Name: Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego przy użyciu bioreaktora 3D. Protokół ten umożliwia skalowalną produkcję egzosomów do zastosowań badawczych i terapeutycznych w leczeniu zapalenia stawów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81972116, nr 81972085, nr 81772394); Kluczowy Program Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (nr 2018B0303110003); Projekt współpracy międzynarodowej w Guangdong (nr 2021A0505030011); Projekty naukowo-technologiczne w Shenzhen (nr GJHZ20200731095606019, nie. JCYJ20170817172023838, nie. JCYJ20170306092215436, Nie. JCYJ20170413161649437); Chińska Fundacja Nauk Podoktoranckich (nr 2020M682907); Fundacja Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych i Stosowanych w Guangdong (nr 2021A1515010985); Projekt Medyczny Sanming w Shenzhen (SZSM201612079); Specjalne fundusze na budowę szpitali wysokiego szczebla w prowincji Guangdong.

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Człowieka Drugiego Szpitala Ludowego w Shenzhen. Schemat ideowy egzosomów wyizolowanych z hSF-MSCs w protokole in vitro pokazano na Rysunek 1.
1. Kultura i identyfikacja ludzi SF-MSCs
<ol>
	<li>Zbierz 20 ml SF za pomocą strzykawki i igły od pacjentów z kliniczną chorobą zwyrodnieniową stawów.
	<ol>
		<li>Zdezynfekować staw kolanowy pacjenta z chorobą zwyrodnieniową stawów. Nakłucie od ścięgna mięśnia czworogłowego uda na zewnątrz rzepki do jamy stawowej za pomocą igły 7#.</li>
		<li>Wyciągnij 10 ml płynu stawowego. Przykryj miejsce wkłucia patyczkiem do transfuzji i dociskaj przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odrzucić supernatant SF po odwirowaniu w stężeniu 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml soli fizjologicznej z 1x buforem fosforanowym (PBS), odwirować przy 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić PBS.</li>
	<li>Zawiesić osad z 10 ml ludzkiej pożywki hodowlanej MSC o gęstości komórek 5 x 104 komórek/ml (patrz Tabela Materiałów), a następnie umieścić zawiesinę w naczyniu o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .</li>
	<li>Po 48 godzinach usuń nieprzylegające komórki, zmieniając pożywkę i przemyj 1x PBS. Wymieniaj pożywkę co 3 dni przez 2 tygodnie.</li>
	<li>Zebrać supernatanty z kultur komórkowych.</li>
	<li>Identyfikacja SF-MSC za pomocą cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Roztrawić trzecią generację (P3) SF-MSC, odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zebrać osad komórek. 
		UWAGA: Przejście jest rozpoznawane jako subkultura komórek do innej płytki hodowlanej. Pierwotne komórki wyizolowane z SF i wysiane na szalkach są oznaczone jako przejście zero (P0). Przy około 75% konfluencji komórki są trawione i odłączane od naczyń, wysiewane na innych szalkach i oznaczane jako P1.</li>
		<li>Dodać 400 μl buforu blokującego (1% BSA w 1x PBS) do osadu komórkowego (5 x 104) i odstawić na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Wirować przy 1.000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 1 μl przeciwciała monoklonalnego fluorescencyjnego CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (stosunek rozcieńczenia 1:100) (patrz tabela materiałów) na probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 1x PBS i wyrzucić supernatant. Zebrać osad komórkowy i ponownie zawiesić w 100 μl 1x PBS.</li>
		<li>Wykryj na cytometrze przepływowym do 10 000 komórek za pomocą filtrów 525/50 i 585/40 w celu wykrycia fluoroforów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 3D hodowla komórkowa w bioreaktorze
<ol>
	<li>Przygotowanie mikronośnika
	<ol>
		<li>Spęcznić suche 0,75 g mikronośników (patrz Tabela Materiałów) i uwodnić w 1x Sul fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco (50 ml / g mikronośników) przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zdekantować supernatant i myć mikronośniki przez 5 minut w świeżym DPBS (50 ml/g mikronośników). Wyrzuć PBS i zastąp go świeżym 1x DPBS (50 ml/g mikronośników).</li>
