Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

Przedstawiamy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego przy użyciu naszego bioreaktora 3D. Te egzosomy mogą być wykorzystywane w badaniach nad biologią egzosomów i klinicznym leczeniu zapalenia stawów. Procedurę zademonstruje dr Yujie Liang.

Rozpocznij pobieranie ludzkich komórek mezenchymalnych lub MSC, odwirowując płyn maziowy w temperaturze 1500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami PBS. Odwirować zawieszone komórki w temperaturze 1 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić PBS przed ponownym zawieszeniem osadu z 10 mililitrami ludzkiej pożywki hodowlanej MSC o gęstości komórek pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr, a następnie umieścić zawiesinę w 100-milimetrowym naczyniu.

Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla. Po dwóch tygodniach należy pobrać supernatant z hodowli komórkowej w celu identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego lub SF-MSC za pomocą cytometrii przepływowej. W tym celu należy przetrawić pasaż trzeci trzeciej generacji SF-MSC przez odwirowanie w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć supernatant przed zebraniem osadu komórkowego. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu blokującego do osadu komórkowego o stężeniu pięć razy 10 do czwartego i pozostaw osad na 15 minut w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach odwirować zawiesinę komórkową zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie ponownie zawiesić oddzielony osad w 100 mikrolitrach 1X PBS.

Dodać jeden mikrolitr monoklonalnego przeciwciała fluorescencyjnego w stosunku rozcieńczenia 1:100 na probówkę, jak opisano w manuskrypcie, i umieścić probówkę do inkubacji w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 1X PBS i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach 1X PBS. Następnie wykryj fluorofory w maksymalnie 10 000 komórek na cytometrze przepływowym za pomocą kanałów czerwonych i FITC.

Aby przygotować mikronośniki, spęcznieć i uwodnić 0,75 grama mikronośników w 1X DPBS w stężeniu 50 miligramów na gram przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie zdekantować supernatant w celu przemycia mikronośników w świeżym DPBS przez pięć minut. Po zastąpieniu pożywki świeżym 1X DPBS w ilości 50 miligramów mikronośników na gram, sterylizuj mikronośniki przez autoklawowanie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut w temperaturze 15 funtów na cal kwadratowy.

Następnie pozwól wysterylizowanym mikronośnikom osiąść przed dekantacją supernatantu. Przepłukać mikronośniki w pożywce hodowlanej w stężeniu 50 miligramów mikronośników na gram w temperaturze pokojowej. Gdy mikronośniki się osadzą, należy wyrzucić supernatant.

Aby przygotować bioreaktor perfuzyjny, wysterylizuj bioreaktor przez autoklawowanie, jak opisano wcześniej. Po zakończeniu policz liczbę SF-MSC, aby przydzielić 2,5 razy 10 do siódmych SF-MSC i mikronośników do bioreaktora wypełnionego 250 mililitrami pożywki hodowlanej MSC klasy GMP. Umieść bioreaktor w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 15 obrotów na minutę.

Zmieniaj pożywkę hodowlaną co sześć dni. Po 14 dniach należy zebrać supernatanty i mikronośniki z kultur komórkowych do dalszej analizy. Odwirować supernatant hodowli komórkowej w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant, odrzucając resztki komórkowe.

W temperaturze czterech stopni Celsjusza kolejno odwirować supernatant w temperaturze 2 000 razy G przez 10 minut, a następnie w temperaturze 10 000 razy G przez 30 minut, aby odrzucić większe pęcherzyki i zebrać osad. Po ponownym zawieszeniu osadu w 40 mililitrach PBS, odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 120 000 razy G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś zebrany osad zawierający egzosomy w 500 mikrolitrach PBS.

