zimnowym). (A) Średnia temperatura i (B) średnie LUX (natężenie światła) podczas regeneracji. Gatunki zostały pogrupowane i oznaczone kolorami według rodzin. Ogólnie, wraz ze wzrostem natężenia światła i temperatury, czas regeneracji po szoku termicznym ulega skróceniu, wykazując zmienność pomiędzy taksonami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zmienność czasu lotu w rodzinach motyli; kolorowy wykres danych porównujący sekundy do momentu lotu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62218/62218fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład wyników testu regeneracji po szoku termicznym u 181 gatunków motyli z Kolumbijskich Andów. Dane przedstawiają liczbę sekund, które upłynęły od wyjęcia motyla z zimna do momentu, w którym był on w stanie polecieć. Gatunki są uporządkowane i wyróżnione kolorami według Rodziny. Rycina ta obrazuje szeroki zakres taksonomiczny, w którym można z powodzeniem zastosować ten eksperyment, oraz różnorodność reakcji na regenerację po szoku termicznym u poszczególnych gatunków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres temperatury otoczenia; dane czerwone i niebieskie; przebieg czasowy; analiza warunków na pastwisku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62218/62218fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Temperatura otoczenia i LUX podczas prób regeneracji po szoku termicznym. Wykres temperatury otoczenia (kolor niebieski) i LUX (natężenie światła, kolor czerwony) zarejestrowane przez rejestratory danych umieszczone na pastwiskach, gdzie odbywał się odłów motyli (jasne kolory, warunki obejmują cały dzień) oraz warunki podczas prób regeneracji po szoku termicznym (ciemne kolory, tylko godziny poranne). Przedstawione warunki polowe i eksperymentalne ukazują zakres oraz średnie warunki, w jakich znajdowały się motyle podczas jednego tygodnia poboru prób i eksperymentów w terenie. Eksperymenty prowadzono wyłącznie we wczesnych godzinach (07:00-13:00 h), podczas gdy rejestratory danych były rozmieszczone w terenie przez tydzień (pokazano godziny świetlne, 06:00-18:00 h). Przedstawiono tutaj pokrywanie się warunków eksperymentalnych z warunkami otoczenia, w których przebywały motyle, co potwierdza ekologiczną relewantność przeprowadzania testów fizjologicznych w warunkach naturalnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Dodatkowa Rycina 1: Procedura odłowu owadów docelowych-w tym przypadku motyli-przy użyciu pułapek Van-Somerena z przynętą oraz aktywnym odłowem siatką. Pułapki zwabiano przynętami z gnijcych ryb oraz gnijących owoców. W tle widoczna pułapka (bez przynęty), na pierwszym planie okaz w unikalnej kopercie na tle niebieskiego plastikowego pudełka kolekcjonerskiego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/Jove%20supplement%20fig%201.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Torebki z maksymalnie czterema pojedynczymi motylami zanurzonymi w lodowej wodzie w lodówce. Torebki plastikowe zostały oznakowane godziną umieszczenia ich w lodowej wodzie, aby eksperymenty z szokiem termicznym mogły być przeprowadzane etapowo w ciągu poranka. Torebki plastikowe powinny być szczelnie zamknięte, aby zapobiec zamoczeniu okazów; jednak w tym przypadku zalanie torebek i koperty nie miało mierzalnego wpływu na regenerację motyli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/jove%20supp%20fig%202.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 3: Dwaj obserwatorzy zbierają dane w terenie. Każda siatkowa klatka zawiera cztery unikalne motyle regenerujące się po szoku termicznym. Trójnik z polichlorku winylu w klatce mieści rejestrator danych, aby zapobiec bezpośredniej ekspozycji na słońce lub deszcz. Każdy obserwator posiada stoper, który został uruchomiony natychmiast po wypuszczeniu motyli do klatki. Klatki są uniesione na ławach, co pozwala obserwatorom na wstrząsanie podstawą klatki, aby zapewnić, by motyle zareagowały behawioralnie tak szybko, jak to fizjologicznie możliwe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/jove%20sup%20fig%203.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Przykładowy arkusz danych. Arkusz zawiera unikalny identyfikator każdego motyla przypisany w terenie oraz cechy charakterystyczne (nazwa gatunku, kluczowe kolory) w notatkach. Odnotowano również dominującą pozycję motyla (tj. która strona skrzydeł była wystawiona na słońce) podczas okresu rekonwalescencji, oznaczoną jako D (grzbietowa) lub V (brzuszna). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218_R1_Supp-table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Wideo uzupełniające 1: Stukanie w klatkę w celu przyspieszenia regeneracji po szoku termicznym. W miarę jak motyle dochodzą do siebie, obserwator delikatnie stuka w podstawę klatki, aby wywołać zachowania, gdy tylko motyle będą do tego zdolne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/IMG_1712.MOV" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Tutaj opisany jest tani, dostępny protokół do oceny regeneracji motyli po szoku zimna w warunkach otoczenia.