		<li>Wysterylizować mikronośniki w autoklawie (121 °C, 15 min, 15 psi). Pozostawić wysterylizowane mikronośniki do osiadania, zdekantować supernatant.</li>
		<li>Krótko przepłukać mikronośniki w pożywce hodowlanej (50 ml/g mikronośników) w temperaturze pokojowej. Pozostawić mikronośniki do osiadania, odrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bioreaktor perfuzyjny
	<ol>
		<li>Wysterylizować bioreaktor w autoklawie (121 °C, 15 min, 15 psi).</li>
		<li>Policz liczbę SF-MSC i przydziel 2,5 x 107 SF-MSC i mikronośników do bioreaktora wypełnionego pożywką hodowlaną MSC klasy GMP (250 ml).</li>
		<li>Umieścić bioreaktor w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Obrócić bioreaktor z prędkością 15 obr./min. Zmieniaj pożywkę co 6 dni.</li>
		<li>Zebrać supernatanty i mikronośniki do hodowli komórkowej do dalszej analizy po hodowli przez 14 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Identyfikacja egzosomów i wykrywanie bezpieczeństwa
<ol>
	<li>Ultrawirowanie
	<ol>
		<li>Odwirować supernatant hodowli komórkowej w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant; wyrzucić resztki komórkowe.</li>
		<li>Odwirować supernatanty w stężeniu 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant; wyrzucić większe pęcherzyki (ciała apoptotyczne i niektóre większe mikropęcherzyki).</li>
		<li>Ponownie odwirować supernatant przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia większych pęcherzyków; zebrać granulki i ponownie zawiesić w 40 ml 1x PBS.</li>
		<li>Odwirować zawieszone granulki o sile 120 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki zawierające egzosomy w 500 μl 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) 
	UWAGA: W każdym cyklu do komory wstrzykiwano 500 μl próbki przy natężeniu przepływu 30 μl/min. Przeprowadzić analizę w temperaturze 24,4 °C-24,5 °C.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć świeżo wyizolowane próbki egzosomów sterylnym 1x PBS do 1 ml zawierającego 10 7-109 /ml cząstek i wstrzyknąć je do systemu analizy śledzenia nanocząstek (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Ręcznie ustaw system przechwytywania i analizy zgodnie z protokołem producenta. Wizualizuj cząstki poprzez rozpraszanie światła laserowego i uchwyć ich ruchy Browna na cyfrowym wideo.</li>
		<li>Analizuj nagrane taśmy wideo za pomocą oprogramowania (patrz tabela materiałów) w oparciu o śledzenie co najmniej 200 pojedynczych cząstek na serię.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transmisyjna mikroskopia elektronowa
	<ol>
		<li>Utrwal egzosomy w 4% paraformaldehydzie (na zimno 1x DPBS) na 5 min.</li>
		<li>Zamontuj 5 μl egzosomów na miedzianych siatkach. W tym eksperymencie stężenie egzosomów wynosi 1 mg/ml oznaczone ilościowo za pomocą zestawu do oznaczania białek (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Osadź egzosomy w 3% kwasie fosfowolframowym na 10 minut na lodzie. Usunąć nadmiar kwasu i wysuszyć próbki w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zobrazuj próbki egzosomów za pomocą TEM przy napięciu przyspieszenia 100 kV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western blotting (zachodnia plama)
	<ol>
		<li>Do egzosomów dodać 300 μl buforu do lizy (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) i koktajlu inhibitorów proteazy (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wymieszaj egzosomy w buforze do lizy, pipetując w górę i w dół, i odstaw na lód na 20 minut.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 9,391 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać sklarowany nad osadem. Zmierzyć stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Dodaj 100 μL 4x buforu ładującego białko i podgrzewaj w temperaturze 100 °C przez 10 min.</li>