Rozcieńczyć świeżo wyizolowane próbki egzosomów sterylnym PBS do stężenia od 10 do siódmego do 10 do dziewiątych cząstek na mililitr i wstrzyknąć 500 mikrolitrów próbki za każdym razem do analizy śledzenia nanocząstek lub systemu NTA, przy 30 mikrolitrach na minutę i 24,4 do 24,5 stopni Celsjusza. Ręcznie ustaw system przechwytywania i analizy zgodnie z protokołem producenta. Wizualizuj cząstki poprzez rozpraszanie światła laserowego i uchwyć ich ruchy Browna na cyfrowym wideo.

Następnie przeanalizuj nagrane taśmy wideo za pomocą oprogramowania, śledząc co najmniej 200 pojedynczych cząstek na bieg. W przypadku Western blotting dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy i koktajlu inhibitorów proteazy do egzosomów z mieszaniem przez pipetowanie w górę iw dół. Następnie odstaw na lód na 20 minut.

Po odwirowaniu mieszaniny w temperaturze 9 391 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zmierzyć stężenie białka w supernatancie za pomocą zestawu do oznaczania białek. Po wykonaniu testu podgrzej próbkę ze 100 mikrolitrami buforu ładującego białko 4X w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie załaduj 15 mikrolitrów białek o stężeniu 10 miligramów na mililitr, aby uruchomić elektroforezę żelową przy napięciu 120 woltów przez 70 minut i elektrobibułę przy napięciu 100 woltów przez 60 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Wykryj markery niespecyficzne dla egzosomów, takie jak kalneksyna i biomarkery egzosomalne, takie jak CD9, CD63 i CD81, za pomocą fluorescencyjnego Western blot. W badaniu zastosowano cytometrię przepływową do identyfikacji markerów powierzchniowych SF-MSC. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że hodowane SF-MSC były ujemne dla CD34, CD45 i HLA-DR oraz dodatnie dla CD73, CD90 i CD105, spełniając kryteria identyfikacji MSC.

Pod mikroskopią odwróconą zauważono, że SF-MSC namnażają się na mikronośnikach. SF-MSC namnażał się w hodowli 3D szybciej od sześciu dni w porównaniu z hodowlą 2D. Egzosomy z SF-MSC hodowli 2D i 3D zidentyfikowano za pomocą Western blotting i stwierdzono, że egzosomy wyrażają CD63, CD9 i CD81, podczas gdy są ujemne dla kalneksyny.

Analiza nanocytów wykazała, że średnica egzosomów 2D i 3D wynosiła około 120 nanometrów. Analiza transmisyjnego mikroskopu elektronowego ujawniła morfologię egzosomów 2D i 3D, pokazując z grubsza sferoidalne pęcherzyki. Za pomocą analizy NTA przeanalizowano stężenie cząstek o rozmiarach od 30 do 160 nanometrów.

Po hodowli 3D stężenie cząstek wynosiło 4,0 razy 10 do sześciu na mililitr. Jednak po hodowli 2D stężenie cząstek tej samej wielkości wynosiło 2,5 razy 10 do sześciu na mililitr. Co więcej, kultura 3D wytworzyła więcej białka egzosomu niż hodowla 2D.

Reprezentatywna analiza pokazuje internalizację egzosomów znakowanych Dil przez pierwotne chondrocyty. Egzosomy znakowane dil, które weszły do pierwotnych chondrocytów, można zaobserwować ze szczytem po trzech godzinach. Badanie dostarczania in vitro wykazało, że egzosomy mogą dostarczać mikroRNA-140 znakowane sulfocyjaniną3 do chondrocytów.

Posiewanie komórek, rozpoczęcie reakcji w bioreaktorze i supernatant są najważniejszymi etapami w tej protocol. 3D hodowla jest powszechnie stosowana do hodowli przylegających komórek na dużą skalę. Inne metody, takie jak spin flex, mogą być również stosowane do produkcji egzosomów na dużą skalę.

Nasza metoda poprawia wydajność egzosomów, umożliwiając w ten sposób przedkliniczne zastosowanie egzosomów MSC.