Test fizjologii termicznej w terenie: odzyskiwanie po szoku zimna w warunkach otoczenia

Ecological physiology, particularly of ectotherms, is increasingly important in this changing world as it uses measures of species and environmental ...

Protokół ten jest niezwykle tanią metodą zbierania danych na temat fizjologii organizmu, w przystępny i ustandaryzowany sposób. To narzędzie może być używane do badania fizjologii na kilku poziomach. Może być stosowany zarówno przez nieustraszonych biologów terenowych, jak i małe dzieci w wieku szkolnym.Główną zaletą tej techniki jest to, że opiera się na łatwo dostępnych materiałach i jest bardzo tania. Może być wykonywany niemal wszędzie i przez badaczy o różnej wiedzy specjalistycznej i celach. Metoda ta może zapewnić wgląd w procesy fizjologiczne, behawioralne i ekologiczne.Ponieważ kluczowe wskaźniki wywołujące reakcję fizjologiczną są ustandaryzowane, metoda ta może zwiększyć naszą zdolność do zrozumienia i porównania kluczowych cech w grupach osób, gatunków i społecznościach ekologicznych. Obchodzenie się z owadami bez ich uszkadzania wymaga praktyki, ale praktyka czyni mistrza. Zdefiniowanie parametrów eksperymentu, takich jak czas trzymania owadów w lodowatej wodzie, może zająć trochę czasu i wymaga eksperymentowania i zrozumienia taksonów ogniskowych.Procedurę zademonstrują mi Heather Rohrer i Matt Standridge, dwaj technicy z laboratorium Daniela. Zacznij od zidentyfikowania interesujących nas gatunków, pamiętając, że każda grupa będzie się różnić pod względem czasu potrzebnego do wywołania śpiączki chłodnej. Opierając się na organizmie i wykorzystaniu danych, wybierz różne punkty odcięcia dla eksperymentu, jeśli osobnik główny nie lata.Przeprowadź próbę wstępną na małej próbce, aby określić kluczowe parametry, takie jak czas potrzebny na lodzie, aby wywołać śpiączkę chłodną. Wybierz czas graniczny w oparciu o ekologię gatunku. Należy pamiętać, że po wielu minutach niezdolności do lotu niektóre owady są zabierane przez drapieżniki.Zbieraj owady odpowiednimi metodami, takimi jak pułapki z przynętą i sieci entomologiczne. Umieść każdą osobę w osobnej szklanej kopercie z unikalnym identyfikatorem i przechowuj zwierzęta w zacienionym, chłodnym miejscu, chronionym przed bezpośrednim słońcem, wiatrem i drapieżnikami. Zawsze wystawiaj zwierzę na eksperymentalne leczenie w ciągu 24 godzin od schwytania, aby w jak największym stopniu ustandaryzować ten czas między próbami.Napełnij lodówkę wodą i wystarczającą ilością lodu, aby utrzymać środowisko w wodzie w temperaturze zero stopni Celsjusza. Wybierz od jednej do czterech głównych osób do rundy eksperymentów, upewniając się, że każda osoba jest możliwa do zidentyfikowania. W przypadku korzystania z wielu gatunków należy używać tylko jednego z nich, aby uniknąć nieporozumień.Jeśli eksperyment nie jest związany z ubarwieniem skrzydeł, oznacz skrzydła unikalnymi identyfikatorami za pomocą cienkiego filcowego markera, aby odróżnić osobniki. Jeśli eksperymenty nie spełniają żadnego z powyższych kryteriów, przeprowadź eksperyment na jednej osobie na raz. Wypełnić wiersze arkusza danych informacjami o każdym badanym owadzie, w tym jego niepowtarzalnym identyfikatorem i użytecznym identyfikatorem, w uwagach.Umieść wszystkie ogniskowe osoby w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie z obciążnikiem i umieść torbę w lodowatej wodzie na 60 minut, aby wywołać śpiączkę chłodzącą. Użyj prostego termometru, aby ręcznie rejestrować temperaturę otoczenia w krótkich odstępach czasu. Jeśli to możliwe, możesz rejestrować warunki otoczenia za pomocą rejestratora danych.Najpierw podłącz rejestrator danych, przejdź do urządzenia, uruchom i wybierz podłączone urządzenie, klikając OK. Wprowadź nazwę badania, wybierz opcję Temperatura i Natężenie światła, a następnie wprowadź jednostki. Ustaw