		<li>Załadować 15 μl białek o stężeniu 10 mg/ml i przeprowadzić przez elektroforezę żelową (120 V, 70 min) i elektroblot przy 100 V, 60 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wykryj markery niespecyficzne dla egzosomów (kalneksyna) i biomarkery egzosomalne (CD9, CD63 i CD81) za pomocą fluorescencyjnego western blot (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test bezpieczeństwa
	<ol>
		<li>W przypadku wykrywania bakterii, grzybów i Mycobacterium tuberculosis należy postępować zgodnie z krokami 3.5.2-3.5.5.</li>
		<li>Pobrać 100 μl roztworu egzosomu (1 mg/ml) na płytkę do hodowli agaru z krwią (patrz tabela materiałów) i inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Wysiewać 100 μl roztworu egzosomu (1 mg/ml) na pożywce sabourauda (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 35 °C przez 48 godzin.</li>
		<li>Wysiewać 100 μl roztworu egzosomu (1 mg/ml) na pożywce Lowensteina-Jensena (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 tygodnie.</li>
		<li>Wykrywanie pojawiania się bakterii, grzybów i kolonii Mycobacterium tuberculosis za pomocą obserwacji makroskopowej. 
		UWAGA: Kryteriami oceny bezpieczeństwa egzosomów jest brak mikroorganizmów na płytce hodowlanej.</li>
		<li>Aby wykryć mykoplazmę, wykonaj kroki 3.5.7-3.5.9.</li>
		<li>Zawiesić egzosomy w 50 μl roztworu buforowego dołączonego do zestawu i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 3 minuty.</li>
		<li>Amplifikować Mykoplazmę w roztworze egzosomu za pomocą zestawu do wykrywania Mykoplazmy PCR (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Wykryj produkty PCR na 1,5% elektroforezie w żelu agarozowym (30 min, 120 V).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wykrywanie funkcji egzosomów in vitro
<ol>
	<li>Znakowanie egzosomów
	<ol>
		<li>Oznaczyć 100 μl egzosomów (1 mg/ml) za pomocą 1 mM Dil (1000x) (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Odzyskaj egzosomy przez ultrawirowanie przy 100 000 x g przez 70 min. Ponownie zawiesić osad w 500 μl 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie naśladowców Cy3-miR-140 do egzosomów
	<ol>
		<li>Zmieszać 1 μg/μL białka egzosomalnego i 5 μmol/ml Cy3-miR-140 w końcowej objętości 400 μL buforu do elektroporacji (1,15 mM fosforanu potasu (pH 7,2), 25 mM chlorku potasu i 21% (v/v) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przenieść mieszaninę do zimnych kuwet do elektroporacji o średnicy 0,4 cm i nasycić elektroporacją przy pojemności 300 V/100 μF za pomocą systemu transfekcji genów (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Bezpośrednio po elektroporacji utrzymuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby upewnić się, że membrana egzosomu została w pełni przywrócona.</li>
		<li>Mieszaniny należy traktować jedną jednostką RNazy A (patrz tabela materiałów) przez 20 minut, aby wyeliminować mimiki miRNA poza egzosomami.</li>
		<li>Ultraodwirować mieszaninę egzosomów przy 120 000 x g przez 90 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić egzosomy w 500 μl 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test wychwytu egzosomów
	<ol>
		<li>Wysiewaj chondrocyty (1 x 107) w 35-milimetrowych szalkach konfokalnych z 1 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS.</li>
		<li>Po 24 godzinach traktuj chondrocyty egzosomami znakowanymi DiI (100 ng / ml) lub egzosomami załadowanymi cy3-miR-140 (100 ng / ml) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyć trzykrotnie 1x PBS, a następnie oznaczyć DAPI (10 ng / ml) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zarejestrować sygnał fluorescencji w konfokalnej laserowej skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej (CLSM) przy użyciu odpowiednich filtrów (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego. 
	UWAGA: Dane reprezentatywne na każdym rysunku zostały wyrażone jako średnia ± SD. Test t-Studenta został wykorzystany do porównania dwóch grup za pomocą oprogramowania statystycznego. Jednoczynnikową ANOVA, po której następuje wielokrotność Tukeya, przeprowadzono w przypadku porównań między wieloma grupami. Wartości P <0,05 (*), <0,01 (**) lub <0,001 ().</li>
</ol>