interwał rejestrowania na 10 sekund.Wprowadź datę i godzinę eksperymentu, a następnie wybierz opcję Opóźniony start, aby uruchomić rejestrator danych o wybranej godzinie. Upewnij się, że informacje z rejestratora danych, w tym pora dnia, są zsynchronizowane z eksperymentami, tak aby dane dotyczące warunków otoczenia można było później dopasować do każdego indywidualnego owada ogniskowego. Zdecyduj o parametrach eksperymentalnych, takich jak to, czy rekonwalescencja będzie miała miejsce w cieniu czy na słońcu, i zanotuj te zabiegi w karcie katalogowej.Umieść siatkową klatkę dla owadów w odpowiednim miejscu, tak aby temperatura i światło w klatce były jednorodne. Trzymaj podstawę klatki uniesioną, aby obserwator mógł ją dotknąć i umieść rejestrator danych na zewnątrz lub wewnątrz klatki, gdzie można go trzymać w spokoju. Wyjmij zwierzęta z kąpieli lodowatej po 60 minutach i natychmiast wyjmij owady z plastikowej torby, a następnie szybko wyjmij każdą osobę z koperty przy minimalnej obsłudze i uruchom stoper, gdy tylko zwierzęta znajdą się w siatkowej klatce.Stukaj ołówkiem w podstawę klatki często i wystarczająco mocno, aby poruszyć powracające do zdrowia owady bez wywoływania reakcji. Oznacz próbę jako zakończoną, gdy dana osoba odbędzie. Zakończ próbę i uznaj, że owad nie wyzdrowiał, jeśli nie poruszył się po 30 minutach.Usuń owady z klatki siatkowej i umieść osobniki z powrotem w oznaczonych kopertach pergaminowych. Uwolnić zwierzęta lub zatrzymać je w celu dalszego gromadzenia danych i przetworzyć dane zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Aby uzyskać dostęp do zarejestrowanych danych środowiskowych, podłącz rejestrator danych HOBO z powrotem do komputera.Przejdź do odczytu urządzenia, wybierz Zatrzymaj rejestrowanie i zapisz pliki w żądanym folderze jako pliki HOBO. Po wyświetleniu okna podręcznego potwierdź jednostki parametrów i wybierz opcję Kreśl, aby uzyskać wykres dla warunków eksperymentalnych. Aby wyeksportować tabelę danych, wybierz opcję Plik Eksportuj dane tabeli i wyeksportuj go jako plik CSV w celu zapisania w odpowiednim folderze.W tym protokole zbadano interakcję między warunkami otoczenia ważnymi dla fizjologii organizmu a regeneracją po szoku zimnym dla różnych gatunków motyli. Zaobserwowano, że wraz ze wzrostem średniej temperatury badania, czas regeneracji po szoku zimnym skracał się, wykazując zmienność między taksonami. Podobnie zaobserwowano odwrotną zależność między średnim natężeniem światła w próbie a czasem regeneracji po szoku zimna, co wskazuje, że zarówno temperatura, jak i warunki świetlne przyczyniają się do regeneracji motyli.181 dzikich gatunków motyli zebranych przez trzech obserwatorów w ciągu pięciu miesięcy wykazało wyraźną regenerację po śpiączce chłodnej wywołanej szokiem zimnym, podkreślając zakres taksonomiczny, w którym eksperyment ten może być z powodzeniem zastosowany. Wykreślono warunki otoczenia i warunki eksperymentalne, wykazując ekologiczne znaczenie przeprowadzania testów fizjologicznych w warunkach otoczenia. Wykonując ten protokół, należy zwrócić szczególną uwagę na wszystkie osoby w klatce siatkowej, ponieważ zmiany w zachowaniu mogą być subtelne i zachodzić szybko.Dane wygenerowane przez ten protokół rzucają światło na cechy ekofizjologiczne badanych organizmów. Wiele innych cech przyczynia się do fizjologii organizmu, takich jak rozmiar, kolor i filogeneza. Dane dotyczące dodatkowych cech pozwolą dokładniej wyjaśnić i kontekstualizować miary wychodzenia z szoku zimna, wzbogacając kontekst ekologiczny i historię życia tych informacji.Wykorzystałem tę metodę do scharakteryzowania ekofizjologii całych zbiorowisk motyli w kolumbijskich Andach. Ponieważ protokół jest dostępny, tani i wystarczająco prosty do wdrożenia w środowisku wiejskim, w krótkim czasie zebrano dane na temat setek osób.