<ol><li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis%3A+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li>
<li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+a+disease+of+the+joint+as+an+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li>
<li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlike+bone%2C+cartilage+regeneration+remains+elusive%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li>
<li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li>
<li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine+and+Arthroscopy+Review%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li>
<li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li>
<li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee%3A+a+proof-of-concept+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li>
<li>Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis%3A+state+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li>
<li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329(2018).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li>
<li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li>
<li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236(2018).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Lv, F. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li>
<li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+%283D%29+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206(2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mezenchymalne komórki macierzyste są szeroko stosowane w medycynie regeneracyjnej ze względu na ich samoodnawianie, różnicowanie się w komórki tkankowe o wyspecjalizowanych funkcjach i działaniu parakrynnym16,17. Warto zauważyć, że efekty parakrynne wywierane przez egzosomy przyciągnęły wiele uwagi18. Egzosomy przenoszą bioinformację MSC i pełnią swoją funkcję biologiczną oraz eliminują niedociągnięcia MSC, takie jak kłopotliwe przechowywa...

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA), wynikająca z uszkodzenia chrząstki stawowej i leżącej pod nią kości, pozostaje poważnym wyzwaniem prowadzącym do niepełnosprawności1,2. Bez dopływu krwi i nerwów zdolność chrząstki do samoleczenia jest minimalna po zranieniu3,4. W ciągu ostatnich dziesięcioleci terapie oparte na autologicznej implantacji chondrocytów (ACI) poczyniły pewne postępy w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów5. W celu izolacji i ekspansji chondrocytów konieczne jest pobranie małej chrząstki z obszaru nienośnego stawu zwyrodnieniowego stawów, co powoduje uszkodzenia chrząstki. Ponadto procedura będzie wymagała drugiej operacji w celu wszczepienia rozszerzonych chondrocytów6. W związku z tym jednoetapowe terapie leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów bez uszkodzeń chrząstki są szeroko badane.
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostały zasugerowane jako obiecujące alternatywy dla leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów7,8. Pochodzące z wielu tkanek MSCs mogą różnicować się w chondrocyty przy określonej stymulacji. Co ważne, MSCs mogą modulować odpowiedzi immunologiczne poprzez anti-inflammation9. W związku z tym MSCs mają znaczące zalety w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez naprawę ubytków chrząstki i modulację odpowiedzi immunologicznej, zwłaszcza w środowisku zapalnym. W leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów MSCs z mazi stawowej (SF-MSC) przyciągnęły ostatnio wiele uwagi ze względu na ich silniejszą zdolność różnicowania chondrocytów niż inne źródła MSC10,11. Warto zauważyć, że w klinice ortopedycznej ekstrakcja zapalnego SF z jamy stawowej jest rutynową terapią mającą na celu złagodzenie objawów bólowych u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Wyekstrahowany zapalny SF jest zwykle utylizowany jako odpad medyczny. Zarówno pacjenci, jak i lekarze są gotowi uznać autologiczne MSCs wyizolowane z zapalnej SF za leczenie choroby zwyrodnieniowej stawów przy bardzo niewielu konfliktach etycznych. Jednak terapia SF-MSC jest zagrożona ze względu na ryzyko rakotwórcze, długotrwałe przechowywanie i odległe bariery transportowe.
Egzosomy, wydzielane przez wiele typów komórek, w tym MSC, przenoszą większość informacji biologicznej komórki macierzystej. Został dogłębnie zbadany jako terapia bezkomórkowa12,13. Zgodnie ze zaktualizowanymi zasobami dostępnymi na stronie internetowej rządu badań klinicznych (ClinicalTrials.gov), w dziedzinie raka, nadciśnienia tętniczego i chorób neurodegeneracyjnych inicjowane są i podejmowane bardziej rozległe badania kliniczne egzosomów. Leczenie egzosomami SF-MSC może być ekscytującym i wymagającym badaniem w walce z chorobą zwyrodnieniową stawów. Klasa dobrej praktyki wytwarzania (GMP) i produkcja egzosomów na dużą skalę są niezbędne do translacji klinicznej. Izolacja egzosomów na małą skalę jest szeroko stosowana w oparciu o dwuwymiarową (2D) hodowlę komórek. Jednak strategie produkcji egzosomów na dużą skalę wymagają optymalizacji. W ramach tego badania opracowano metodę produkcji egzosomów na dużą skalę, opartą na masowej hodowli SF-MSC w warunkach wolnych od ksenoizolacji. Po ultraodwirowaniu z supernatantów do hodowli komórkowych potwierdzono bezpieczeństwo i działanie egzosomów.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oznaczania BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Test stężenia białka</td></tr><tr><td>Płytka z agarem do krwi</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0903</td><td>Kultura bakterii</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD105</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1243C</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD34</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1143C</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD45</td><td>BD Bioscience</td><td>555483</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD63</td><td>Abclonal</td><td>&nbsp; A5271</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD73</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1242C</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>CD81 przeciwciało</td><td>ABklonalne</td><td>&nbsp; A5270</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>CD9 przeciwciało</td><td>Abclonal</td><td>&nbsp; A1703</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD90</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1167C</td><td>Wirówka do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td></td><td>Wirówka Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Hodowla Thermo</td><td></td><td>Cell</td></tr><tr><td>Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna ze skaningiem laserowym</td><td>ZEISS</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cytodex</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Microcarrier</td></tr><tr><td>Dil</td><td>ThermoFisher</td><td>D1556</td><td>Etykieta egzosomu</td></tr><tr><td>EZ-PCR Zestaw do wykrywania mykoplazmy</td><td>BI</td><td>20-700-20</td><td>Wykrywanie mykoplazmy</td></tr><tr><td>Cytometria</td><td>przepływowa Beckman</td><td></td><td>Identyfikacja MSC</td></tr><tr><td>System Gene Pulser II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1652660</td><td>Transfekcja genów</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.2</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>Wersja 8.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało HLA-DR</td><td></td><td>Elabscience E-AB-F1111C</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana Lowenstein-Jensen</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>T0573</td><td>Kultura prątków gruźlicy</td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500</td><td>Hodowla MSC</td></tr><tr><td>Nanosight NS300</td><td>Malvern</td><td>Nanosight NS300</td><td>Analiza śledzenia nanocząstek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie NTA 2.3</td><td>Malvern</td><td></td><td>Analiza danych</td></tr><tr><td>Odyssey FC</td><td>Gene Company Limited</td><td></td><td>Fluorescencyjny western blotting</td></tr><tr><td>OptiPrep bufor elektroporacyjny</td><td>Sigma</td><td>D3911</td><td>Transfekcja genów</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Inhibitor proteinazy</td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td>Usuwanie RNA</td></tr><tr><td>Sabouraud Płytka agarowa</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0919</td><td>Kultura grzybów</td></tr><tr><td>TEM</td><td></td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>Rotacyjny system hodowli komórkowych (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4HD</td><td>Ultrawirówka do hodowli 3D</td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>Wirówka egzosomowa</td></tr></tbody></table>

przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3d

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Egzosomy wydzielane przez mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostały zasugerowane jako obiecujący kandydaci do leczenia urazów chrząstek i choroby zwyrodnieniowej stawów. Egzosomy do zastosowań klinicznych wymagają produkcji na dużą skalę. W tym celu MSC ludzkiego płynu maziowego (hSF-MSC) wyhodowano na kulkach mikronośnika, a następnie wyhodowano w dynamicznym trójwymiarowym (3D) systemie hodowli. Dzięki wykorzystaniu dynamicznej hodowli 3D, w ramach tego protokołu udało się uzyskać egzosomy na dużą skalę z supernatantów hodowli SF-MSC. Egzosomy zebrano przez ultrawirowanie i zweryfikowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, testu transmisji nanocząstek i western blot. Wykryto również bezpieczeństwo mikrobiologiczne egzosomów. Wyniki wykrywania egzosomów sugerują, że takie podejście może doprowadzić do powstania dużej liczby egzosomów klasy zgodnej z dobrymi praktykami produkcyjnymi (GMP). Te egzosomy mogą być wykorzystywane w badaniach nad biologią egzosomów i klinicznym leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów.

Do identyfikacji markerów powierzchniowych SF-MSCs wykorzystano cytometrię przepływową, zgodnie z minimalnymi kryteriami definiowania ludzkich MSCs zalecanymi przez International Society for Cellular Therapy14,15. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że SF-MSCs hodowane w niniejszym badaniu spełniały kryteria identyfikacji MSCs. Wykazały one brak ekspresji CD34, CD45 oraz HLA-DR (poniżej 3%) i obecność CD73, CD90 oraz CD105 (powyżej 95%) (<strong class="xfig...

Tutaj prezentujemy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą bioreaktora 3D.