field-based-thermal-physiology-assay-cold-shock-recovery-under

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dążymy do zdefiniowania immunologicznego sygnalizowania neuronalnego odpowiedzialnego za prekondycjonowanie zimnem, aby zidentyfikować nowe cele dla rozwoju terapii chroniących mózg przed wystąpieniem urazu. Przedstawiamy strategie dla takich badań, które wymagają systemów biologicznych, manipulacji eksperymentalnych oraz możliwości technicznych o wysokiej czułości i powtarzalności.

Strategie badania neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem

W tym protokole opisana jest metoda pomiaru ponownego fałdowania białek wewnątrzkomórkowych po szoku cieplnym. Metoda ta może być stosowana do badania fałd, takich jak molekularne białka opiekuńcze i ich kofaktory lub związki, które mogą wpływać na ich aktywność. Aktywność lucyferazy świetlika jest używana jako reporter do pomiaru aktywności ponownego fałdowania białka opiekuńczego.

Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Test Cold Plantar (CPA) mierzy reakcję na zimno w zakresie od 30 °C do 5 °C, a także może mierzyć adaptację do zimna. Protokół ten opisuje, jak używać CPA do pomiaru nadwrażliwości na zimno, analgezji i adaptacji u myszy.

Prosta i niedroga metoda określania wrażliwości na zimno i adaptacji u myszy

Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Tutaj przedstawiono standardowe protokoły do oceny indukcji reakcji na szok cieplny (HSR) u Caenorhabditis elegans za pomocą RT-qPCR na poziomie molekularnym, fluorescencyjnych reporterów na poziomie komórkowym i termoregeneracji na poziomie organizmu.

Znormalizowane metody pomiaru indukcji reakcji na szok cieplny u Caenorhabditis elegans

Limity termiczne mogą przewidywać środowisko, które organizmy tolerują, co jest cenną informacją w obliczu gwałtownych zmian klimatycznych. Opisano tutaj wysokoprzepustowe protokoły do oceny krytycznych minimów termicznych i czasu wykańczania ciepła u owadów. Oba protokoły maksymalizują przepustowość i minimalizują koszt testów.

Wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów

Różne efekty różnych stopni hipotermii na ochronę mięśnia sercowego nie zostały dokładnie ocenione. Celem niniejszego badania było ilościowe określenie poziomów śmierci komórek po różnych metodach leczenia hipotermii w modelu opartym na ludzkich kardiomiocytach, kładąc podwaliny pod przyszłe dogłębne badania molekularne.

Ocena in vitro ochrony mięśnia sercowego po wstępnym kondycjonowaniu hipotermicznym w modelu ludzkich miocytów serca

Protokół opisuje rozwój standardowego, powtarzalnego, przedklinicznego modelu wysiłkowego udaru cieplnego (EHS) u myszy wolnych od niekorzystnych bodźców zewnętrznych, takich jak porażenie prądem. Model stanowi platformę do badań mechanistycznych, prewencyjnych i terapeutycznych.

Przedkliniczny model wysiłkowego udaru cieplnego u myszy

Ta praca przedstawia metodę szybkiej ekstrakcji RNA i porównywania poziomów transkryptów do analizy ekspresji genów u niesporczaka Hypsibius exemplaris. Ta wysokoprzepustowa metoda, wykorzystująca fizyczną lizę, wymaga pojedynczego niesporczaka jako materiału wyjściowego i powoduje solidną produkcję cDNA do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR).

Ekstrakcja RNA z pojedynczego zwierzęcia w jednej probówce w celu porównania względnych poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR u niesporczaka Hypsibius exemplaris

Poznaj niskokosztową metodę badania odzyskiwania po szoku zimna u motyli w warunkach terenowych. Protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały i pozwala analizować odpowiedzi fizjologiczne w różnych warunkach środowiskowych.

Test fizjologii termicznej w terenie: odzyskiwanie po szoku zimna w warunkach otoczenia

Przeglądaj więcej filmów