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Przedstawiamy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego przy użyciu naszego bioreaktora 3D. Te egzosomy mogą być wykorzystywane w badaniach nad biologią egzosomów i klinicznym leczeniu zapalenia stawów. Procedurę zademonstruje dr Yujie Liang.Rozpocznij pobieranie ludzkich komórek mezenchymalnych lub MSC, odwirowując płyn maziowy w temperaturze 1500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami PBS. Odwirować zawieszone komórki w temperaturze 1 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić PBS przed ponownym zawieszeniem osadu z 10 mililitrami ludzkiej pożywki hodowlanej MSC o gęstości komórek pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr, a następnie umieścić zawiesinę w 100-milimetrowym naczyniu.Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla. Po dwóch tygodniach należy pobrać supernatant z hodowli komórkowej w celu identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego lub SF-MSC za pomocą cytometrii przepływowej. W tym celu należy przetrawić pasaż trzeci trzeciej generacji SF-MSC przez odwirowanie w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie wyrzuć supernatant przed zebraniem osadu komórkowego. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu blokującego do osadu komórkowego o stężeniu pięć razy 10 do czwartego i pozostaw osad na 15 minut w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach odwirować zawiesinę komórkową zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie ponownie zawiesić oddzielony osad w 100 mikrolitrach 1X PBS.Dodać jeden mikrolitr monoklonalnego przeciwciała fluorescencyjnego w stosunku rozcieńczenia 1:100 na probówkę, jak opisano w manuskrypcie, i umieścić probówkę do inkubacji w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 1X PBS i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach 1X PBS. Następnie wykryj fluorofory w maksymalnie 10 000 komórek na cytometrze przepływowym za pomocą kanałów czerwonych i FITC.Aby przygotować mikronośniki, spęcznieć i uwodnić 0,75 grama mikronośników w 1X DPBS w stężeniu 50 miligramów na gram przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie zdekantować supernatant w celu przemycia mikronośników w świeżym DPBS przez pięć minut. Po zastąpieniu pożywki świeżym 1X DPBS w ilości 50 miligramów mikronośników na gram, sterylizuj mikronośniki przez autoklawowanie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut w temperaturze 15 funtów na cal kwadratowy.Następnie pozwól wysterylizowanym mikronośnikom osiąść przed dekantacją supernatantu. Przepłukać mikronośniki w pożywce hodowlanej w stężeniu 50 miligramów mikronośników na gram w temperaturze pokojowej. Gdy mikronośniki się osadzą, należy wyrzucić supernatant.Aby przygotować bioreaktor perfuzyjny, wysterylizuj bioreaktor przez autoklawowanie, jak opisano wcześniej. Po zakończeniu policz liczbę SF-MSC, aby przydzielić 2,5 razy 10 do siódmych SF-MSC i mikronośników do bioreaktora wypełnionego 250 mililitrami pożywki hodowlanej MSC klasy GMP. Umieść bioreaktor w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 15 obrotów na minutę.Zmieniaj pożywkę hodowlaną co sześć dni. Po 14 dniach należy zebrać supernatanty i mikronośniki z kultur komórkowych do dalszej analizy. Odwirować supernatant hodowli komórkowej w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant, odrzucając resztki komórkowe.W temperaturze czterech stopni Celsjusza kolejno odwirować supernatant w temperaturze 2 000 razy G przez 10 minut, a następnie w temperaturze 10 000 razy G przez 30 minut, aby odrzucić większe pęcherzyki i zebrać osad. Po ponownym zawieszeniu osadu w 40 mililitrach PBS, odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 120 000 razy G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś zebrany osad zawierający egzosomy w 500 mikrolitrach PBS.Rozcieńczyć świeżo wyizolowane próbki egzosomów sterylnym PBS do stężenia od 10 do siódmego do 10 do dziewiątych cząstek na mililitr i wstrzyknąć 500 mikrolitrów próbki za każdym razem do analizy śledzenia nanocząstek lub systemu NTA, przy 30 mikrolitrach na minutę i 24,4 do 24,5 stopni Celsjusza. Ręcznie ustaw system przechwytywania i analizy zgodnie z protokołem producenta. Wizualizuj cząstki poprzez rozpraszanie światła laserowego i uchwyć ich ruchy Browna na cyfrowym wideo.Następnie przeanalizuj nagrane taśmy wideo za pomocą oprogramowania, śledząc co najmniej 200 pojedynczych cząstek na bieg. W przypadku Western blotting dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy i koktajlu inhibitorów proteazy do egzosomów z mieszaniem przez pipetowanie w górę iw dół. Następnie odstaw na lód na 20 minut.Po odwirowaniu mieszaniny w temperaturze 9 391 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zmierzyć stężenie białka w supernatancie za pomocą zestawu do oznaczania białek. Po wykonaniu testu podgrzej próbkę ze 100 mikrolitrami buforu ładującego białko 4X w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie załaduj 15 mikrolitrów białek o stężeniu 10 miligramów na mililitr, aby uruchomić elektroforezę żelową przy napięciu 120 woltów przez 70 minut i elektrobibułę przy napięciu 100 woltów przez 60 minut w czterech stopniach Celsjusza.Wykryj markery niespecyficzne dla egzosomów, takie jak kalneksyna i biomarkery egzosomalne, takie jak CD9, CD63 i CD81, za pomocą fluorescencyjnego Western blot. W badaniu zastosowano cytometrię przepływową do identyfikacji markerów powierzchniowych SF-MSC. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że hodowane SF-MSC były ujemne dla CD34, CD45 i HLA-DR oraz dodatnie dla CD73, CD90 i CD105, spełniając kryteria identyfikacji MSC.Pod mikroskopią odwróconą zauważono, że SF-MSC namnażają się na mikronośnikach. SF-MSC namnażał się w hodowli 3D szybciej od sześciu dni w porównaniu z hodowlą 2D. Egzosomy z SF-MSC hodowli 2D i 3D zidentyfikowano za pomocą Western blotting i stwierdzono, że egzosomy wyrażają CD63, CD9 i CD81, podczas gdy są ujemne dla kalneksyny.Analiza nanocytów wykazała, że średnica egzosomów 2D i 3D wynosiła około 120 nanometrów. Analiza transmisyjnego mikroskopu elektronowego ujawniła morfologię egzosomów 2D i 3D, pokazując z grubsza sferoidalne pęcherzyki. Za pomocą analizy NTA przeanalizowano stężenie cząstek o rozmiarach od 30 do 160 nanometrów.Po hodowli 3D stężenie cząstek wynosiło 4,0 razy 10 do sześciu na mililitr. Jednak po hodowli 2D stężenie cząstek tej samej wielkości wynosiło 2,5 razy 10 do sześciu na mililitr. Co więcej, kultura 3D wytworzyła więcej białka egzosomu niż hodowla 2D.Reprezentatywna analiza pokazuje internalizację egzosomów znakowanych Dil przez pierwotne chondrocyty. Egzosomy znakowane dil, które weszły do pierwotnych chondrocytów, można zaobserwować ze szczytem po trzech godzinach. Badanie dostarczania in vitro wykazało, że egzosomy mogą dostarczać mikroRNA-140 znakowane sulfocyjaniną3 do chondrocytów.Posiewanie komórek, rozpoczęcie reakcji w bioreaktorze i supernatant są najważniejszymi etapami w tej protocol. 3D hodowla jest powszechnie stosowana do hodowli przylegających komórek na dużą skalę. Inne metody, takie jak spin flex, mogą być również stosowane do produkcji egzosomów na dużą skalę.Nasza metoda poprawia wydajność egzosomów, umożliwiając w ten sposób przedkliniczne zastosowanie egzosomów MSC.

large-scale-preparation-synovial-fluid-mesenchymal-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego. Płyn stawowy odzwierciedla najbardziej naturalne mikrośrodowisko dla chrząstki stawowej, a jego pozyskanie i przechowywanie są łatwe. System ten może zatem być wykorzystywany do badania regeneracji chrząstki oraz do przesiewu terapeutyków stosowanych w leczeniu zapalenia stawów.

System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

Przedstawiono protokół ustanawiający mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wyizolowane z mazi stawowej i szpiku kostnego świnek miniaturowych i pobrane nieinwazyjnie za pomocą aspiracji strzykawki. Fenotypowanie komórkowe przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej po izolacji komórek oraz hodowli in vitro szpiku kostnego i płynów maziowych pochodzących z MSCs.

Izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych

Potencjał terapeutyczny mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) jest dobrze udokumentowany, jednak najlepsza metoda przygotowania komórek dla pacjentów pozostaje kontrowersyjna. W tym artykule przekazujemy protokoły umożliwiające efektywne generowanie i podawanie terapeutycznych agregatów sferycznych lub "sferoid" MSCs przygotowanych w warunkach wolnych od ksenotypów do zastosowań eksperymentalnych i klinicznych.

Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Ten artykuł przedstawia prosty i ekonomiczny protokół prostej izolacji i oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii.

Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika

Egzosom to nowa generacja nośników leków. Opracowaliśmy protokół izolacji egzosomów o wysokiej wydajności i czystości dostarczania siRNA. Otorbiliśmy również znakowane fluorescencyjnie niespecyficzne siRNA do egzosomów i zbadaliśmy wychwyt komórkowy egzosomów obciążonych siRNA w komórkach nowotworowych.

Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek nowotworowych

Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

To badanie przedstawia protokół wytwarzania rusztowań drukowanych biologicznie w 3D do przewlekłego gojenia ran. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są izolowane z mezenchymalnych komórek macierzystych i ładowane do rdzenia (alginianu) za pomocą osłonki wykonanej z karboksymetylocelulozy i liazy alginianowej. Taka konstrukcja umożliwia kontrolowaną degradację rusztowania i wydajne uwalnianie pojazdów elektrycznych.

Optymalizacja dostarczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą rusztowania z biodrukowanym w 3D rdzeniem i osłonką do leczenia ran przewlekłych

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomowych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Tworzenie...

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Endotelialne komórki progenitorowe tworzące kolonie (ECFCs) stanowią obiecujące narzędzie do badania homeostazy i regeneracji naczyń krwionośnych.1,2 Niniejsza praca przedstawia nową metodę izolacji i ekspansji ECFC z heparynowanej krwi obwodowej dorosłego człowieka bez użycia surowicy zwierzęcej, z wykorzystaniem puli lizatu płytek krwi człowieka (pHPL), co zmniejsza ryzyko immunizacji przeciwko białkom bydlęcym.

Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

Poznaj metodę wytwarzania egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego przy użyciu bioreaktora 3D. Protokół ten umożliwia skalowalną produkcję egzosomów do zastosowań badawczych i terapeutycznych w leczeniu zapalenia stawów.

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

Przeglądaj więcej filmów